ICS11.220

CCSB41

37

山東省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB37/T4459—2021

鵝星狀病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范

Diagnostictechnicalspecificationforgooseastrovirusinfection

2021-12-27發(fā)布2022-01-27實施

山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB37/T4459—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。

本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。

I

DB37/T4459—2021

鵝星狀病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了鵝星狀病毒感染的臨床診斷和實驗室診斷的技術(shù)規(guī)范。其中臨床診斷包括流行病學(xué)、

臨床癥狀、病理變化；實驗室診斷包括樣品的采集與保存、病毒分離鑒定、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（RT-PCR）、實時熒光定量RT-PCR與間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。

本文件適用于鵝星狀病毒感染的診斷、檢測、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。鵝星狀病毒感染的流行病學(xué)、

臨床癥狀、病理變化適用于鵝星狀病毒的初步診斷；病毒分離、RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測方法

適用于鵝組織、分泌物、排泄物和病毒培養(yǎng)物中鵝星狀病毒分離鑒定及核酸檢測；間接ELISA抗體檢測

方法適用于鵝星狀病毒感染的抗體特異性血清學(xué)診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489—2008實驗室生物安全通用要求

GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫

NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

鵝星狀病毒感染gooseastrovirusinfection

由鵝星狀病毒引起的5日齡～25日齡雛鵝內(nèi)臟器官與關(guān)節(jié)發(fā)生嚴(yán)重尿酸鹽沉積的疾病。

4實驗室要求

4.1環(huán)境

4.1.1實驗室符合GB19489—2008和GB/T27401要求。

4.1.2從事RT-PCR工作的實驗室應(yīng)進行分區(qū)，根據(jù)條件劃分出前處理區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)、

電泳檢測區(qū)，形成有效的物理隔離，且為單一流向，不得倒流。特別注意電泳后的瓊脂凝膠要及時處理，

避免對實驗室造成污染。

4.1.3生物樣品應(yīng)嚴(yán)格控制避免對環(huán)境造成污染，試驗結(jié)束后應(yīng)將相關(guān)樣品（如血樣）進行無害化處

理。

4.2人員

1

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操作人員應(yīng)接受實驗室生物安全、實驗室質(zhì)量管理、血清學(xué)和分子生物學(xué)實驗室檢測技術(shù)培訓(xùn)。熟

悉臨床診斷、病理組織學(xué)診斷、生物樣品處理、病毒分離，以及核酸提取、基因擴增等分子生物學(xué)技術(shù)，

熟悉RT-PCR、qRT-PCR與間接ELISA檢測結(jié)果的判斷方法。

5樣品

5.1儀器設(shè)備

5.1.1生物安全柜。

5.1.2解剖剪。

5.1.3解剖盤。

5.1.4鑷子。

5.1.5組織勻漿器。

5.2試劑與材料

5.2.1磷酸鹽緩沖液（PBS），見A.1。

5.2.2青霉素（100000IU/mL）。

5.2.3鏈霉素（100mg/mL）。

5.2.4離心管。

5.2.5樣品保存管。

5.2.6濾器（孔徑0.22μm）。

5.3樣品采集與運送

5.3.1總則：樣品采集、保存、運輸應(yīng)按照NY/T541—2016技術(shù)規(guī)范進行。采樣和樣品前處理過程中

應(yīng)戴一次性手套、口罩、帽子，采樣過程中樣品不得交叉污染。

5.3.2組織樣品：采集疑似鵝星狀病毒感染死亡鵝的肝臟、脾臟和腎臟等組織樣品。采集病料時，用

無菌手術(shù)剪取組織樣品，置于樣品保存管中，密封、編號。

5.3.3泄殖腔/喉拭子樣品：活禽泄殖腔/喉拭子樣品，置于樣品保存管中。

5.3.4血清樣品：用無菌注射器采血1mL，將其注入1.5mL無菌eppendorf管中，于37℃靜置2h。

分離的血清轉(zhuǎn)入新的無菌eppendorf管中，加蓋，編號，待檢。采集的血清樣品應(yīng)無溶血，置于離心管

中。

5.3.5鵝胚尿囊液：將鵝胚尿囊液加入無菌eppendorf離心管中，加蓋，編號，待檢。

5.3.6所有樣品應(yīng)置于密閉容器中冷藏運輸，保存溫度在-15℃以下，時間不超過24h。

5.4樣品處理與保存

5.4.1樣品應(yīng)在生物安全柜中進行處理，取10g～20g樣品放入滅菌的研缽中磨碎。研磨充分的組織

置于含青霉素（2000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL）、慶大霉素（50μg/mL）和制霉菌素（1000IU/mL）

的pH值7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS，A.1）中，配制成10%～20%（g/mL）的懸液。樣品經(jīng)10

000r/min離心30min，取上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌后，作為接種和檢測材料。

5.4.2泄殖腔/咽喉拭子置于含青霉素（2000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL）、慶大霉素（50μg/mL）

和制霉菌素（1000IU/mL）的pH值7.0～7.4的PBS中。樣品劇烈震蕩后，10000r/min離心10min，

取上清作為檢測材料。

5.4.3鵝胚尿囊液在4℃下經(jīng)10000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入無菌eppendorf管中，加蓋，

編號，待檢。

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5.4.4所有樣品保存溫度在-15℃以下，不超過2wk；-70℃貯存不超過30d。

5.5檢測要求

在每次檢測過程中，需要設(shè)置相應(yīng)的陽性對照和陰性對照。

6臨床診斷

6.1流行病學(xué)

鵝群發(fā)病日齡集中于5日齡～20日齡，5日齡左右開始發(fā)病，死亡率逐漸升高，10日齡～15日齡為死

亡高峰，鵝群的死亡率為20%～30%，最高可達50%。

6.2臨床癥狀

患病雛鵝表現(xiàn)為精神沉郁、臥地倦動、采食減少、排白色稀便。

6.3剖檢變化與組織學(xué)變化

死亡雛鵝剖檢變化主要表現(xiàn)為內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)腔有大量尿酸鹽沉積，包括心臟、肝臟、腎臟及輸尿

管等，有的病例表現(xiàn)為腎臟出血腫大?；践Z組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞壞死、間質(zhì)出血，腎

小球腫脹，脾臟有大量紅細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞空泡變性、尿酸鹽沉積。

6.4臨床診斷結(jié)果判定

同時符合6.1、6.2、6.3，則判斷為疑似鵝星狀病毒感染。

7病毒分離鑒定

7.1病毒分離

7.1.1儀器設(shè)備與材料

7.1.1.1不同溫度的冰箱（2℃～8℃、-20℃、-70℃）。

7.1.1.237℃恒溫孵化箱。

7.1.1.34℃離心機。

7.1.1.4打孔器。

7.1.1.51mL注射器。

7.1.1.6石蠟。

7.1.1.7照蛋器。

7.1.1.813日齡鵝星狀病毒血清抗體陰性鵝胚。

7.1.2樣品接種和培養(yǎng)

7.1.2.1將處理后的樣品上清，經(jīng)絨毛尿囊腔途徑無菌接種13日齡鵝胚，0.2毫升/枚，37℃孵育，

連續(xù)觀察6d。

7.1.2.2棄去24h內(nèi)死亡鵝胚，24h～144h內(nèi)死亡和存活鵝胚置于4℃冰箱過夜或-20℃冷凍1h，

分別無菌收集尿囊液并進行無菌檢查，無菌尿囊液盲傳三代。

7.1.3病毒分離結(jié)果判定

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組織樣品處理液接種鵝胚后，當(dāng)胚體3d～5d內(nèi)出現(xiàn)死亡，且胚體尿囊膜增厚，死亡鵝胚全身皮膚

及胚體腹膜有點狀出血斑，肝臟、腎臟、肺臟均呈現(xiàn)點狀出血等變化，可判斷為鵝疑似星狀病毒感染。

7.2病原檢測

7.2.1RT-PCR反應(yīng)

7.2.1.1儀器設(shè)備

7.2.1.1.1生物安全柜。

7.2.1.1.2PCR基因擴增儀。

7.2.1.1.3臺式低溫高速離心機（最大轉(zhuǎn)速為15000r/min）。

7.2.1.1.4無RNA酶離心管（1.5mL）。

7.2.1.1.5PCR反應(yīng)管（0.2mL）。

7.2.1.1.6微量移液器（最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL）。

7.2.1.1.7無RNA酶帶濾芯槍頭。

7.2.1.1.8核酸電泳儀。

7.2.1.1.9核酸電泳槽。

7.2.1.1.10紫外凝膠成像儀。

7.2.1.1.11電子天平：精度為0.01g。

7.2.1.1.12電磁爐或微波爐。

7.2.1.2試劑與材料

7.2.1.2.1DEPC水。

7.2.1.2.2商品化RNA提取試劑盒。

7.2.1.2.3RT反應(yīng)試劑盒。

7.2.1.2.4PCR反應(yīng)試劑。

7.2.1.2.51.0%瓊脂糖凝膠，見A.2。

7.2.1.2.61×TAE緩沖液，見A.3。

7.2.1.2.7核酸染料。

7.2.1.2.8核酸電泳加樣緩沖液，見A.4。

7.2.1.2.9DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp～2000bp之間，有5條以上的指示條帶。

7.2.1.2.10陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，使用鵝星狀病毒SDPY株（CCTCCNO:V201808，見附錄C），或其他背

景清楚的鵝星狀病毒。

7.2.1.2.11陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品，為健康鵝正常組織或未感染鵝星狀病毒鵝胚尿囊液。

7.2.1.2.12RT-PCR檢測所需引物：

——上游引物F：5’-TGGTGGTGYTTYCTCAARA-3’；

——下游引物R：5’-GYCKGTCATCMCCRTARCA-3’，擴增片段長度為601bp，引物濃度為10μmol/L。

7.2.1.3試驗程序

7.2.1.3.1RNA提取

按RNA提取試劑盒說明書提取樣品和對照組的RNA。提取的RNA應(yīng)立即檢測，否則應(yīng)置于-70℃凍存。

7.2.1.3.2RT-PCR反應(yīng)

7.2.1.3.2.1反轉(zhuǎn)錄體系及程序

4

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RNaseInhibitor0.5μL，M-MLVbuffer2μL，RandomPrimers1.0μL，dNTPs（2.5mmol/L）

1μL，RNaseM-MLV0.5μL，RNA模板5μL，共計10μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為30℃10min，42℃60min，

70℃15min，4℃終止。

7.2.1.3.2.2PCR反應(yīng)體系及程序

在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制PCR反應(yīng)液，在樣品制備區(qū)進行加樣，反應(yīng)體系如下：10×PCRBuffer2.5μL，

dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物F（10μmol/L）和R（10μmol/L）各0.5μL，模板cDNA3μL，rTaq

DNA聚合酶0.25μL，加DEPC水至25μL。

瞬時離心，置于PCR基因擴增儀內(nèi)進行擴增，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30

s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

7.2.1.3.2.3瓊脂糖凝膠電泳

1.0%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后加5μL核酸

染料溶液，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。

待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。

加樣：取6μL～8μLPCR擴增產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳同時設(shè)標(biāo)

準(zhǔn)DNAMarker、陰性對照、陽性對照。

電泳：電壓80V～100V或電流40mA～50mA，電泳30min～40min。最后，由凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍

照記錄。

7.2.1.4結(jié)果判定

7.2.1.4.1試驗成立的條件

陽性對照出現(xiàn)601bp的擴增條帶，且陰性對照無擴增條帶時，判定試驗結(jié)果成立。

7.2.1.4.2試驗結(jié)果的判定

7.2.1.4.2.1在試驗成立的前提下，待檢樣品出現(xiàn)601bp的條帶，判定待檢樣品為鵝星狀病毒PCR陽

性，必要時，對擴增片段進行序列測定。

7.2.1.4.2.2在試驗成立的前提下，待檢樣品無條帶，則為鵝星狀病毒PCR陰性（見B.1）。

7.2.2實時熒光定量RT-PCR

7.2.2.1儀器設(shè)備

7.2.2.1.1生物安全柜。

7.2.2.1.2臺式低溫高速離心機（最大轉(zhuǎn)速為15000r/min）。

7.2.2.1.3無RNA酶的離心管（1.5mL）。

7.2.2.1.4無RNA酶的熒光定量PCR管。

7.2.2.1.5微量移液器（最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL）。

7.2.2.1.6無RNA酶帶濾芯的槍頭。

7.2.2.1.7熒光定量PCR儀。

7.2.2.2試劑與材料

7.2.2.2.1DEPC水。

7.2.2.2.2商品化RNA提取試劑盒。

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7.2.2.2.3一步法熒光定量RT-PCR試劑盒。

7.2.2.2.4陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，使用鵝星狀病毒SDPY株（CCTCCNO：V201808），或其他背景清楚的鵝星

狀病毒。

7.2.2.2.5陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品，為健康鵝正常組織或未感染鵝星狀病毒鵝胚尿囊液。

7.2.2.2.6熒光定量RT-PCR檢測所需引物及探針：

——上游引物F：5’-GGTGGGCTAATAACGGAACTCAG-3’；

——下游引物R：5’-GACCTATTTCCTTGCGGATCAC-3’；

——探針P：5’FAM-TCGGCTCAACATCGCTGATGGG-BHQ3’，擴增片段長度為89bp，引物濃度為10μ

mol/L。

7.2.2.3試驗程序

7.2.2.3.1RNA提取

RNA提取參照7.2.1.3.1。

7.2.2.3.2實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及程序

在實驗室潔凈區(qū)域，將試劑盒中預(yù)混液、引物和探針取出，置于冰上融化，將下列試劑一次加入到

無RNA酶的熒光定量PCR管中。反應(yīng)體系如下：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10μL，TakaraExTaq

HS0.4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4μL，引物F（10μmol/L）和引物R（10μmol/L）各

0.4μL，探針P（10μmol/L）0.8μL，模板RNA2μL，加ddH2O至20μL。反應(yīng)液混勻后置于

LightCycler?96熒光定量PCR儀按照以下程序進行擴增：42℃反轉(zhuǎn)錄5min，95℃10s；95℃變性5s，

60℃退火20s（收集信號），進行40個循環(huán)。

7.2.2.4結(jié)果判定

7.2.2.4.1試驗成立的條件

陽性對照出現(xiàn)S型擴增曲線，且陰性對照無擴增曲線時，判定檢測結(jié)果有效。

7.2.2.4.2試驗結(jié)果的判定

7.2.2.4.2.1Ct值≤30，且出現(xiàn)S型擴增曲線，表明樣品中存在鵝星狀病毒，判定為陽性。

7.2.2.4.2.2無Ct值，且無擴增曲線，或Ct值＞35，表明樣品中無鵝星狀病毒，判定為陰性。

7.2.2.4.2.330＜Ct值＜35的樣品，判定為可疑，需重新檢測（見B.2）。

8病毒抗體檢測（間接ELISA）

8.1儀器設(shè)備

8.1.1臺式高速離心機（最大轉(zhuǎn)速為15000rpm）。

8.1.2酶標(biāo)儀。

8.1.3微量移液器：最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL。

8.1.4聚苯乙烯板。

8.1.5水平振蕩器。

8.1.637℃培養(yǎng)箱。

8.2試劑與材料

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8.2.1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，見D.1。

8.2.2標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，見D.2。

8.2.3鵝星狀病毒抗原，見D.3。

8.2.4酶標(biāo)二抗：兔抗鵝辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，效價應(yīng)在1:32以上。

8.2.5包被液，見A.5。

8.2.6洗滌液，見A.6。

8.2.7樣品稀釋液（封閉液），見A.7。

8.2.8底物溶液，TMB底物顯色液。

8.2.9終止液（濃度為2M），見A.8。

8.3操作步驟

8.3.1將ORF2蛋白抗原按照濃度為6.5mg/mL用1×碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋2000倍，每孔100μ

L加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育過夜。孵育后洗滌液洗5次，甩干板上殘余液體。

8.3.2用樣品稀釋液將被檢血清樣品稀釋40倍，注意不要稀釋對照血清。確保每個樣品換一個吸頭，

做好樣品的標(biāo)記。稀釋的樣品血清充分混勻后，加入包被孔。

8.3.3每孔加入200μL封閉液，37℃溫箱孵育1h，用8.3.1方法洗板。

8.3.4在A1、A2孔各加100μL陰性血清對照，A3、A4孔各加100μL陽性血清對照。

8.3.5將100μL稀釋好的待檢血清加入其他各孔，混勻后，37℃孵育1h，用8.3.1方法洗板。

8.3.6酶標(biāo)二抗用樣品稀釋液按1:200倍稀釋，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用8.3.1方法洗板。

8.3.7每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光條件下孵育15min。

8.3.8每孔加入50μL終止液，輕輕振蕩，終止反應(yīng)。

8.3.9將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，于450nm測定各孔樣品的吸光值（OD）。

8.4結(jié)果判定

8.4.1試驗成立的條件

鵝星狀病毒間接ELISA檢測方法陰性對照OD均值=（ODA1+ODA2）/2；陽性對照OD均值=（ODA3+ODA4）

/2；陽性對照平均值減去陰性對照平均值，其差必須大于0.04；陰性對照平均值必須小于等于0.17，試

驗條件成立，否則重復(fù)測定。

8.4.2試驗結(jié)果的判定

8.4.2.1當(dāng)樣品OD450≥0.21時，樣品判定為鵝星狀病毒抗體陽性。

8.4.2.2當(dāng)樣品OD450≤0.17，樣品判定為鵝星狀病毒抗體陰性。

8.4.2.3當(dāng)樣品0.17＜OD450＜0.21，判為可疑，需重復(fù)測定。

9鵝星狀病毒感染綜合判定

根據(jù)第6章、第7章、第8章中的判定結(jié)果，可對鵝星狀病毒感染進行綜合判定。

9.1若患鵝與第6章中所描述相符，且第7章、第8章中結(jié)果均呈陽性，則可判定為鵝星狀病毒感染。

9.2若患鵝與第6章中所描述部分相符，但第7章、第8章中結(jié)果均呈陽性，則可判定為鵝星狀病毒

感染。

9.3若患鵝在第7章中的結(jié)果呈陽性，但在第8章中的結(jié)果呈陰性，也可判定為鵝星狀病毒感染。反

之則不成立。

7

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A

A

附錄A

（資料性）

相關(guān)試劑的配制（試劑要求分析純）

A.1磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/LpH7.4）

NaCl8.0g

KCl0.2g

KH2PO40.2g

Na2HPO4.12H2O0.2g

水加至1000mL

A.21.0%瓊脂糖凝膠的配制

瓊脂糖1.0g

0.5×TAE電泳緩沖液加至100mL

微波爐中完全融化，待冷至50℃～60℃時加入核酸染料，搖勻。倒入板上凝固后，取下梳子，備

用。

A.31×TAE電泳緩沖液的配制

A.3.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）

乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2.2H2O）18.61g

滅菌雙蒸水80.0mL

氫氧化鈉調(diào)pH至8.0

水加至100mL

用于配制A.3.2中的50×TAE電泳緩沖液。

A.3.2配制50×TAE電泳緩沖液

羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰醋酸57.1mL

0.5mol/L乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）100mL

滅菌超純水加至1000mL

用于配制A.3.3中的1×TAE電泳緩沖液。

A.3.3配制1×TAE電泳緩沖液

50×TAE電泳緩沖液20mL

水加至1000mL

A.4核酸電泳加樣緩沖液（10×）

聚蔗糖25g

滅菌雙蒸水100mL

溴酚藍0.1g

二甲苯青0.1g

A.5包被液（0.05mol/LpH9.6）

8

DB37/T4459—2021

Na2CO30.2756g

NaHCO30.6216g

水加至100mL

A.6洗滌液

PBS1000mL

Tween-200.5mL

A.7樣品稀釋液（封閉液）

脫脂奶粉5.0g

洗滌液100mL

A.8終止液（2M）

H2SO4（98%）58mL

水442mL

9

DB37/T4459—2021

B

B

附錄B

（資料性）

PCR及熒光定量PCR結(jié)果圖

B.1PCR產(chǎn)物大小對照

M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為陰性對照，2為陽性對照。

圖B.1PCR產(chǎn)物大小對照圖

B.2熒光定量PCR擴增曲線

1為陽性對照，2為陰性對照。

圖B.2熒光定量PCR擴增曲線

10

DB37/T4459—2021

C

C

附錄C

（資料性）

陽性對照病毒（SDPY）

C.1SDPY鵝星狀病毒的來源

SDPY鵝星狀病毒，是一種鵝源病毒，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)實驗室分離并鑒定，保藏于中國典型培

養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其保藏編號為CCTCCNO:V201808。該病毒可由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)實驗室提

5.0

供，由13日齡血清抗體陰性鵝胚接