ICS65.120

CCSB4642

湖北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB42/T1582—2020

飼料中牛、羊源性成分定性PCR檢測方法

Detectionofbovine,ovine,caprinederivedmaterialsinfeedstuffsbyqualitative

polymerasechainreaction(PCR)method

2020-07-07發(fā)布2020-11-07實施

湖北省市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

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2020

目次

前言.......................................................................................................................................................................II

1范圍...................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.......................................................................................................................................................1

4原理...................................................................................................................................................................1

5試劑和材料.......................................................................................................................................................1

6儀器和設(shè)備.......................................................................................................................................................2

7分析步驟...........................................................................................................................................................3

8結(jié)果分析...........................................................................................................................................................5

9結(jié)果判定與表述...............................................................................................................................................5

10PCR產(chǎn)物測序結(jié)果判定與表述......................................................................................................................5

11檢測過程中防止交叉污染的措施.................................................................................................................5

12廢棄物處理.....................................................................................................................................................5

附錄A（資料性）擴(kuò)增產(chǎn)物序列（來源NCBI）............................................................................................6

I

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2020

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。

本文件由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。

本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。

本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、湖北省畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心。

本文件主要起草人：劉榜，王文君，劉祖紅，金秀娥，付明，周翔，梁昱，王峻。

本文件實施中的疑問可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，聯(lián)系電話郵箱：liubang@。

對本文件的有關(guān)修改意見及建議請華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，聯(lián)系電話郵箱：

xys@。

II

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2020

飼料中牛、羊源性成分定性PCR檢測方法

1范圍

本文件規(guī)定了飼料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）源性成

分的定性PCR檢測方法。

本文件適用于飼料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）源性成

分的定性PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求

GB/T27403-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

根據(jù)牛、羊特異性序列，設(shè)計一對特異性引物，對待檢樣品提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)擴(kuò)增特異

性片段的結(jié)果，判斷待檢樣品中是否含有?；蜓蛟葱猿煞?，并可根據(jù)片段大小差異進(jìn)而判斷是牛源性成

分（125bp），還是羊源性成分（107bp）。

5試劑和材料

5.1除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682的要求。

5.2瓊脂糖。

5.3GelRed核酸染料。

注：根據(jù)需要可選擇其他效果相當(dāng)?shù)暮怂崛玖献鳛楹怂犭娪镜娜旧珓?/p>

5.410mol/L氫氧化鈉溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉（NaOH），溶解后冷卻至室溫，再

加水定容至200mL。

1

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5.50.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）：稱取18.6g乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2），加

入70mL水中，再加入適量氫氧化鈉溶液（5.4），加熱至完全溶解后，冷卻至室溫，用氫氧化鈉溶液

（5.4）調(diào)pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

5.61mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（pH8.0）：稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解

于800mL水中，用鹽酸（HCl）調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）條件下

滅菌20min。

5.75mol/L氯化鈉溶液：稱取29.22g氯化鈉（NaCl）溶于80mL水中，加水定容至100mL。在103.4

?kPa蒸汽壓（121?℃）條件下滅菌20min。

5.810%十二烷基磺酸鈉溶液：稱取10g十二烷基磺酸鈉（C12H25SO4Na，SDS），加入80mL水中，加

熱至完全溶解后，冷卻至室溫，加水定容至100mL。在103.4kPa蒸汽壓（121℃）條件下滅菌20min。

5.9DNA提取細(xì)胞裂解液：量取200mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.5），200mL三羥甲基氨基甲烷-

鹽酸溶液（5.6），40mL氯化鈉溶液（5.7），200mL十二烷基磺酸鈉溶液（5.8），混合后用水定容

至1000mL，室溫保存，備用。

5.1020?mg/mL蛋白酶K溶液：將200mg蛋白酶K（ProteinaseK）溶于9.5?mL水中，輕搖至完全

溶解后，加水定容至10mL。于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.11硼酸。

5.12Tris-飽和酚。

5.13氯仿：異戊醇(24:1)：將氯仿和異戊醇按照24:1的比例配制。

5.14無水乙醇。

5.1575%乙醇。

5.16TE緩沖液（pH8.0）：分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（5.6）和2mL乙二銨四乙

酸二鈉溶液（5.5）溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

5.175×TBE緩沖液：稱取54g三羥甲基氨基甲烷（Tris），加入27.5g硼酸，先用500mL水加熱

攪拌溶解后，加入20mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.5），用10?mol/L氫氧化鈉溶液（5.4）調(diào)pH至

8.0，然后加水定容到1000mL。使用時用水稀釋成0.5×TBE。

5.18Taq酶。

5.1910×PCR緩沖液。

5.20dNTP混合液。

5.216×DNA上樣緩沖液。

5.22DNA分子量標(biāo)記：可清楚的區(qū)分100?bp～1000?bp的DNA片段。

5.23物種特異性引物（表1）。

5.24引物溶液：用TE緩沖液（5.16）或水分別將引物稀釋到10?μmol/L。

5.25PCR產(chǎn)物回收試劑盒。

表1引物信息

引物名稱引物序列片段大小/bp

a5′-ATGGCTTAGGACCCAGCTCT-3′

上游引物牛125、

b5′-ACARa)CCAGAACCTGGATCGGA-3′

下游引物羊107

aR=A/G,簡并堿基。

6儀器和設(shè)備

2

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6.1分析天平：感量不小于0.1?mg。

6.2PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度＞1.5?℃/s，孔間溫度差異＜1.0?℃。

6.3電泳槽、電泳儀等電泳裝置。

6.4紫外透射儀。

6.5紫外分光光度計。

6.6凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。

6.7微量可調(diào)移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。

6.8渦旋振蕩器。

6.9離心機(jī)（最大離心力≥12000g）。

6.10恒溫水浴鍋。

7分析步驟

7.1樣品采集與制備

按照GB/T14699.1采樣，粉碎并充分混合均勻后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7.2DNA模板制備

7.2.1試樣DNA提取

試樣DNA提取步驟如下：

a)樣品顆粒100目時最少稱取0.05g，60目時最少稱取0.1g，20目時最少稱取0.2g；

b)稱取樣品于2mL離心管中，加入1mL細(xì)胞裂解液（5.9），然后加入30μL蛋白酶K（5.10）

溶液，混勻，56℃消化6h～10h至無明顯組織塊，4℃，12000g離心10min，取上清移

至新的2mL離心管中；

c)加入等體積的Tris-飽和酚（5.12），緩慢顛倒混勻10min，4℃，12000g離心10min，

取上清液移至新的2mL離心管中；

d)加入0.5倍體積的Tris-飽和酚（5.12）和0.5倍體積的氯仿：異戊醇（24:1）（5.13），緩

慢顛倒混勻10min，4℃，12000g離心10min；

e)取上清液移至新的2mL離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）（5.13），緩慢顛倒

混勻10min，4℃，12000g離心5min；

f)多次重復(fù)操作步驟e)，直到兩相中間不能看到明顯的變性蛋白質(zhì)為止，取上清液移至新的4mL

離心管中；

g)加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇（5.14），輕輕搖晃至絮狀沉淀析出，12000g離心5min～

10min，倒掉上清液；

h)加入1mL75%乙醇（5.15）洗滌沉淀，12000g離心3min，吸去上清液，重復(fù)1次～2次；

i)室溫下放置使殘余乙醇完全揮發(fā)，加入30μL～50μLTE緩沖液（5.16）溶解DNA沉淀，-20℃

保存DNA溶液。

7.2.2DNA質(zhì)量評估

使用紫外分光光度計對試樣DNA的質(zhì)量進(jìn)行評估，檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，滿

足以下要求則適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

a)DNA濃度為50ng/μL～1000ng/μL；

b)A260/A280比值應(yīng)在1.8～2.0之間。

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2020

7.3PCR反應(yīng)

7.3.1試樣PCR反應(yīng)

每個試樣PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行。

在PCR反應(yīng)管中按表2依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗證的、等效的定性PCR反應(yīng)

試劑盒配制反應(yīng)體系。

將PCR管放入離心機(jī)中，2000g離心1min，取出PCR管后，放入PCR儀中。

進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95?℃預(yù)變性5?min；95?℃變性30?s，62?℃退火30?s，72?℃

延伸15?s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72?℃延伸3?min；4℃降溫2min。

反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

表2PCR檢測反應(yīng)體系

試劑用量/μL終濃度

雙蒸水13.5

10×Buffer21×

dNTPs混合液（各2.5mmol/L）1.6各0.2mmol/L

5U/μLTaq酶0.10.025U/μL

10μmol/L上游引物0.40.2μmol/L

10μmol/L下游引物0.40.2μmol/L

25ng/μLDNA模板2.02.5ng/μL

總體積20.0

注：若采用定性PCR試劑盒，則按試劑盒說明書的推薦用量配制反應(yīng)體系，但正向引物和反向引物用量按表2執(zhí)行。

7.3.2對照PCR反應(yīng)

在試樣PCR反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照。

分別以牛和羊的基因組DNA作為陽性對照；以除上述目標(biāo)物種以外的常見動物的基因組DNA作為陰性

對照；以水作為空白對照。

各對照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及PCR反應(yīng)條件與試樣PCR（7.3.1）相同。

7.4PCR產(chǎn)物電泳檢測

稱量瓊脂糖（5.2）適量，加入0.5×TBE緩沖液（5.17）至終濃度為25g/L，加熱溶解，配制成瓊

脂糖溶液。每100?mL瓊脂糖溶液中加入5?μL?GelRed核酸染料（5.3），混勻，稍適冷卻后，將其倒入

電泳板上，插上梳板，室溫下凝固成凝膠后，放入含0.5×TBE緩沖液（5.17）電泳槽中，垂直向上輕輕

拔去梳板。取5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×DNA上樣緩沖液（5.21），混合后加入凝膠點(diǎn)樣孔，同時在其

中一個點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)記（5.22），接通電源，在2?V/cm～5?V/cm條件下電泳檢測。

7.5凝膠成像分析

電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增目的條帶的

片段大?。ū?），將電泳結(jié)果形成電子文件存檔。如需通過序列分析確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段是否為目的DNA

片段，按照7.6和7.7的規(guī)定執(zhí)行。

4

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2020

7.6PCR產(chǎn)物回收

按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書，回收PCR擴(kuò)增的DNA片段。

7.7PCR產(chǎn)物測序驗證

將回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，PCR擴(kuò)增引物作為測序引物，測序原理同Sanger測序法。將獲得的

序列分別與牛源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列和羊源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列(附錄A)進(jìn)行比對和結(jié)果判

定。

8結(jié)果分析

陽性對照的PCR反應(yīng)中可擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的DNA片段（分別為牛125bp、羊107bp），而陰性

對照及空白對照中均未擴(kuò)增出預(yù)期DNA片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測。

9結(jié)果判定與表述

9.1陽性結(jié)果判定與表述包括：

a)試樣中牛的特異性DNA序列得到擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與牛陽性對照的125bp大小一致，表

明樣品中檢測出牛源性成分，表述為“樣品中檢測出牛源性成分，結(jié)果為陽性”；

b)試樣中羊的特異性DNA序列得到擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與羊陽性對照的107bp大小一致，表

明樣品中檢測出羊源性成分，表述為“樣品中檢測出羊源性成分，結(jié)果為陽性”。

9.2陰性結(jié)果判定與表述包括：

a)試樣中牛的特異性DNA序列未得到擴(kuò)增，或擴(kuò)增片段大小與牛陽性對照的125bp大小不一致，

表明樣品中未檢測出牛源性成分，表述為“樣品中未檢測出牛源性成分，結(jié)果為陰性”；