[鍵入文字] 論文（設計）題目用Pi9和Pi5分子標記對水稻育種材料抗稻瘟病基因的鑒定用Pi9和Pi5分子標記對水稻育種材料抗稻瘟病基因的鑒定第一章稻瘟病抗性基因研究1.1稻瘟病水稻作為世界上最為主要的糧食，養(yǎng)活了全球大約二分之一的人口，接近73%的東亞人以稻米為主要餐食，水稻的種植和生產(chǎn)對于解決糧食的安全問題起到了舉足輕重的作用[1]。尤其是對我們國家而言，水稻作為中國的第一大糧食作物，全國有一半以上的農(nóng)民從事水稻的植株，將近有65％的人口以稻米為食。水稻對我國糧食安全、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定起著舉足輕重的作用，它的產(chǎn)量和質量直接關系到人民的生活質量和農(nóng)民的經(jīng)濟狀況[2]。因為細菌、真菌、病毒和線蟲等對水稻的危害，經(jīng)常造成水稻的產(chǎn)量的嚴重減少甚至造成絕收，稻米質量也受到影響。目前，在我國，稻瘟病、紋枯病和稻曲病并稱為水稻三大病害[3]。但是從發(fā)生面積的大小和造成的產(chǎn)量損失來看，稻瘟病已經(jīng)成為水稻最為嚴重的病害，可引起大幅度減產(chǎn)。我國每隔7～10年就發(fā)生一次較大的稻瘟病害，受害面積達到300萬～600萬公頃，稻谷損失為0.7百萬～1．25百萬噸，嚴重阻礙了我國水稻的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[4]。在國際方面，到目前為止已經(jīng)有大約八十多個國家報道過有稻瘟病的發(fā)生，其中以亞洲和非洲的發(fā)病最為頻繁和嚴重。全球每年由于稻瘟病所造成的產(chǎn)量損失達11%～30%，造成的直接經(jīng)濟損失大約有50億美元。如今，解決水稻的病害問題己經(jīng)成為全球水稻生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要研究課題，稻瘟病菌也被認為是十大具有科學和經(jīng)濟學研究價值的植物病原真菌之首[5]。1.1.1稻瘟病的種類稻瘟病在水稻各個生長時期都有可能發(fā)生，因此按照水稻稻瘟病發(fā)病的時期和發(fā)病的部位將稻瘟病主要分為以下幾種：苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、葉枕瘟、穗頸瘟和稻粒瘟，其中水稻的葉瘟發(fā)生最普遍，而穗頸瘟造成的危害最嚴重[6]。（1）苗瘟：是在水稻秧苗3～4葉期前發(fā)生稻瘟病，癥狀變形為秧苗上部的葉片枯黃，水稻的基部腐爛，葉片卷縮枯死。會在葉片表面形成明顯的褐色病斑，與葉瘟的癥狀大致相同，也稱苗葉瘟。（2）葉瘟：水稻的葉瘟在秧苗四葉期后到穗期都有可能會發(fā)生稻瘟病，受氣候條件和不同品種抗病性的影響，可以將葉瘟病斑分為以下的四種類型。一種是慢性型病斑，表現(xiàn)為首先在葉片上出現(xiàn)顏色暗綠的小斑塊，然后慢慢擴大為梭形狀的病斑，并且經(jīng)常伴隨有延伸的褐色壞死線出現(xiàn)。病斑的顏色表現(xiàn)為中央灰白，邊緣褐色，外圍有淡黃色的暈圈，葉片背面有灰色的霉層。病斑比較多的時就連成一片形成不規(guī)則的大斑，這種病斑的發(fā)展速度一般較慢。一種是急性型病斑，這種病斑在感病的品種上會形成顏色暗綠的接近于圓形或者橢圓形的病斑，葉片正反兩個面都會出現(xiàn)霉層，顏色為褐色。在氣候條件不適宜發(fā)病時種植病斑會轉變?yōu)槁孕筒“?，等到條件有利的時候迅速發(fā)病，產(chǎn)生大量病斑。一種是白點型病斑，水稻感病的嫩葉發(fā)病之后，會產(chǎn)生顏色白色，形狀接近圓形的小斑，這種病斑不會產(chǎn)生孢子，當氣候條件利于其擴展時，就可轉變急性型病斑，迅速的發(fā)病。還有一種是褐點型病斑，一般較多的發(fā)生在水稻的高抗品種或者老葉片上，會產(chǎn)生大小類似于針尖的褐色小點，但是只會產(chǎn)生于葉脈間，一般情況下不會產(chǎn)生孢子。（3）葉枕瘟：水稻發(fā)生的癥狀是在葉片的葉枕處產(chǎn)生褐色的斑塊，到后期發(fā)生節(jié)瘟。（4）節(jié)瘟：初期癥狀是在水稻的莖稈和節(jié)間上產(chǎn)生褐色小點，然后圍繞莖節(jié)的位置擴展開來，直到整個節(jié)間變成黑色，當氣候干燥的時候發(fā)病的部位容易折斷，當濕度大的時候節(jié)上會產(chǎn)生灰綠色的霉層。（5）穗頸瘟：發(fā)生位置為水稻稻頸部和小枝梗，水稻頸和枝梗感病后病斑一開始是顏色暗褐然后變成黑褐色，濕度大的時候病斑上產(chǎn)生灰色的霉層，發(fā)病時間早而且嚴重的穗子會枯死呈現(xiàn)為白色，發(fā)病較晚的穗子，水稻的枇谷較多、稻米品質差、稻米的產(chǎn)量有所下降。（6）稻粒瘟：發(fā)病位置在水稻的稻粒上，發(fā)病早的病斑形狀為橢圓形，顏色為灰白色，稻谷成熟以后病斑變得不明顯，發(fā)病遲的病斑顏色為，形狀為圓形或者不規(guī)則形。1.1.2稻瘟病的病理稻瘟病的病原菌的無性態(tài)為PyriculariaoryzaeCav.屬于真菌的半知菌亞門、絲孢目、梨孢屬、稻梨孢；稻瘟病的有性態(tài)為Magnaporthegrisea（Hebert）Barrnov，屬于真菌的子囊菌亞門、球殼菌目。水稻病原菌以菌絲體和分生孢子的形式在稻草、莖科、病谷、種于中越冬，作為第二年病害的初侵染來源。稻瘟病病原菌借助風雨的作用傳播到水稻的植株上，形成了中心病株，再進行侵染。稻瘟病發(fā)病的條件有：上一年發(fā)病的稻草殘留在稻田內、種子帶菌率高和過多施用氮肥使得稻株徒長等。發(fā)病還與氣候條件有關，適當?shù)臏囟?、高的濕度都是適合發(fā)病的環(huán)境條件。環(huán)境中平均氣溫為24～28℃，并且有1晝夜以上的空氣達到飽和濕度時，稻瘟病就容易流行；當氣溫超過35℃或低于15℃，由于氣溫的過高或過低不利于發(fā)病，病害就會受到抑制。所以在水稻分期和抽穗期如果持續(xù)有適溫、多雨、日少的天氣出現(xiàn)，就容易引起葉瘟和穗頸瘟的爆發(fā)[7]。稻瘟病發(fā)病的過程十分復雜，主要包括稻瘟病病菌的分生孢子形成和萌發(fā)、形成附著胞、侵染其他水稻后分化和侵染性菌絲的擴展等過程[8]。稻瘟病的病菌菌主要是從水稻的葉片和莖的表皮以及根部來侵染水稻，從而形成病斑，它的侵染過程可以分為以下幾個階段：１）孢子附著到寄主的表皮，也就是稻瘟病菌的分生孢子飄落到水稻植株葉莖或者根部，其便利用頂端分泌出具有較好吸附性的黏合物，使得孢子緊密的附著在水稻的葉片表面；２）進行芽管發(fā)育，分生孢子的頂端萌發(fā)出芽管，粘附在宿主水稻的表面外基質上；３）形成附著胞，芽管進一步分化成圓頂狀的附著胞，附著胞里面含有孢子和芽管自我分解的營養(yǎng)物質，這一個過程受到細胞周期的調控；４）產(chǎn)生侵入釘，在附著胞的細胞壁和細胞膜之間有一層黑色素，黑色素對附著胞的侵染過程具有重要的作用，當附著胞不能形成黑色素的時候，就不能夠產(chǎn)生足夠大的膨壓，從而失去了致病力；５）在寄主水稻中生長，病菌的初級侵入菌絲在寄主細胞中進行營養(yǎng)的吸收后產(chǎn)生出次級菌絲，次級菌絲通過寄主細胞中的胞間連絲擴散到相鄰近的細胞，3天后就可以產(chǎn)生明顯的壞死癥狀，也就是病斑[9]。1.1.3稻瘟病的防治水稻的整個生育期內都有可能爆發(fā)稻瘟病，目前控制稻瘟病的主要方式有三種：一是進行種植管理，也就是根據(jù)當?shù)氐奶鞖忸A報和環(huán)境及時觀察田間水稻的癥狀。合理施加肥料和管理水份，應該多施加農(nóng)家肥，減少氮肥的施用量，還可以適量增加磷鉀肥的施用，從而提高水稻植株的抗病能力，減輕稻瘟病的發(fā)生。二為化學藥物防治，但這一方法不僅增加了生產(chǎn)成本，污染環(huán)境，不利于可持續(xù)發(fā)展，而且也會對人類造成直接或間接的危害。第三是抗稻瘟病的水稻品種的選育。選擇培育抗稻瘟病病品種是控制水稻稻瘟病的最佳手段，而選育和推廣水稻抗病品種應該從源頭開始，發(fā)掘和篩選出優(yōu)良的抗稻瘟病基因資源，但是由于稻瘟病菌生理小種的變異性強、變異的速度快，新推廣的水稻抗病品種經(jīng)常在種植幾年之后就會喪失抗性從而失去了推廣價值。對此，我們可以應用分子標記選擇技術將單個或多個抗譜廣的稻瘟病抗性基因導入或聚合到同一個水稻品種中，來培育出具有持久抗稻瘟病的水稻品種，這是一種非常有效的手段，通過傳統(tǒng)育種手段和現(xiàn)代分子標記技術的結合，將持久、廣譜抗稻瘟病基因導入到同一品種中，這樣不僅能縮短育種年限，還可以大大提高育種效率和應用效果。大量實驗研究證明，發(fā)掘新的抗稻瘟病基因，培育高品質的抗病品種，是最經(jīng)濟、環(huán)保和有效的稻瘟病防治措施[10]。1.2稻瘟病抗性基因1.2.1稻瘟病抗性遺傳分析水稻對稻瘟病的抗性是由于寄主植物與病原菌在一定的環(huán)境條件下相互作用的結果。目前，對水稻稻瘟病的抗性有著許多不同的描述，比如:垂直抗性和水平抗性，真實抗性和田間抗性，特異抗性和非特異抗病性，完全抗性和部分抗性，質量抗性和數(shù)量抗性等等，而垂直抗性和水平抗性被廣泛應用于研究中[11]。水稻對稻瘟病的抗性可以分為垂直抗性和水平抗性。垂直抗性受到主效基因的控制，對于特定的菌系起到抗性作用，它又稱為專性抗性或者小種專性抗性；水平抗性受到微效多基因的控制，對于全部的菌系都起到抗性作用，又稱為非專性抗性或小種非專性抗性。垂直抗性即專性抗性，具有如下特征：①寄主與病原菌表現(xiàn)?；躁P系；②用Flor的基因對基因學說能解釋其遺傳關系；③已鑒定控制這種抗性的許多抗病基因；④受主效基因控制，多數(shù)表現(xiàn)顯性。低水平抗性多數(shù)受微效基因控制，許多場合為不完全顯性或顯隱關系不明確，逐個進行基因分析有困難，因此，這種抗性的遺傳很少[12]。1.2.2稻瘟病抗性基因研究進展1922年日本的學家佐佐木研究了水稻的抗感品種雜交F2、F3，發(fā)現(xiàn)了抗感的分離比例為3：1，表現(xiàn)為一對基因的遺傳。之后，不同國家的學者利用不同的品種雜交，F(xiàn)2獲得了3:1、9:6:1、27:27:9:1的分離比例，這表明了水稻的抗性分別受到一對、兩對、三對顯性基因的控制。中國對水稻的抗病性研究起步較晚，1976～1979年完成的全國稻瘟病生理小種的鑒定為以后續(xù)抗稻瘟病基因的研究分析打下了基礎。沈錦驊等用ZD1和PG1兩菌系對Pit、取手1號、BL3、峰光、南65等品種配制的組合做遺傳研究，F(xiàn)1均表現(xiàn)抗性，F(xiàn)2不同組合分別呈現(xiàn)3:1、13:3、15:1、63:1的分離比，表明抗性分別呈一對、兩對、三對的遺傳[8]。目前，稻瘟病的抗性遺傳一般是由1對或者2對主效基因來控制，有些由3對主效基因控制，少數(shù)的情況下由隱性基因或者不完全顯性基因控制[13]。隨著分子育種技術的發(fā)展和在水稻稻瘟病研究領域的大量應用，許多的水稻稻瘟病抗性基因已經(jīng)被陸續(xù)定位和克隆，選用的分子標記的數(shù)量和種類促進了稻瘟病抗性基因定位和精細定位?，F(xiàn)階段，大部分的稻瘟病抗性基因是用RFLP標記來定位的，對于候選基因和以PCR為基礎的分子標記正越來越廣泛地適用于水稻稻瘟病抗性基因的分子定位。之前，基因定位都是通過經(jīng)典的遺傳學方法進行，自從分子標記出現(xiàn)以后，被定位的基因數(shù)量迅速增加，到現(xiàn)在為止，已經(jīng)鑒定出了40多個抗稻瘟病抗性主效基因以及眾多的微效基因,稻瘟病抗性可以由單個或者多個顯性主效基因和微效多基因（QTL）控制，也有少數(shù)或者個別隱性基因以及修飾基因控制的報道[5]。Pi9被定位于水稻的第6號染色體上，是一個廣譜稻瘟病抗性基因[14]。含有Pi9基因的75-1-127對國際水稻所收集的100多個菲律賓的稻瘟病菌株都表現(xiàn)出了抗性，并且高抗來自13個國家的全部43個稻瘟病的菌株。Qu等對這2個BAC克隆76kb的序列進行測序，一共篩選到了6個NBS-LRR類候選基因，然后通過逐一分析消除侯選基因的突變體，并且通過互補驗證實驗，最終確定了其中NBS2-Pi9是Pi9的功能位點[15]。經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)Pi9含有2個長度分別是5362bp和128bp的內含子，Pi9的cDNA全長是4009p，包括了一段3099p的編碼區(qū)和910bp3＇的非編碼區(qū)。Pi9編碼一個羧基端含有富亮氨酸重復域（LRRs）的1032個氨基酸所組成的蛋白產(chǎn)物，它的LRRs是由17個不完整的LRR重復而組成，并且在氨基端含有由激酶1a、2和激酶3a等結構組成的NBS結構域。在水稻中，Pi9基因是組成型表達，是不受病原菌的誘導[16]。Pi5被定位于水稻的第9號染色體上S04G03和C1454之間的170kb區(qū)間內[17]。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)Pi5與Pi3的關系為等位的或者緊密連鎖，而且在對Pi5/Pi3區(qū)間的測序后發(fā)現(xiàn)它們實質上就是屬于同一個基因，而且它們的抗性供體不是Moroberekan和Pai-Kan-Tao，最有可能的供體是Tetep[18]。另外，Pi5/Pi3和Pi-i位于同一個位置，而且它們的抗譜是一致的，由此來推測它們是同一個基因。經(jīng)過測序和轉基因功能驗證，發(fā)現(xiàn)Pi5與Pi-km類似，都包含兩個獨立遺傳的NBS-LRR基因，而且兩個基因的蛋白產(chǎn)物在氨基端都有CC結構。對其進行序列分析后發(fā)現(xiàn)Pi5-1和Pi5-2分別有5和6個外顯子，蛋白產(chǎn)物分別含有1025和1063個氨基酸，基因表達分析表明Pi5-1受病原菌誘導表達，而Pi5-2是組成性表達[19]。第二章實驗材料和方法2.1實驗前準備2.1.1實驗材料選取2017年云南楚雄地區(qū)試驗田種植的表現(xiàn)出抗稻瘟病的108份水稻葉片（見附錄），分為F系列（雜交的后代品系）和K系列（抗性篩選系列）。2.1.2實驗材料準備1.為方便實驗操作，可對水稻葉片材料按順序先進行編號（見表3.2，序號即編號），依水稻編號對所用離心管和離心柱也進行編號，后續(xù)實驗操作以編號順序為準，方便實驗記錄，以防出錯。2.ddH2O的制作：用容器取100ml去離子水，滅菌。滅菌鍋的操作為放氣后打開，加適量水，放入內膽，物品，蓋上蓋子，放下氣閥，打開開關，滅菌。2.2實驗方法2.2.1提取水稻DNA2.2.1.1實驗用品試劑：液氮，無水乙醇，β-巰基乙醇、PlantDNAIsolationKit(見表2.1)等。器材:研缽，高速冷凍離心機（EppendorfCenteifuge5804R），HWS28型電熱恒溫水浴鍋，移液器，旋渦儀，1.5ml和2ml無菌離心管，各種規(guī)格槍頭等。植物基因組DNA提取試劑盒中，BufferPL1的作用是提供植物組織裂解環(huán)境；ForegeneProtease在BufferPL1的環(huán)境下酶解植物組織中的蛋白質；BufferPL2的用途是使ForegeneProtease失活，并且提供DNA上柱環(huán)境；BufferPW能去除DNA中的蛋白質、RNA等雜質，而BufferWB能去除DNA中殘留的鹽離子XBuffer，這兩種試劑均是為去除提取過程中DNA攜帶的雜質；EB洗脫純化柱膜上的DNA；DNA-onlyColumn用途為特異吸附裂解產(chǎn)物中的基因組DNA。表2.1PlantDNAIsolationKit組分信息試劑盒組成DE-06111DE-06112DE-0611350次100次250次BufferPL135ml70ml180mlBufferPL235ml70ml180mlBufferPW30ml60ml150mlBufferWB25ml50ml125mlBufferEB12.5ml25ml65mlForegeneProtease1.25ml2.5ml6.5ml離心柱、離心管各50個各100個各250個2.2.1.1DNA提取1、取用600μLBuferPL1放在2ml離心管中，加入20μLForegeneProtease，2μLβ-巰基乙醇，將其混合均勻后放入到65℃的水浴鍋中固定好后預熱。2、選用適量且定量的水稻新鮮植物葉片，用剪刀盡量剪得碎小，放于研缽中，加入液氮后充分研磨，得到細小粉末。3、快速稱取100mg研磨好的新鮮水稻葉片的組織粉末，轉移到65℃預熱好的BufferPL1中。迅速顛倒混勻后，將離心管放在65℃水浴鍋中保溫40分鐘，每隔10分鐘就應顛倒混勻一次。研磨完成后，樣本粉末需要立即轉移，否則基因組DNA就會快速解。4、加入600μL的BufferPL2，充分混勻，放回65℃水浴鍋中水浴10分鐘。5、放入到高速離心機中，對稱放置，在12000rpm的條件下離心5~10分鐘。6、把離心管這的上清液用移液槍移到新的離心管中。在這一個過程中盡可能的不要吸到沉淀，如果所吸取的上清液中存在較多固體雜質，可以重復步驟5、6一次。7、使用移液器在離心管中加入180μL的無水乙醇，在渦旋儀上充分渦旋，混和均勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。8、把離心柱放入到收集管中，取出800ul的混合液懸空垂直加入離心柱中，在離心機中12000rpm離心1分鐘后，倒掉收集管中的廢液。9、把剩余的混合液全部加入離心柱中，在12000rpm下離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。10、把500μL得BufferPW加入到離心管中，注意要懸空加入，避免污染，12000rpm離心1分鐘后，倒掉收集管中的廢液。11、向離心柱中加入懸空垂直700μLBufferWB，使用前要先檢查是否已入無水乙醇，12000rpm離心1分鐘后，倒掉收集管中的廢液。12、重復上個步驟（11）一次。13．把離心柱放回到收集管中，離心機中12000rpm下空管離心2分鐘，以此來盡可能的去除BufferWB。14、把離心柱轉移到新的1.5ml離心管中，把100μL已經(jīng)于65℃預熱好的BufferEB加入到離心柱中，注意要懸空加入，避免污染，12000rpm離心1分鐘后，倒掉收集管中的廢液。然后室溫放置5分鐘，在12000rpm下離心1分鐘。由于需要較高濃度的水稻DNA來進行后續(xù)實驗，為提高DNA的濃度，可以將第1次離心得到的溶液重新加回離心柱中，12000rpm離心1分鐘。2.2.1.3鑒定DNA提取是否成功為確保后續(xù)實驗的順利進行，應對提取出的DNA測定其濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。（1）測量提取DNA的OD值選用紫外/可見分光光度計（BioDrop），操作的方法為：首先將電腦開機，打開軟件，選擇所需軟件版本，選擇的方法方法是在菜單“LifeScience”下選擇樣品所對應的方法，在菜單“Sample”下選擇“SampleNaming”命名樣品，選擇“ConfigureBatch”編輯樣品批次。在菜單“Acquire”下，柏精和柏偶的超微量點的“PathLength”選擇“BioDropμLite0.5”，“Units”選擇所需單位,其他參數(shù)不變。然后測量空白：將實驗的緩沖液作為樣品，吸取2μL后加到微量測量點，選擇“TakeReference”或者選擇狀態(tài)欄左上角空白比色皿圖標，讀數(shù)顯示為0.00，即可繼續(xù)進行樣品的測量。在測量樣品之前先用無塵紙擦拭干凈空白液，加2μL的樣品到微量測量點，選擇“Start”開始樣品測量，讀數(shù)顯示值即為所提DNA的樣品濃度值，本次樣品測試完畢，選擇“Stop”。本應用測試結束，選擇“AcquisitionComplete”。然后保存樣品的檢測數(shù)據(jù)，選擇狀態(tài)欄左上角保存圖標,保存至目標盤。最后關閉軟件，關機，清潔。（2）用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA，原理及具體操作見下文（2.2.3瓊脂糖凝膠電泳），但應注意樣品應與loadingbuffer按比例混合后再點樣，否則會發(fā)生DNA漂浮，導致檢測失敗。進行檢測鑒定后證明此次DNA提取成功，可繼續(xù)進行后續(xù)實驗。2.2.2PCR檢測方法2.2.2.1擴增原理多聚酶鏈式反應簡稱PCR（PolymeraseChainReaction）擴增，它是一種在環(huán)境中模擬發(fā)生在細胞內的DNA快速擴增特定基因或DNA序列的復制過程的技術。運用PCR方法在小試管（Eppendorf管）中建立反應體系，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸3個基本反應20～30個循環(huán)之后，只需數(shù)小時，在特制的PCR儀上就可以把極微量的目的基因或者某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至數(shù)億倍份拷貝，它擴增的拷貝數(shù)，理論上來說，可達到的最高值是2n。2.2.2.2PCR實驗材料試劑：PCR擴增樣品、PCR預混液、ForwardPrimer（前引物）、ReversePrimer（后引物）、提取的DNA、滅菌蒸餾水。本實驗選用的引物為Pi5和Pi9引物（OligoDNA），由Invitrogen公司使用真空冷凍干燥的性狀為波膜狀或者粉末狀的白色粉末。在實驗前，引物附著在離心管內壁上我們要先進行稀釋。首先應將引物管離心數(shù)秒使DNA聚集至管底，然后小心開啟管，避免造成粉末飛揚導致DNA損失，再加入適量的去離子水，蓋好管蓋，渦旋振蕩使其混和均勻并充分溶解?？梢詫⒁锵♂層赥E（10mMTris-HCL,PH8.0，1MmEDTA）溶液中，濃度高于10μM，并于-20℃儲存。如果需要稀釋到10uM，只需要加入管內總nmole數(shù)/10毫升的TE即可。使用過程中，要盡可能減少引物溶液的凍融次數(shù)以降低這個過程對引物產(chǎn)生的降解。在-20℃保存條件下，干粉引物至少可以穩(wěn)定的保存1年，引物溶液可以穩(wěn)定的保存6個月以上。目前該公司提供的純化方式有脫鹽、PAGE純化和HPLC純化，我們選用的是PAGE?？剐曰騊i5和Pi9的分子標記信息如表2.2所示。表2.2分子標記信息基因名引物名序列說明Pi9[20]Pi9FGCTGTGCTCCAAATGAGGAT291/397291條帶，含Pi9或Piz；397條帶，不含Pi9；兩條帶，雜合.退火55。Pi9RGCGATCTCACATCCTTTGCTPi5[20]Pi5FATAGATCATGCGCCCTCTTG206/307特異標記，206bp有Pi5；307沒有；兩條有為雜合。退火55。Pi5RTCATACCCCATTCGGTCATT儀器：微量移液器(2μL和4μl)，移液槍、PCR管，PCR儀（BIORAD）等。2.2.2.3PCR體系表2.3PCR25ul體系反應物數(shù)量DNA2.0μL前引物0.5μL后引物0.5μLmix12.5μLddH2O9.5μL總計25μL2.2.2.4PCR過程及反應程序（1）配制25ul體系。在實際操作過程中不是單一添加DNA模板，而是根據(jù)要做樣品的個數(shù)來統(tǒng)一加試劑，最后再分裝在PCR管里。（2）將PCR管密封蓋好，放入PCR儀內進行擴增。（3）PCR擴增程序：表2.4PCR擴增條件步驟溫度時間循環(huán)數(shù)內容194℃5min1預變性294℃30s40變性355℃30s40退火472℃30s40延伸572℃5min1后延伸64℃20min保溫2.2.3瓊脂糖凝膠電泳2.2.3.1瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶有電荷。瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質的特性，使用瓊脂糖作為支持介質的一種電泳方法。它的分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是它具有“分子篩”和“電泳”的雙重作用，DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。凝膠電泳是分子研究方面的核心技術之一，用來分離鑒定和純化DNA和RNA片段。瓊脂糖凝膠電泳具有對蛋白質吸附十分微小，所以沒有拖尾的現(xiàn)象；凝膠的結構均勻，孔徑較大，可以用來分離酶的復合物、核酸和病毒等大分子物質；不吸收紫外光，可以直接利用紫外光吸收法作定量測定等優(yōu)點。（1）在電場的作用下以及中性pH的緩沖條件下，帶有負電荷的核酸分子向正極遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，一般相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。（2）在一定的電場強度下，DNA分子在堿性的緩沖液中帶有負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠電泳過程中泳動時，同時具有電荷效應與分子篩效應，不同的DNA分子量大小和構型都不同，電泳時的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的過程中，主要是利用分子篩效應，DNA的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比的關系，從而根據(jù)DNA分子的大小使其分離開來。（3）生物染料在紫外光的照射下能夠發(fā)出熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負極向正極泳動時，生物染料也隨之從正極向負極移動，就會鑲嵌入DNA分子中形成絡合物，這樣DNA在紫外光照射下就能發(fā)出很強的熒光。在生物染料足夠的情況下，熒光的強度與DNA的含量成正比，這樣就可以檢測DNA的濃度。（4）DNA的遷移速率決定因素有DNA分子的大小、瓊脂糖濃度濃度和DNA的構象。雙鏈DNA分子在電泳中的遷移速率與它堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；瓊脂糖所用濃度越低，相同的核酸分子遷移速度越快；DNA的構象，超螺旋環(huán)狀DNA＞線狀DNA＞切口環(huán)狀DNA。2.2.3.2瓊脂糖凝膠電泳的實驗材料試劑：去離子水、瓊脂粉、BM2000DNAMarker（北京博邁德基因技術有限公司）、EB（溴化乙錠）、緩沖液（TAE）。配制50倍的TAE首先稱量Tris242g，Na2EDTA2H2O37.2g放在1L的燒杯中；向燒杯中加入大約800ml的去離子水，充分攪拌均勻；然后加入57.1ml的冰乙酸，用玻璃杯攪拌使其充分溶解；最后加入去離子水定容到1L后，室溫保存。當實驗需要使用時，應該先將其稀釋為1倍的緩沖液，比如需要使用4L的1*TAE，則量取80ml的50*TAE，3.92L的去離子水，混和均勻就可以直接使用。使用的BM2000DNAMarker中已經(jīng)含有1xLoadingBuffer，所以可以直接使用。根據(jù)電泳實驗的需要，用移液器吸取適量Marker使用即可。BM2000DNAMarker一共有7條DNA條帶，組成的DNA條帶分別為：100bp(50ng/5μL)、250bp(50ng/5μL)、500bp(50ng/5μL)、750bp(75ng/5μL)、1000bp(50ng/5μL)、1500bp(75ng/5μL)、2000bp(100ng/5μL)，此次試驗的條帶均在250bp~500bp之間。儀器：電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、微波爐、電泳儀（WealtecCorp）移液槍（1000μL、0.1-10μL、100μL）、錐形瓶、量筒、容量瓶、電泳槽、梳子等。2.2.3.3瓊脂糖凝膠電泳的步驟1.膠液的制備：稱取1.2g瓊脂糖放入錐形瓶中,加入100ml緩沖液在微波爐中加熱溶解瓊脂糖，這一過程中適時取出錐形瓶搖晃，使瓊脂糖充分均勻溶解。溶解后將溶液室溫下冷卻到60度左右（不燙手即可），加入100μL2%EB(溴化乙錠)溶液。然后將瓊脂糖溶液倒入灌膠盒中，在適當位置插上梳子，灌膠前要確保灌膠盒放置在水平面上。凝膠厚度一般在3-5mm之間。室溫下使膠凝固大約30分鐘，拔出梳子。然后放置到電泳槽中,倒上電泳緩沖液電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為宜。將膠放入盛有適量緩沖液的電泳槽內。2.上樣。每一組應在篩孔中加入10μLMarker和20μL空白對照。PCR擴增后的DNA樣品用微量移液槍小心加入樣品槽中，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。另外要盡量避免在外側泳道上樣,因為凝膠的厚度不均一，外側泳道的遷移率會不一致(邊緣效應)。上樣后就不要移動電泳槽的位置，這樣會晃動緩沖液，因而會使樣品從孔中溢出。3.跑膠：加完樣后，插上導線，打開電泳儀電源，按照需要調節(jié)電壓至120V，電泳開始，觀察電流情況或電泳槽中負極的鉑金絲是否有氣泡出現(xiàn)，有氣泡出現(xiàn)說明電泳正常開始，沒有氣泡產(chǎn)生要及時查找原因，電泳時間為15-20min。4.可通過溴酚藍條帶是否移動到凝膠中間位置時作為電泳完成的標志，此時即可停止電泳，取出凝膠放在暗箱紫外分析儀上，觀察電泳結果。2.2.4紫外燈下觀察并拍照保存使用與微型計算機連接的凝膠圖像處理系統(tǒng)（IMAGING-G6），打開紫外燈暗箱，將電泳完成后的凝膠以正確方向放入紫外觀察儀內，關上開口后再打開紫外燈，電腦上選擇“掃描圖像”，根據(jù)顯示圖形適度調節(jié)焦距和亮度，得到清晰圖像后保存在所建數(shù)據(jù)庫中，用以進行后續(xù)實驗結果分析。第三章實驗結果與分析3.1水稻葉片DNA的提取與檢測利用液氮和植物基因組DNA提取試劑盒提取出108份水稻葉片的DNA，并進行紫外吸收法和瓊脂糖凝膠電泳檢測。紫外吸收法測定DNA濃度（見表3.1），核酸在260nm波長處具有紫外吸收特性（最大吸收峰）。高純度的DNA樣品A260/A280應在1.8左右，如果比值大于1.8，說明仍有RNA，可用RNA酶處理，比值低于1.8，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。較純的核酸A260/A230應大于2.0，A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等。此次使用所提DNA均具有一定濃度，但純度有所欠缺，而且部分DNA已經(jīng)開始降解。用瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行鑒定（見圖3.1），證明提取出的DNA具有一定的濃度，可以繼續(xù)進行后續(xù)實驗。表3.1部分提取DNA的OD值編號濃度A260/A280A260/A230F177731.9611.9F17865.481.8551.797F17938.671.8021.561K7496.761.6741.393K76106.91.8961.973K9896.951.9041.923圖3.1部分DNA電泳圖3.2雜交品系抗性基因檢測根據(jù)分子標記信息可知，針對Pi5等位基因的2對引物的PCR擴增產(chǎn)物有兩種帶型：一種是攜帶有抗病基因Pi5的條帶，另一種是不含有抗病基因的條帶。含有Pi5抗性基因的擴增條帶片段為206bp，不含有抗病基因的條帶片段大小有307bp,同時有206bp和307bp時為雜合。針對Pi9等位基因的2對引物的PCR擴增產(chǎn)物有兩種帶型：一種是攜帶有抗病基因Pi9的條帶，另一種是不含有抗病基因的條帶。含有Pi9抗性基因的擴增條帶片段為291bp，不含有抗病基因的條帶片段大小為397bp，有291bp和397bp時為雜合。經(jīng)檢測（見圖3.2），F(xiàn)系列共50份水稻育種材料中（見表3.2），含有純合Pi5基因的有9份，占F系列水稻18.0%，實驗編號分別為：166、167、168、169、170、171、173、174、175。含有雜合Pi5基因4份，占F系列水稻8.00%，分別為:144、165、172、183。不含Pi5基因37份，占F系列水稻74.0%，F(xiàn)系列中13份含有抗性基因Pi5，僅占到供試材料的26.0%。F系列中每一品系選取單株進行實驗（見附錄2），其中，F(xiàn)151（151-1、151-2），F(xiàn)152（152-1、152-2），F(xiàn)162(162-1、162-2)，F(xiàn)165（165-1、165-2、165-3），F(xiàn)167（167-1、167-2、167-3），F(xiàn)172（172-1、172-2），F(xiàn)174（174-1、174-2、174-3），F(xiàn)1（f1-1~1-7），F(xiàn)2（f2-1~2-8）以及f5-1均不含Pi5基因。F178（178-1含雜合Pi5基因，178-2含純合Pi5基因）；F179（179-1~179-5含純合Pi5基因，179-6含雜合Pi5基因），F(xiàn)182中F182-1、182-2均含純合Pi5基因，f1-8含有雜合Pi5基因，在這些材料中，可優(yōu)先選擇含純合Pi5基因的材料進行后續(xù)實驗研究，其次才使用雜合材料。圖3.2F141-190抗性基因檢測圖注：A為F141-157，B為F158-174，C為F175-190。經(jīng)檢測，F(xiàn)系列共50份水稻育種材料中，含有純合Pi9基因的有25份，占F系列水稻50.0%，含有雜合Pi9基因13份，占F系列水稻26.0%，實驗編號為：143、161、163、164、165、166、177、178、181、182、185、187、190。不含Pi9基因12份，占F系列水稻24.0%。得出F系列中38份含有抗性基因Pi9，占到供試材料的76.0%。F系列中每一品系選取單株進行實驗，其中，F(xiàn)165（165-1、165-2、165-3），F(xiàn)167（167-1、167-2、167-3、167-4），f1-5、f2-1、f2-7、f2-8不含Pi9基因。此外，F(xiàn)151（151-1、151-2），F(xiàn)152（152-1、152-2），F(xiàn)162(162-1、162-2)，F(xiàn)179（179-1~179-6），F(xiàn)182(F182-1、182-2)，這些系列含純合Pi9基因。其余，F(xiàn)172（172-1含純合Pi9基因，172-2含雜合Pi9基因），F(xiàn)174（174-1含純合Pi9基因，174-2、174-3含雜合Pi9基因），F(xiàn)178（178-1、178-2）含雜合Pi9基因，F(xiàn)1（f1-1、1-4、1-8含純合Pi9基因，1-1、1-31-6、1-7含雜合Pi9基因），F(xiàn)2（f2-2、2-6含雜合Pi9基因，2-3含純合Pi9基因），f5-1含雜合Pi9基因。圖3.3F141-190抗性基因檢測圖注：A為F141-158，B為F159-175，C為F176-190。3.3篩選系列抗性基因檢測經(jīng)檢測（見圖3.4），K系列共58份水稻育種材料中（見表3.2），沒有含有純合Pi5基因的供試材料，含有雜合Pi5基因的供試材料6份，占K系列水稻10.3%，分別為：76、78、81、84、111、116。不含Pi5基因的供試材料52份，占K系列水稻89.7%。得出K系列中6份含有抗性基因Pi9，僅占到供試材料的10.3%。圖3.4K69-126抗性基因檢測圖注：A為K69-84，B為K85-99，C為K100-116，D為K117-126.經(jīng)檢測（見圖3-5），K系列共58份水稻育種材料中，含有純合Pi9基因的有9份，占K系列水稻15.5%，實驗編號分別為：86、90、92、102、103、108、110、111、113。含有雜合Pi9基因7份，占K系列水稻12.1%，分別為：99、100、104、107、109、112、116。不含Pi9基因42份，占K系列水稻72.4%。得出K系列中16份含有抗性基因Pi9，僅占到供試材料的27.6%。圖3.5K69-126抗性基因檢測圖注：A為K69-85，B為K86-102，C為K103-118，D為K119-126.綜合所有的水稻材料來看（見表3.2），在108份供試材料中，含有純合Pi5和Pi9抗性基因的水稻材料有8份，占供試材料7.40%，分別為167（F179-1）、168（F192-2）、169（F179-3）、170（F179-4）、171（F179-5）、173（F181-1）、174（F182-1）、175（F182-2）。含有雜合Pi5和Pi9抗性基因的水稻材料有2份，占供試材料1.85%，分別是165（F118-1）、116（K268）；不含Pi5和Pi9抗性基因的水稻材料有50份，占供試材料46.3%，其余均為僅含Pi5或僅含Pi9抗性基因的水稻材料。F系列每一品系選取單株進行鑒定，統(tǒng)計結果后，其中含Pi5抗性基因的材料為：品系F149、F178、F179、F181、F182以及f1-8株。含Pi9抗性基因的材料較多，除品系F165、F166、F167以及f1-5、f2-1、f2-7、f2-8四株材料外均含Pi9抗性基因。此外，F(xiàn)系列中的178、179品系為恢復系（見附錄2）?；謴拖涤没蛐蜑镹（RR）的品種作父本，與基因型為S（rr）的雄性不育系雜交，使其后代恢復可育性。這種能夠使雄性不育系的后代恢復可育性的品種，叫做雄性不育恢復系，簡稱恢復系。用這樣的種子在田間大面積播種，長成的植株既可以通過傳粉而結實，又可以在各方面表現(xiàn)出較強的優(yōu)勢。所以，可以將F系列中的178、179品系繼續(xù)作為恢復系進行使用。同時含有雜合Pi5和Pi9抗性基因的材料有F118-1和K128，可進行改良研究，雜交篩選純合個體，提高抗稻瘟病基因的選擇性；同時含有純合Pi5和Pi9抗性基因的水稻材料有F179品系、F181-1、F182品系，可對其進行深入研究，將稻瘟病抗性基因研究與大田研究向結合，培育更多廣譜高效或持久抗病新種質。表3.2108份水稻材料結果序號材料田間編號Pi9Pi5序號材料田間編號Pi9Pi5F-141F142-1RRrr73K109rrrr142F146-1RRrr74K110rrrr143F147-1Rrrr75K111rrrr144F149-1RRRr76K112rrRr145F151-1RRrr77K113rrrr146F151-2RRrr78K114rrRr147F152-1RRrr79K115rrrr148F152-2RRrr80K116rrrr149F161-1RRrr81K117rrRr150F162-1RRrr82K118rrrr151F162-2RRrr83K119rrrr152F165-1rrrr84K120rrRr153F165-2rrrr85K121rrrr154F165-3rrrr86K122RRrr155F166-1rrrr87K123rrrr156F167-1rrrr88K167rrrr157F167-2rrrr89K168rrrr158F167-3rrrr90K169RRrr159F167-4rrrr91K170rrrr160F172-1RRrr92K171RRrr161F172-2Rrrr93K172rrrr162F174-1RRrr94K173rrrr163F174-2Rrrr95K174rrrr164F174-3Rrrr96K175rrrr165F178-1RrRr97K176rrrr166F178-2RrRR98K177rrrr167F179-1RRRR99K178Rrrr168F179-2RRRR100K179Rrrr169F179-3RRRR101K180rrrr170F179-4RRRR102K181RRrr171F179-5RRRR103K182RRrr172F179-6RRRr104K183Rrrr173F181-1RRRR105K184rrrr174F182-1RRRR106K185rrrr175F182-2RRRR107K186Rrrr176f1-1RRrr108K187RRrr177f1-2Rrrr109K188Rrrr178f1-3Rrrr110K189RRrr179f1-4RRrr111K190RRRr180f1-5rrrr112K191Rrrr181f1-6Rrrr113K192RRrr182f1-7Rrrr114K193rrrr183f1-8RRRr115K194rrrr184f2-1rrrr116K268RrRr185f2-2Rrrr117K270rrrr186f2-3RRrr118K271rrrr187f2-6Rrrr119K272rrrr188f2-7rrrr120K273rrrr189f2-8rrrr121K274rrrr190f5-1Rrrr122K275rrrrK-69K105rrrr123K276rrrr70K106rrrr124K277rrrr71K107rrrr125K278rrrr72K108rrrr126K繁32rrrr注：表中RR代表含有純合抗性基因；Rr代表含有雜合抗性基因；rr代表不含有該抗性基因。第四章實驗結論與討論4.1實驗結論在2017年度供試材料中F系列中Pi5抗性基因存在水平較低，所占比率為26.0%；Pi9抗性基因的存在水平較為廣泛，占76.0%。在K系列中Pi5抗性基因僅極少數(shù)存在，而且基本以雜合形式存在，所占比率為10.3%；在K系列中Pi9抗性基因部分存在，所占比率27.6%，并不是很高（見表4.1）。從總的實驗材料來看，Pi5抗性基因在2017年度供試材料中存在水平較低。不宜作為優(yōu)異種質資源進行更為全面的研究；Pi9在2017年度的水稻供試材料中所含水平較好（見表4.2）。F系列中篩選出的含有純合Pi9抗性基因的植株和品系有：F142-1、F146-1、F149-1、F151品系、F152品系、F161-1、F162品系、F172-1、F174-1、F179品系、F181-1、F182品系；含有純合Pi5抗性基因的植株和品系有F178-2、F179品系、F181-1、F182品系。K系列中篩選出含純合Pi9抗性基因的植株為K122、K169、K171、K181、K182、K187、K189、K190、K291；沒有含純合Pi5抗性基因的植株，含雜合Pi5抗性基因的植株有K112、K114、K117、K120、K190、K268。表4.1抗性基因在F、K系列分布抗性基因供試材料RR（%）Rr（%）RR+Rr（%）rr（%）總計（%）Pi5F系列18.0%8.00%26.0%74.0%100%K系列010.3%10.3%89.7%100%Pi9F系列50.0%26.0%76.0%24.0%100%K系列15.5%12.1%27.6%72.4%100%表4.2抗性基因在供試材料中的分布抗性基因供試材料RR（%）Rr（%）RR+Rr（%）rr（%）總計（%）Pi5108份8.30%9.30%17.6%82.4%100%Pi9108份31.5%18.5%50.0%50.0%100%4.2實驗討論4.2.1Marker錯誤和條帶拖尾圖4.1Marker及條帶錯誤抗性基因檢測圖在實驗過程中發(fā)現(xiàn)Marker沒有分開且沒有條帶出現(xiàn)（見圖4.1），分析Marker沒有跑開的原因可能是因為電泳時間不夠。沒有出現(xiàn)條帶可能是在提取DNA過程中，產(chǎn)生了交叉污染或所提DNA濃度較低；放置時間過程導致DNA降解；PCR過程中污染；電泳過程中緩沖液濃度有誤或者瓊脂糖凝膠沒有配置好；瓊脂糖凝膠濃度不適等原因。出現(xiàn)這種情況時，應及時記錄并分析實驗中出現(xiàn)的問題。重新配置電泳緩沖液、重新制膠進行實驗，觀察實驗結果，如果還沒有條帶，則應重新提取DNA或進行PCR擴增。圖4.2條帶及空白對照拖尾抗性基因檢測圖在實驗中條帶出現(xiàn)了條帶和空白對照上拖尾的現(xiàn)象（見圖4.2），分析原因可能是由于水稻樣品DNA中濃度過高，蛋白雜質阻礙DNA的泳動；樣品破碎或者DNA被降解以及樣品中存在RNA等。還有極大可能是因為電泳體系的問題：①電泳緩沖液TAE被污染，要及時更換緩沖液或重新配置。②上樣時水稻樣品DNA漂了,應該增加上樣緩沖液的用量并小心加樣。③電壓太高，要及時調整電壓，重新進行電泳。④適當把膠的濃度加大，可根據(jù)片斷大小來確定適宜的濃度。4.2.2提取DNA和電泳注意事項該實驗雖然原理內容簡單，但實驗量大，操作復雜繁瑣，經(jīng)常會導致實驗結果不如預期，分析實驗中可能出現(xiàn)的錯誤、發(fā)生的原因以及如何改進實驗、注意事項等總結如下：（1）提取DNA。在提取DNA過程中，涉及多種試劑，實驗時會由于人為的原因造成一些污染，并且有多種因素會影響所提取的基因組DNA產(chǎn)量，比如樣品的來源、樣品的新老程度、樣品的保存條件等。在進行實驗操作時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了以下一些問題：首先提取過程中無法得基因組DNA或者提取獲得基因組DNA低產(chǎn)量等，討論可能出現(xiàn)這些情況的原因可能有：水稻組織樣品保存不恰當或者保存時間太長，導致基因組DNA已經(jīng)有部分降解；水稻樣品用量過少以及葉片干枯等可能導致提取不到相應的基因組DNA；水稻葉片沒有進行液氮研磨或者液氮研磨之后放置較長時間，沒有及時轉移；ForegeneProtease保存方式不恰當，導致它的活性降低甚至已經(jīng)失活；試劑盒保存環(huán)境影響，導致試劑盒里面的某些組分失效；試劑盒使用方式不當，試劑使用順序和用量出錯；BufferWB沒有滴加無水乙醇；洗脫液沒有正確滴加到硅膠膜上等。為避免提取實驗過程中出錯，導致實驗失敗，在提取操作中除應足夠細心認真，嚴格按照實驗要求外，還應注意這些問題：水稻組織樣品保存于液氨或者-20℃；實驗中盡量使用采集時間接近、新鮮的水稻葉片進行基因組DNA的提?。粚τ谝呀?jīng)保存了很長時間或基因組DNA降解比較厲害的水稻樣品，可以適當增加水稻葉片的用量，以便提取獲得濃度和純度較為可觀的基因組DNA?？梢愿鶕?jù)DNA需要確定水稻葉片的用量，但是新鮮的水稻葉片不宜超過100mg；在進行DNA提取實驗時，樣本需要進行液氮充分研磨，液氮可以低溫使組織內酶失活，核酸不被降解掉。而且使用用液氮是可以使研磨充分，在液氮中植物組織內水分會形成結晶，植物組織會變脆，這種情況下可以充分的研磨，破碎細胞壁以釋放DNA。研磨完成后要盡快將樣本粉末轉移至65C預熱的BufferPL1中，一旦研磨的粉未融化，基因組DNA便開始快速降解；確認ForegeneProtease保存條件或者更換新的ForegeneProtease進行酶解反應，確保試劑盒成分有效；確認BufferWB中添加確體積的無水乙醇；將65℃預熱的洗脫液滴加到硅膠膜的正中間，并在室溫放置5分鐘增加洗脫效率。（2）瓊脂糖凝膠電泳過程。電泳的過程是對擴增待測DNA分離必不可少的一項操作，也是得到紫外分析結果的前提，對實驗的成功與否起重要作用，所以在操作過程中應該要注意以下幾點：a.凝膠中所加入的緩沖液應該與電泳槽中的緩沖液為同一種，溶解后的凝膠應該及時倒入模板中，避免應時間過長造成溶液凝固結塊。b.完全溶化后的瓊脂糖是澄清的，在室溫環(huán)境中冷卻的過程，模板內的瓊脂糖會慢慢變得不透明，在凝膠完全凝固之前不要移動灌膠盒，避免造成凝膠不平整。最佳的加入方式是在齒梳插入之前，把瓊脂糖溶液緩慢而勻速的倒入模板中，完成后馬上插上梳子，就可以得到均一的沒有氣泡的凝膠。如果仍然有氣泡，可以使用滅菌槍頭的尖端把氣泡捅破或者趕到凝膠邊緣。灌膠盒一定要清洗干凈、保持干燥，否則灌膠后會看到膠下面有大量氣泡，這是因為凝膠與水份不能相容。c.樣品加入量：加樣量的多少應該依據(jù)加樣孔的大小以及DNA片段的數(shù)量和大小來確定，加入量過多會導致條帶拖尾和彌散，對于較大的DNA這個現(xiàn)象會更加明顯。d.要確保電泳時DNA是從負極移動向正極,也就是從黑色向紅色電極方向跑。觀察凝膠或終止電泳時應先關掉電源再操作從電泳槽中取出凝膠，進行下一步的觀察。4.3展望水稻抗病育種已有幾十年的歷史了，絕大多數(shù)新品種的抗病能力只能維持在3～5年，原因是稻瘟病病菌的基因在環(huán)境等各方面的誘導下始終處于不斷變異中，這給育種工作增加了很大的難度[21]。近年來隨著現(xiàn)代分子生物學及生物技術的不斷發(fā)展，極大地推進了稻瘟病抗性遺傳研究的進程，大量的抗性資源和抗性基因不斷被發(fā)現(xiàn)、定位甚至克隆，與其緊密連鎖的標記被篩選、開發(fā)，并先后育成了一批高產(chǎn)、優(yōu)質和抗病的水稻品種投入生產(chǎn)應用，為稻瘟病抗性育種奠定了物質基礎[22]。因此，繼續(xù)發(fā)現(xiàn)挖掘具有稻瘟病抗性的新基因，利用具有廣譜抗性的稻瘟病抗源，精準定位被克隆廣譜抗病基因，通過轉基因或者是分子標記的手段進行水稻品種的分子標記育種和基因工程育種，培育出具有持久廣譜抗性的新品種是水稻抗病育種發(fā)展的一個重要方向和目標。但由于水稻稻瘟病菌小種的遺傳復雜性及易變性，稻瘟病目前仍是我國各稻作區(qū)水稻的主要病害之一[23]。為了攻克解決水稻抗稻瘟病培育選擇新品種這一長期水稻研究課題，需要繼續(xù)進行稻瘟病抗源材料的實驗研究，提高稻瘟病抗性基因的定位準確度和克隆技術，使得水稻稻瘟病抗病類型多元化，利用當前技術進行開發(fā)和稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記，通過分子標記和轉基因等技術的輔助，以此來提升稻瘟病抗病基因的選擇效率，從而培育更多具有廣譜高效或者持久抗稻瘟病及富含其他抗性的新品種。此外，稻瘟病抗性基礎研究應與大田應用研究相結合，利用分子標記篩選稻瘟病抗性基因的同時，也要注重對農(nóng)藝、經(jīng)濟性狀的考察，培育出持久、廣譜抗性的優(yōu)質高產(chǎn)水稻新品種投入應用[24]。參考文獻[1]任海,呂小紅,杜萌.多抗水稻分子標記輔助育種方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2017,45(19):154-158[2]孫一丁,馬繼瓊,楊奕,李進斌,許明輝.5個稻瘟病抗性基因在云南水稻育種中的利用分析[J].分子植物育種,2018,12(6):1844-1854.[3]徐未未,王興,黃永相,蔣世河,李偉,郭建夫.水稻抗稻瘟病基因的分子標記輔助育種研究進程[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2013,29(4):898-906.[4]張曉娟,張羽,張辰露,等.分子標記在稻瘟病抗性育種中應用的研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2013,41(8):73-75.[5]歐陽偉.分子標記在稻瘟病研究中的應用[J].南方農(nóng)業(yè),2018,12(12):186-187.[6]王亞,陳獻功,尹海慶,王越濤,楊瑞芳,臧之光,王生軒.河南主要水稻種質資源中抗稻瘟病基因的分子檢測[J].分子植物育種,2018,16(10):3203-3212.[7]范學科,張寶林,鄭愛泉.水稻抗稻瘟病基因研究進展[J].種子,2018,37(05):45-53.[8]向聰,雷東陽,任西明,彭晨.水稻抗稻瘟病遺傳育種研究進展[J].作物研究,2017,31(5):547-552.[9]譚秀芳,沈瑋囡,任廣乾,王書玉,張玉紅,彭東.水稻稻瘟病發(fā)生特點及防治措施研究進展[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2018(07):237-23.[10]王業(yè)文,王俊義,周凱,等.22個稻瘟病抗性基因在陜南山區(qū)的抗性效果鑒定[J].安徽農(nóng)學通報,2016,22(23):40-40.[11]周鵬,涂詩航,董瑞霞,等.水稻抗稻瘟病基因分子檢測及抗性評價[J].福建農(nóng)業(yè)學報,2016,36（9）:962-965.[12]劉開強，伍豪，顏群，等.水稻抗稻瘟病基因Pi1的特異性分子標記開發(fā)及利用[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2016,29（6）：1241-1244.[13]喬金玲,張景龍,孫偉.水稻稻瘟病抗病育種研究進展[J].北方水稻,2016,46(02):49-58.[14]王生軒,李俊周,謝瑛,李勇,李夢琪,曹炳武,趙全志.河南粳稻抗稻瘟病基因Pi9、Pita和Piz-t的分子檢測[J].分子植物育種,2017,15(03):951-955.[15]HUXD,SHENY,etal.GeneticcharacterizationandfinemappingoftheblastresistancelocusPigm(t)tightlylinkedtoPi2andPi9inabroad-spectrumresistantChinesevariety［J］.TheoreticalandAppliedGenetics,2006,113(4):705-713.[16]姜潔鋒.水稻稻瘟病抗性基因及其分子研究進展[J].寧波農(nóng)業(yè)科技，2017，（02）：22-30.[17]LEESK,SONGMY,SEOYS,etal.RicePi5-mediatedresistancetoMagnaportheoryzaerequiresthepresenceoftwocoiled-coil-nucleotide-binding-leucine-richrepeatgenes[J].Genetics,2009,181(4):1627-1638.[18]T.Olamendi-Portugal,A.Csoti,J.M.Jimenez-Vargas,F.Gomez-Lagunas,G.Panyi,L.D.Possani.Pi5andPi6,twoundescribedpeptidesfromthevenomofthescorpionPandinusimperatorandtheireffectsonK-channels[J].Toxicon,2017,133.[19]鄭文靜,叢玲,王妍,趙家銘,張麗霞,陳溫福.抗稻瘟病基因Pi5檢測標簽的設計及驗證[J].西南大學學報(自然科學版),2014,36(09):15-22.[20]張燕紅,賈春平,文孝榮,唐福森,王奉斌,朱小霞.新疆水稻主要育成品種13個稻瘟病的抗性基因分布[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,2017,54(9):1595-1606.[21]李剛,袁彩勇,曹奎榮,孫祥良,李軍,王健,程保山,羅伯祥,徐衛(wèi)軍,唐九友,儲成才.544份水稻種質稻瘟病抗性鑒定及抗性基因的分布研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2018,23(05):22-28.[22]田大剛,蘇軍,陳建民,胡昌泉,陳在杰,王鋒.1092份水稻材料稻瘟病抗性鑒定及抗性標記分析[J].分子植物育種,2012,10(02):214-221.[23]金國光,趙亞東,金京花,樸日花,王金明,張強.196份吉林省水稻材料的稻瘟病抗性基因分子標記檢測[J].北方水稻,2017,47(02):5-17.[24]蔡金洋.分子標記在水稻抗稻瘟病育種中的研究進展[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2018(06):4-9.附錄附表1：2017年楚雄鑒定結果17編號16冬號組合名稱K6916冬C26云恢86/C2K7016冬C27云恢86/C2K7116冬C28云恢86/C2K7216冬C29錦恢801（云恢86/C2）稍團粒K7316冬C30錦恢802（云恢86/C2）糯、米乳白色、無香味K7416冬C31云粳20號/采集1號K7516冬C32云粳恢7號/09鑒13（錦兩優(yōu)851父本）K7616冬C33云粳恢7號/09鑒13K7716冬C34云粳恢7號/09鑒13K7816冬C35HNC1/云資粳41號K7916冬C36HNC1/09鑒13//13楚選93K8016冬C37云資粳41×C1K8116冬C38楚粳27A/南34*滇粳優(yōu)5號K8216冬C39D5A/南27*滇屯502*旱谷香糯ⅡK8316冬C40金粳恢2號K8416冬C41云粳13A/L07T266//滇榆1號/IR24A/滇1/城2/南29K8516冬C42秈D16A/元江香谷K8616冬C43云1＇滇昆香3號（S8）{滇昆優(yōu)8號父本}K8716冬C44D6A/云1＇滇昆香1號K8816冬C45滇粳優(yōu)2號＇南34＇滇昆香1號(S13)K89M16*C18華176A×錦恢905K9016冬繁1s云軟201SK9116冬繁2s蜀光357s/DsPIR64446-1K9216冬繁3s蜀光612s/香飛K9316冬繁4sY58S/廣茉S——（14冬單株）K9416冬繁5sY58S/廣茉S——————200粒K9516冬繁6s云軟209S/廣茉S——（14冬單株）K9616冬繁7s云軟209