茶園土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了茶園土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的術(shù)語(yǔ)和定義、評(píng)價(jià)對(duì)象、樣品采集、制備與分析和評(píng)價(jià)方法。本文件適用于福建茶園土壤質(zhì)量的安全評(píng)估、等級(jí)劃分及茶園種植管理相關(guān)的土壤質(zhì)量管控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB15618土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)GB20287-2006農(nóng)用微生物菌劑GB/T33469耕地質(zhì)量等級(jí)GB/T22105.1土壤質(zhì)量總汞、總砷、總鉛的測(cè)定原子熒光法第1部分：土壤中總汞的測(cè)定GB/T22105.2土壤質(zhì)量總汞、總砷、總鉛的測(cè)定原子熒光法第2部分：土壤中總砷的測(cè)定GB/T17141土壤質(zhì)量鉛、鎘的測(cè)定石墨爐原子吸收分光光度法GB/T14550土壤質(zhì)量六六六和滴滴涕的測(cè)定氣相色譜法GB/T14552水、土中有機(jī)磷農(nóng)藥測(cè)定的氣相色譜法HJ491土壤和沉積物銅、鋅、鉛、鎳、鉻的測(cè)定火焰原子吸收分光光度法LY/T1228森林土壤水解性氮的測(cè)定NY/T853茶葉產(chǎn)地環(huán)境技術(shù)條件NY/T87土壤全鉀測(cè)定法NY/T88土壤全磷測(cè)定法NY/T889土壤速效鉀和緩效鉀含量的測(cè)定NY/T1121.1土壤檢測(cè)第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存NY/T1121.2土壤檢測(cè)第2部分：土壤pH的測(cè)定NY/T1121.4土壤檢測(cè)第4部分：土壤容重的測(cè)定NY/T1121.6土壤檢測(cè)第6部分：土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定NY/T1121.7土壤檢測(cè)第7部分：土壤有效磷的測(cè)定NY/T1121.24土壤檢測(cè)第24部分：土壤全氮的測(cè)定自動(dòng)定氮儀法NY/T295中性土壤陽(yáng)離子交換量和交換性鹽基的測(cè)定NY/T1616土壤中9種磺酰脲類除草劑殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1茶園土壤指用于茶樹(shù)種植的耕作層土壤（0～40cm土層包括現(xiàn)有茶園土壤、規(guī)劃新建茶園待開(kāi)發(fā)土壤及周邊關(guān)聯(lián)土壤區(qū)域。3.2茶園土壤質(zhì)量在茶園生態(tài)系統(tǒng)邊界內(nèi)保持茶樹(shù)生產(chǎn)力、維持環(huán)境質(zhì)量、促進(jìn)動(dòng)植物健康的能力。3.3茶園土壤污染物指存在于茶園土壤中，對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)、茶葉品質(zhì)及人體健康可能產(chǎn)生不利影響的元素，包括砷（As）、有機(jī)磷農(nóng)藥、磺酰脲類除草劑。3.4茶園土壤肥力指標(biāo)表征茶園土壤提供養(yǎng)分能力的參數(shù)，包括有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效氮、有效磷、速效鉀、堿解氮、銅、鋅、錳等中微量元素含量及陽(yáng)離子交換量。3.5茶園特征微生物指與茶園土壤肥力水平、酸化程度及污染狀況密切相關(guān)的特征微生物類群，包括功能細(xì)菌和真菌群落，其豐度及多樣性可反映土壤生態(tài)功能狀態(tài)。4評(píng)價(jià)對(duì)象4.1基本要求：茶園環(huán)境符合NY/T853要求。4.2土壤無(wú)機(jī)污染物指標(biāo)4.3土壤有機(jī)污染物指標(biāo)六六六、滴滴涕、有機(jī)磷農(nóng)藥、磺酰脲類除草劑。4.4土壤化學(xué)肥力指標(biāo)有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、全鉀、速效鉀、pH值、陽(yáng)離子交換量。4.5土壤肥力微生物學(xué)指標(biāo)soilfertilitymicrobialindex土壤微生物數(shù)量、土壤微生物量碳、土壤微生物量氮、土壤酶活性等土壤微生物學(xué)指標(biāo)。5樣品采集、制備與分析5.5樣品采集茶園土壤樣品采集時(shí)間為秋茶采摘后基肥施用前的10月-12月，應(yīng)避開(kāi)降雨天氣、以及施肥和灌溉等管理時(shí)期。采樣應(yīng)符合NY/T1121.1的規(guī)定。5.6樣品制備茶園土壤樣品去除石礫和植物殘根等雜物，分裝3份，2份置于4℃冰箱保存，分別用于測(cè)定土壤有機(jī)污染物含量及土壤微生物學(xué)肥力指標(biāo)；另1份風(fēng)干后用于測(cè)定土壤化學(xué)肥力指標(biāo)和土壤無(wú)機(jī)污染物含量。5.7樣品分析5.7.1土壤無(wú)機(jī)污染物的分析方法按表1的規(guī)定進(jìn)行。表1土壤污染物分析方法污染物單位檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)號(hào)砷mg/kgGB/T22105.2鎘mg/kgGB/T17141鉛mg/kgGB/T17141汞mg/kgGB/T22105.1鉻mg/kgHJ491鎳mg/kgHJ491銅mg/kgHJ491鋅mg/kgHJ491氟mg/kgNY/T3955.7.2土壤有機(jī)污染物的分析方法按表2的規(guī)定進(jìn)行。表2土壤有機(jī)污染物分析方法污染物單位檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)號(hào)六六六總量mg/kgGB/T14550滴滴涕總量mg/kgGB/T14550有機(jī)磷農(nóng)藥mg/kgGB/T14552磺酰脲類除草劑mg/kgNY/T16165.7.3化學(xué)肥力指標(biāo)測(cè)定檢測(cè)方法按表3執(zhí)行。表3土壤化學(xué)肥力指標(biāo)檢測(cè)方法指標(biāo)名稱單位檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)號(hào)pH值-NY/T395土壤全氮g/kgNY/T1121.24土壤全磷g/kg土壤全鉀g/kg土壤有機(jī)質(zhì)g/kgNY/T1121.6土壤水解性氮mg/kg土壤有效磷mg/kgNY/T1121.7土壤速效鉀mg/kgNY/T889陽(yáng)離子交換量cmol/kgNY/T2955.7.4微生物學(xué)肥力指標(biāo)測(cè)定微生物數(shù)量：土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法，按照GB20287中6.3.2的規(guī)定進(jìn)行，換算成每克干土所含的菌落數(shù)。微生物量碳：測(cè)定方法見(jiàn)附錄A。微生物量氮：測(cè)定方法見(jiàn)附錄B。土壤酶活性：測(cè)定脲酶、過(guò)氧化氫酶、磷酸酶、蔗糖酶活性，方法見(jiàn)附錄C。6評(píng)價(jià)方法6.1單一指標(biāo)評(píng)價(jià)6.1.1土壤污染物指標(biāo)評(píng)價(jià)方法按表3執(zhí)行。表4不同質(zhì)量茶園土壤污染物含量分級(jí)評(píng)價(jià)等級(jí)高中低砷（mg/kg）<1010～40>40鎘（mg/kg）<0.20.2～0.3>0.3鉻（mg/kg）<9090～150>150汞（mg/kg）<0.150.15～0.3>0.3鉛（mg/kg）<5050～100>100鎳（mg/kg）<4040～80>80銅（mg/kg）<3030～50>50鋅（mg/kg）<100100～200>200氟（mg/kg）<400400～1200>1200六六六總量（mg/kg）<0.010.01～0.1>0.1滴滴涕總量（mg/kg）<0.010.01～0.1>0.1有機(jī)磷農(nóng)藥（mg/kg）<0.10.1～0.5>0.5磺酰脲類除草劑（mg/kg）<0.10.1～0.5>化學(xué)肥力指標(biāo)評(píng)價(jià)方法按表4執(zhí)行。表5茶園土壤化學(xué)肥力指標(biāo)分級(jí)評(píng)價(jià)等級(jí)高中低pH4.5～5.54.0～4.5或5.5～6.5<4.0或＞6.5有機(jī)質(zhì)（g/kg）>1510～15<10總氮（g/kg）>1.00.8～1.0<0.8水解氮（mg/kg）>10050～100<50全磷（g/kg）>0.60.4～0.6<0.4有效磷（mg/kg）>105～10<5全鉀（g/kg）>105～10<5速效鉀（mg/kg）>12080～120<80陽(yáng)離子交換量（cmol/kg）>1510～15<106.1.3微生物學(xué)肥力指標(biāo)微生物數(shù)量參考值見(jiàn)表5。表5不同質(zhì)量茶園土壤微生物數(shù)量參考值微生物數(shù)量/Log（CFU/g干土）質(zhì)量水平低中高細(xì)菌<6.06.0～9.0>9.0真菌<3.03.0～5.0>5.0微生物量碳、氮參考值見(jiàn)表6。表6不同質(zhì)量茶園土壤微生物量碳、氮參考值微生物量質(zhì)量水平低中高微生物量碳/（mg/kg）<150150～300>300微生物量氮/（mg/kg）<2020～40>40土壤酶活性參考值見(jiàn)表7。表7不同質(zhì)量茶園土壤酶活性參考值酶活性質(zhì)量水平低中高脲酶/（mg/g/24h）<30.030.0~60.0>60.0過(guò)氧化氫酶/（mL/g干土）<5.05.0~6.0>6.0<0.50.5~1.5>1.5蔗糖酶/（mL/g干土）<6.06.0~10.0>10.06.2綜合質(zhì)量判定6.2.2若茶園土壤中任一污染物含量分級(jí)質(zhì)量為“低”，直接判定為“低”；6.2.3茶園土壤污染物含量質(zhì)量為“中”或“高”時(shí)，按以下規(guī)則判定：高級(jí)：污染物含量分級(jí)為高，化學(xué)肥力指標(biāo)分級(jí)中，80%以上指標(biāo)是屬“高”，微生物學(xué)肥力指標(biāo)均為“高”；中級(jí)：污染物含量分級(jí)為中，化學(xué)肥力指標(biāo)分級(jí)中，60%以上指標(biāo)是屬“高”，微生物學(xué)肥力指標(biāo)低級(jí)：不符合上述條件。附錄A（資料性附錄）土壤微生物量碳的測(cè)定A.1原理新鮮土壤經(jīng)氯仿熏蒸后（24h壤微生物死亡細(xì)胞發(fā)生裂解,釋放出的微生物量碳通過(guò)0.5mol/LK2SO4溶液提取后，用重鉻酸鉀－硫酸溶液進(jìn)行氧化。反應(yīng)結(jié)束后，用硫酸亞鐵來(lái)滴定剩余的重鉻酸鉀，根據(jù)所消耗的重鉻酸鉀量，計(jì)算得到有機(jī)碳量。根據(jù)熏蒸土壤和未熏蒸土壤測(cè)定有機(jī)碳量的差值及轉(zhuǎn)換系數(shù)(kEC)，從而計(jì)算土壤微生物量碳含量?A.2設(shè)備和材料A.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。A.2.2真空干燥器：直徑22cm。A.2.3聚乙烯離心管：200mL。A.2.4消化管：150mL，24mm×295mm。A.2.5冰箱：-20℃和4℃。A.2.6水泵抽真空裝置。A.2.7油浴消化裝置：包括油浴鍋和鐵絲網(wǎng)。A.2.8可調(diào)溫電爐：2000℃±1℃。A.2.9燒杯：15mL、25mLA.2.10聚乙烯離心管：80mLA.3試劑A.3.1無(wú)乙醇氯仿（CHCl3）普通氯仿試劑一般含有少量乙醇作為穩(wěn)定劑，使用前需除去。將氯仿試劑與蒸餾水按1:2（體積比）一起放入分液漏斗中，充分搖動(dòng)1min，慢慢放出底層氯仿于燒杯中，重復(fù)洗滌3次。得到的無(wú)乙醇氯仿加入無(wú)水氯化鈣，以除去氯仿中的水分。純化后的氯仿置于暗色試劑瓶中，避光保存于4℃冰箱中。注意氯仿具有致癌作用，必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作。A.3.2硫酸鉀（0.5mol/L）溶液稱取硫酸鉀（K2SO4）87.10g溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。A.3.3重鉻酸鉀（0.2000mol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取經(jīng)130℃烘干的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）9.8110g溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。A.3.4重鉻酸鉀（0.1000mol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取經(jīng)130℃烘干的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）4.9055g溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。A.3.5硫酸亞鐵（0.05mol/L）溶液稱取13.9005g硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O，化學(xué)純）溶于800mL蒸餾水中，慢慢加入濃硫酸5mL，在用蒸餾水稀釋至1000mL，保存于棕色試劑瓶中。mL三角瓶中，加5mL濃硫酸和2滴鄰啡啰啉指示劑，用硫酸亞鐵溶液滴定至終點(diǎn)，根據(jù)所消耗的硫酸亞鐵溶液量計(jì)算其準(zhǔn)確濃度,按式（A.1）計(jì)算：M=..................................................................................................................(A.1)M——硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/LC——重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/LV1——吸取的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mLV2——滴到終點(diǎn)時(shí)消耗硫酸亞鐵溶液體積，單位為毫升（mL）。A.3.6鄰啡啰啉指示劑稱取1.49g鄰啡啰啉溶于100mL0.7%分析純硫酸亞鐵溶液。密封保存于棕色試劑瓶中。A.4操作步驟A.4.1.1稱取過(guò)2mm篩的新鮮土壤20.0g于25mL燒杯中，置于真空干燥器中，同時(shí)一并放置盛有50mL無(wú)乙醇氯仿的燒杯（燒杯內(nèi)放入少量防爆沸玻璃珠）和盛有50mLNaOH溶液的燒杯（NaOH用以吸收熏蒸過(guò)程中釋放出來(lái)的CO2干燥器底部加入少量水以保持容器濕度。蓋上真空干燥器蓋子，用真空泵抽真空，使氯仿沸騰5min。關(guān)閉真空干燥器的閥門，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)24h。A.4.1.2熏蒸結(jié)束后，打開(kāi)真空干燥器閥門（應(yīng)聽(tīng)到空氣進(jìn)入重復(fù)利用）和NaOH溶液的小燒杯，清潔干燥器，反復(fù)抽真空（5次或6次，每次3min，每次抽真空作為不熏蒸對(duì)照處理。A.4.1.3從干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土壤，將土壤完全轉(zhuǎn)移到200mL聚乙烯離心管中，加入80mL0.5mol/L硫酸鉀溶液，300r/min振蕩30min，用中速定量濾紙過(guò)濾。同時(shí)做3個(gè)無(wú)土壤基質(zhì)空白。土壤提取液最好立即分析，或-20℃冷凍保存。A.4.2測(cè)定吸取上述10mL土壤提取液于150mL消化管中，加入5mL重鉻酸鉀溶液（0.2000mol/L）、濃硫酸5mL，再加入3片或4片經(jīng)濃鹽酸浸泡過(guò)夜后洗滌烘干的瓷片（以防瀑混勻后置于油浴消化裝置中煮沸10min。冷卻后轉(zhuǎn)移到150mL三角瓶中，用去離子水洗滌消化管3次～5次使溶液體積約為70mL，加入2滴鄰啡啰啉指示劑，用0.05mol/L硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由橙黃色變化為藍(lán)綠色，再變?yōu)樽丶t色即滴定終點(diǎn)。A.5結(jié)果計(jì)算A.5.1有機(jī)碳量有機(jī)碳量按式（A.2）計(jì)算：A——有機(jī)碳量，單位為毫克每千克（mg/kgV0——空白消耗的FeSO4溶液體積，單位為毫升（mLV——樣品消耗的FeSO4溶液體積，單位為毫升（mLM——FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/Lf——稀釋倍數(shù)；W——烘干土壤質(zhì)量，單位為克（g12——碳原子的毫摩爾質(zhì)量；A.5.2土壤微生物量碳土壤微生物量碳按式（A.3）計(jì)算：BC——土壤微生物量碳，單位為毫克每千克（mg/kgEC——熏蒸和未熏蒸土壤有機(jī)碳量的差值，單位為毫克每千克（mg/kgkEC——轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.38。附錄B（規(guī)范性附錄）福建茶園土壤評(píng)價(jià)指標(biāo)限值（含重金屬、肥力、微生物指標(biāo)詳細(xì)限值，同6.1節(jié)表格內(nèi)容）（資料性附錄）土壤微生物量氮的測(cè)定B.1原理新鮮土壤經(jīng)氯仿熏蒸后（24h土壤微生物死亡細(xì)胞發(fā)生裂解，釋放出的α-氨基酸態(tài)氮和銨態(tài)氮通過(guò)0.5mol/LK2SO4溶液提取，提取液中α-氨基酸態(tài)氮和銨態(tài)氮與茚三酮發(fā)生反應(yīng)，形成紫藍(lán)色化合物，其形成量與NH3濃度成正相關(guān)，故用茚三酮比色法測(cè)定提取液中NH3的含量。根據(jù)熏蒸土壤和未熏蒸土壤測(cè)定有機(jī)氮量（NH4+-N）的差值及轉(zhuǎn)換系數(shù)（m計(jì)算土壤微生物生物量氮。B.2設(shè)備和材料B.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。B.2.2聚乙烯離心管：10mL。B.2.3真空干燥器：直徑22cm。B.2.4紫外分光光度計(jì)：200nm～1000nm。B.2.5水浴鍋：20℃~100℃。B.3試劑B.3.1無(wú)乙醇氯仿（BHBl3）B.3.20.05mol/L硫酸鉀（K2SO4）溶液B.3.3pH5.2的乙酸鋰（LiOH·H2O）溶液稱取氫氧化鋰（LiOH·H2O）168g，加入冰乙酸279mL，加蒸餾水稀釋至1000mL，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.2。B.3.4茚三酮溶液取150mL二甲基亞砜（B2H6OS）和乙酸鋰溶液50mL，加入4g水合茚三酮（B9H4O3·H2O）和0.12g還原茚三酮（B18H10O6·2H2O）攪拌至完全溶解。B.3.550%乙醇水溶液吸取50mL99%乙醇于100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋。B.3.61mol/L的硫酸銨［(NH4)2SO4］標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液稱取4.7167g分析純硫酸銨（稱前105℃烘2h）溶于0.5mol/L硫酸鉀溶液中，并用硫酸鉀溶液稀釋至1000mL，搖勻，于4℃冰箱中保存。B.3.70.1mol/L的硫酸銨［(NH4)2SO4］標(biāo)準(zhǔn)液搖勻。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。B.3.8工作曲線的制備分別吸取0.1mol/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸鉀溶液稀釋至100mL，搖勻，其濃度分別為0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)氮的系列溶液。B.4分析步驟B.4.1熏蒸B.4.2測(cè)定吸取0.5mL樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別置于10mL的塑料離心管中，加入2mL茚三酮顯色劑，渦旋攪拌充分混勻，置于試管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷卻，加入5mL稀釋液（50%乙醇水溶液搖勻于570nm下比色。B.5結(jié)果計(jì)算土壤微生物生物量氮按式（B.1）計(jì)算：BN=m×EN..............................................................................................................................(B.1)BN——土壤微生物生物量氮，單位為毫克每千克（mg/kgEN——熏蒸和未熏蒸土壤有機(jī)氮量的差值，單位為毫克每千克（mg/kgm——轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值5.0。附錄C（資料性附錄）土壤酶活性測(cè)定C.1土壤過(guò)氧化氫酶C.1.1原理過(guò)氧化氫酶能酶促過(guò)氧化氫分解生成分子氧和水，從而降低過(guò)土壤中氧化氫的毒害作用。土壤中過(guò)氧化氫酶的測(cè)定是根據(jù)單位時(shí)間析出的氧量或剩余的過(guò)氧化氫量來(lái)表示過(guò)氧化氫酶的活性。C.1.2設(shè)備和材料C.1.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。C.1.2.2往復(fù)式振蕩機(jī)：30r/min～300r/min。C.1.2.3滴定管：10mL。C.1.2.4三角瓶：150mL。C.1.3試劑C.1.3.1高錳酸鉀溶液[c(KMnO4)＝0.002mol/L]稱取化學(xué)純高錳酸鉀0.3161g，溶于1000mL無(wú)CO2蒸餾水中，儲(chǔ)于棕色瓶中，備用。C.1.3.20.3%H2O2按1:100將30%H2O2用水稀釋。C.1.4測(cè)定步驟稱取5g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣，置于150mL三角瓶中。注入40mL蒸餾水和5mL0.3%過(guò)氧化氫。往返式搖床上，振蕩30min。隨即注入5mL1.5mol/L硫酸以終止反應(yīng)，用致密濾紙過(guò)濾。取濾液25mL，用0.002mol/L高錳酸鉀溶液滴定至微紅色。C.1.5結(jié)果計(jì)算以單位土重消耗的0.002mol/L高錳酸鉀毫升數(shù)（對(duì)照與試驗(yàn)測(cè)定的差）表示土壤過(guò)氧化氫酶活性，A1=................................................................................................................................(C.1)A1——土壤過(guò)氧化氫酶活性，單位為毫升高錳酸鉀每克干土（mLKMnO4/g干土V——0.002mol/L高錳酸鉀毫升數(shù)，單位為毫升（mLCwt——烘干土壤重量，單位為克（g）。C.2土壤脲酶C.2.1原理土壤中脲酶能促尿素生成氨、二氧化碳和水。其中氨能與酚類化合物起反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚，顏色深度與氨含量相關(guān)，因而用于脲酶活性的測(cè)定。C.2.2設(shè)備和材料C.2.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。C.2.2.2恒溫培養(yǎng)箱：20℃~70℃。C.2.2.3往復(fù)式振蕩機(jī)：30r/min～300r/min。C.2.2.4冰箱：4℃。C.2.2.5pH計(jì)。C.2.2.6紫外分光光度計(jì)：200nm～1000nm。C.2.2.7水浴鍋：20℃~100℃。C.2.2.8容量瓶：50mL。C.2.3試劑稱取10g尿素，用蒸餾水溶至100mL。C.2.4.2檸檬酸鹽緩沖液分別稱取368g檸檬酸溶于600mL蒸餾水；295g氫氧化鉀溶于1000mL蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將pH調(diào)至6.7，用蒸餾水稀釋至2000mL。C.2.4.3苯酚鈉溶液C.溶液1：將62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，用乙醇稀釋至100mL。C.溶液2：27gNaOH溶于100mL水。將兩溶液保存在冰箱中。C.使用前將兩溶液各20mL混合，用蒸餾水稀釋至100mL。C.2.4.4次氯酸鈉溶液用蒸餾水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。C.2.4.5氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液C.稱取0.4717g硫酸銨溶于蒸餾水中并稀釋至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；C.往50mL容量瓶中分別注入1mL、2.5mL、4mL、6mL、7.5mL及9mL的氮標(biāo)準(zhǔn)液，并用蒸餾水稀釋至刻度。得到分別含有0.1mg、0.25mg、0.4mg、0.6mg、0.75mg及0.9mg的NH4+-N標(biāo)準(zhǔn)曲線。C.2.5測(cè)定步驟稱取10g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣，置于100mL容量瓶中，加2mL甲苯。甲苯處理15min后，往瓶中注入10mL10%尿素溶液和20mL檸檬酸鹽緩沖液（pH6.7仔細(xì)混合。將瓶在38℃恒溫箱中放置24h后，用加熱至38℃的蒸餾水稀釋至刻度，搖蕩，將懸液過(guò)濾。濾液備用。與此同時(shí)，對(duì)每一土樣設(shè)置用水代替基質(zhì)的對(duì)照；對(duì)整個(gè)試驗(yàn)，設(shè)置無(wú)土壤的對(duì)照，以檢驗(yàn)試劑的純度。取濾液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至10mL，然后加入4mL苯酚鈉溶液，并立即加入3mL次氯酸鈉溶液。加入每一試劑后，立即將混合物仔細(xì)混合?；旌虾?0min，將混合物體積稀釋至刻度。用1cm的比色槽，在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)578nm處，測(cè)定顏色的深度。用供試樣品所得的消光值減去對(duì)照樣品消光值的差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮量。C.2.6結(jié)果計(jì)算土壤的脲酶活性，以每百克土的NH4+-N的毫克數(shù)表示，按式（C.2）計(jì)算：A2——土壤脲酶活性，單位為毫克NH4+-N每克土［mgNH4+-N/（100g干土·24hC——土壤濾液中酶活性值，單位為毫克NH4+-N每毫升（mgNH4+-N/mLV——土壤溶液體積，單位為毫升（mLCwt——烘干土壤重量，單位為克（g）。C.3土壤磷酸酶C.3.1原理土壤磷酸酶活能酶解磷酸苯二鈉釋放出的酚，使其與氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑反應(yīng)生色。用比色法測(cè)定出游離的酚量，用以表示磷酸酶活性。C.3.2設(shè)備和材料C.3.2.1天平：感量為0.01g和0.1mg。C.3.2.2恒溫培養(yǎng)箱：20℃~70℃。C.3.2.3紫外分光光度計(jì)：200nm～1000nm。C.3.2.4水浴鍋：20℃~100℃。C.3.2.5容量瓶：100mL。C.3.3試劑C.3.3.1乙酸鹽緩沖液（pH5.0）稱取136g乙酸銨溶于700mL蒸餾水，用乙酸調(diào)節(jié)至pH5.0，用蒸餾水稀釋至1000mL。C.3.3.2檸檬酸鹽緩沖液（pH7.0）稱取300g檸檬酸鉀溶于700mL蒸餾水，用稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.0，用蒸餾水稀釋至1000mL。C.3.3.3硼酸鹽緩沖液（pH9.6與pH10.0）稱取12.404g硼酸溶于700mL蒸餾水，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)至pH10.0，用蒸餾水稀釋至1000mL。C.3.3.4磷酸二鈉溶液將6.75g苯磷酸二鈉溶液溶于蒸餾水，并稀釋至1000mL。C.3.3.6Gibbs試劑將200mg2,6-雙溴苯醌氯酰亞胺溶于乙醇，并稀釋至100mL。C.3.3.7標(biāo)準(zhǔn)溶液C.母液：1g酚溶于蒸餾水中，并稀釋至1000mL，溶液保存在暗色瓶中。C.測(cè)量前吸取5mL母液稀釋至100mL制成工作液。分別向100mL容量瓶中注入1mL、3mL、5mL、7mL、9mL、11mL工作液，分別得到0.05、0.15、0.25、0.35、0.45及0.55mg酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。C.3.4測(cè)定步驟取10g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣，置于100mL容量瓶中，用1.5mL甲苯處理。甲苯處理15min后，注入10mL苯磷酸二鈉溶液和10mL相應(yīng)的緩沖液。將反應(yīng)混合物置于38℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h熱水將瓶中內(nèi)容物稀釋至刻度，再用致密濾紙過(guò)濾。對(duì)每一土樣設(shè)置用10mL水代替基質(zhì)的對(duì)照。比色程序如下：a)取濾液1mL置于100mL容量瓶中，加入5mL相應(yīng)的緩沖液，用水稀釋至25劑。b)將反應(yīng)物仔細(xì)混合，靜置20min，這時(shí)溶液呈現(xiàn)青色。c)用水將瓶中混合物稀釋至刻度，并在24h內(nèi)，用1cm液槽，在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)578nm處測(cè)C.3.5結(jié)果計(jì)算土壤磷酸酶活性，以每克土的酚毫克數(shù)表示，按式（C.3）計(jì)算：A3=.....................................................................................................................................................(C.3)A3——土壤磷酸酶活性，單位為毫克酚每克干土［mg酚/（g干土24hC——土壤濾液中苯酚含量，單位為毫克每毫升（mg/mLV——土壤溶液體積，單位為毫升（mLC.4土壤蔗糖酶C.4.1原理蔗糖酶能水解蔗糖酶生成的葡萄糖和果糖。水解的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。C.4.2