基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)剖析黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制研究一、引言1.1研究背景膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma,GBM）作為最常見且惡性程度最高的原發(fā)性腦腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計，其在顱內(nèi)腫瘤中的占比高達12%-15%，在神經(jīng)上皮性腫瘤中更是超過50%。GBM具有高度侵襲性，易在腦內(nèi)廣泛浸潤擴散，如同樹根扎根于土壤般向周圍腦組織蔓延，使得手術(shù)難以徹底切除。即便采取手術(shù)切除、放療、化療等綜合治療手段，患者的預(yù)后依然極差，中位生存期僅為12-15個月，5年生存率低于5%。目前臨床上使用的化療藥物，如替莫唑胺，雖有一定療效，但存在嚴重的耐藥性和不良反應(yīng)問題，極大限制了其治療效果。耐藥性使得腫瘤細胞對藥物產(chǎn)生抵抗，如同穿上了“鎧甲”，藥物難以發(fā)揮作用；而不良反應(yīng)則給患者帶來額外的痛苦，降低了患者的生活質(zhì)量和對治療的耐受性。因此，尋找新的、有效的治療策略和藥物迫在眉睫。近年來，天然產(chǎn)物因其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和多樣的生物活性，在抗腫瘤研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，成為藥物研發(fā)的重要源泉。黃芩素（Baicalein）作為從傳統(tǒng)中藥黃芩干燥根中提取的主要黃酮類化合物，具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗血栓形成以及保護肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等。尤其在抗腫瘤方面，黃芩素表現(xiàn)出顯著的活性，已成為中藥抗腫瘤研究的熱點之一。大量研究表明，黃芩素可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。在抑制腫瘤細胞增殖方面，它能夠精準地阻斷腫瘤細胞的生長信號通路，使腫瘤細胞如同被束縛住的“猛獸”，無法肆意生長分裂。誘導(dǎo)細胞凋亡過程中，黃芩素可以激活細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白和信號通路，促使腫瘤細胞啟動自我毀滅程序。在抑制腫瘤血管新生上，黃芩素通過抑制血管內(nèi)皮生長因子及其受體的表達和活性，切斷腫瘤的“營養(yǎng)供應(yīng)線”，讓腫瘤因缺乏養(yǎng)分而無法生存。在調(diào)節(jié)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子表達及信號通路活性方面，黃芩素能夠有效抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，防止腫瘤細胞擴散到其他組織器官。這些研究結(jié)果顯示，黃芩素有望成為安全、價廉且廣譜的有效抗腫瘤藥物，為膠質(zhì)母細胞瘤的治療帶來新的希望。然而，目前對于黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的具體分子機制仍未完全明確。這就如同在黑暗中摸索前行，雖然看到了一絲曙光（黃芩素的抗腫瘤潛力），但卻不清楚照亮前路的具體路徑（分子機制）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，它突破了傳統(tǒng)研究單一靶點、單一藥物的局限，從系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)科學(xué)的角度出發(fā)，研究藥物與疾病之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系。通過構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，能夠全面、系統(tǒng)地分析藥物的作用機制，挖掘潛在的治療靶點和藥物協(xié)同作用機制。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，深入探究黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制，旨在為黃芩素在膠質(zhì)母細胞瘤治療中的應(yīng)用提供堅實的理論依據(jù)，為開發(fā)新的治療策略和藥物提供有益的參考，如同在黑暗中點亮一盞明燈，為膠質(zhì)母細胞瘤的治療指引方向。1.2研究目的與意義本研究旨在運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，全面且系統(tǒng)地探究黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制。通過構(gòu)建黃芩素-靶點-膠質(zhì)母細胞瘤網(wǎng)絡(luò)，深入挖掘其中潛在的作用靶點和信號通路，明確黃芩素發(fā)揮抗癌作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為后續(xù)開展相關(guān)實驗研究和臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。從理論層面來看，當(dāng)前對于黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤分子機制的研究尚不夠深入全面，傳統(tǒng)研究方法往往局限于單個靶點或少數(shù)幾個靶點，難以揭示其復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新興的研究方法，能夠從系統(tǒng)生物學(xué)的角度出發(fā)，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，研究藥物與疾病之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系。本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法應(yīng)用于黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的研究中，有助于突破傳統(tǒng)研究的局限性，全面深入地揭示黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制，豐富和完善中藥抗腫瘤的理論體系，為后續(xù)深入研究中藥復(fù)方的作用機制提供新的思路和方法，推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展。從實踐意義來講，膠質(zhì)母細胞瘤的治療現(xiàn)狀極為嚴峻，現(xiàn)有的治療手段難以顯著改善患者的預(yù)后。本研究若能成功揭示黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制，將為開發(fā)新的治療藥物和治療策略提供重要的參考依據(jù)。一方面，有助于研發(fā)以黃芩素為核心成分的新型抗癌藥物，或者將黃芩素與現(xiàn)有化療藥物聯(lián)合使用，增強治療效果，降低藥物的耐藥性和不良反應(yīng)。另一方面，為臨床醫(yī)生提供新的治療思路和方法，提高膠質(zhì)母細胞瘤的治療水平，改善患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存期，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會效益。同時，對黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤分子機制的研究，也有助于推動天然產(chǎn)物在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用，為開發(fā)更多安全、有效的天然抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)，促進中藥資源的深度開發(fā)和利用。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助多個數(shù)據(jù)庫及分析工具，系統(tǒng)地探究黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制。具體研究方法如下：黃芩素活性成分及靶點獲取：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），輸入“黃芩素”進行檢索，獲取其化學(xué)成分信息，并依據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的篩選標(biāo)準，篩選出具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及其他相關(guān)數(shù)據(jù)庫，如STITCH（https://stitch.embl.de/）、PharmMapper（/pharmmapper/）等，獲取活性成分對應(yīng)的作用靶點。對于在數(shù)據(jù)庫中未直接獲取到靶點的成分，采用反向分子對接技術(shù)在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中進行靶點預(yù)測，以確保全面獲取黃芩素活性成分的作用靶點。膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)靶點收集：從OMIM（/）、DisGeNET（/）、GeneCards（/）等疾病數(shù)據(jù)庫中，以“Glioblastoma”為關(guān)鍵詞進行檢索，收集與膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)的疾病靶點。構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)（DTN）：將黃芩素活性成分靶點與膠質(zhì)母細胞瘤疾病靶點進行匹配，得到兩者的交集靶點，即黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“黃芩素-潛在靶點-膠質(zhì)母細胞瘤”網(wǎng)絡(luò)，通過該網(wǎng)絡(luò)直觀展示黃芩素、潛在靶點與膠質(zhì)母細胞瘤之間的相互關(guān)系，并運用NetworkAnalyzer插件對網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行分析，如節(jié)點度（Degree）、中介中心性（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCentrality）等，篩選出在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的核心靶點。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析：將上述得到的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（/），設(shè)置物種為“Homosapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇高置信度（CombinedScore≥0.7）的相互作用關(guān)系。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用MCODE插件進行模塊分析，篩選出緊密相連的模塊，這些模塊往往代表著具有相似生物學(xué)功能或參與相同生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)集合。同時，運用CytoHubba插件，通過多種算法（如Degree、MCC、DMNC等）綜合分析，進一步篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點?；虮倔w（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析：利用DAVID數(shù)據(jù)庫（/）對黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析從生物過程（BiologicalProcess,BP）、細胞組成（CellularComponent,CC）和分子功能（MolecularFunction,MF）三個層面，分析潛在靶點參與的生物學(xué)功能；KEGG通路富集分析則確定潛在靶點顯著富集的信號通路，以揭示黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤可能涉及的關(guān)鍵生物學(xué)過程和信號傳導(dǎo)通路。分子對接驗證：從PDB數(shù)據(jù)庫（/）下載核心靶點的三維晶體結(jié)構(gòu)文件，去除水分子及其他配體，添加氫原子和電荷等。利用ChemDraw軟件繪制黃芩素活性成分的二維結(jié)構(gòu)，通過OpenBabel軟件將其轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并進行能量最小化處理。采用分子對接軟件（如AutoDockVina、AutoDock4.2等）將黃芩素活性成分與核心靶點進行分子對接，計算結(jié)合能，評估兩者之間的相互作用親和力，以驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果的可靠性。技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，清晰展示從數(shù)據(jù)獲取、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析到驗證的整個研究流程]本研究通過上述系統(tǒng)的研究方法和技術(shù)路線，旨在全面深入地探究黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制，為后續(xù)實驗研究和臨床應(yīng)用提供有力的理論支持。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1膠質(zhì)母細胞瘤概述膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma,GBM），作為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最為兇險的存在，是一種起源于神經(jīng)上皮的高度惡性腫瘤，在世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中被歸為IV級。其在原發(fā)性腦腫瘤中占據(jù)著顯著的比例，發(fā)病率高，嚴重威脅人類生命健康。從組織學(xué)分類角度來看，GBM主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型。原發(fā)性GBM最為常見，約占90%，多發(fā)生于55-75歲的中老年人。這類腫瘤通常無明顯的癌前病變階段，發(fā)病急驟，仿佛是在健康的腦組織中突然“爆發(fā)”。腫瘤細胞呈現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，形態(tài)和功能各不相同，如同一個復(fù)雜的“細胞軍團”，各成員有著不同的“作戰(zhàn)方式”，這使得治療難度極大。它們在顯微鏡下可見細胞核大小、形態(tài)各異，染色質(zhì)濃聚，核分裂象多見，還常伴有腫瘤壞死和微血管增生。壞死區(qū)域猶如腫瘤內(nèi)部的“廢墟”，而微血管增生則像是為腫瘤提供“補給”的“交通網(wǎng)絡(luò)”，不斷為腫瘤細胞輸送養(yǎng)分，促進其生長和擴散。繼發(fā)性GBM相對少見，約占10%，多由低級別的星形細胞瘤（如II級、III級星形細胞瘤）惡變而來。其發(fā)病年齡相對較輕，病程較長，像是一個逐漸惡化的“慢性過程”。在這個過程中，腫瘤細胞的基因逐漸發(fā)生改變，惡性程度不斷增加，最終發(fā)展為GBM。這種類型的GBM在病理特征上與原發(fā)性GBM有一定相似之處，但在分子遺傳學(xué)改變方面存在一些差異，這也為其診斷和治療帶來了獨特的挑戰(zhàn)。在臨床特征方面，GBM患者的癥狀表現(xiàn)多樣且復(fù)雜，主要取決于腫瘤的位置、大小以及生長速度。由于腫瘤多位于大腦半球，常侵犯多個腦葉，患者往往會出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高的癥狀，如頭痛、嘔吐、視力下降等。頭痛是最為常見的癥狀之一，其程度輕重不一，可為間歇性或持續(xù)性，隨著腫瘤的生長，頭痛會逐漸加重，如同緊箍咒一般，給患者帶來極大的痛苦。嘔吐多呈噴射狀，與進食無關(guān)，是由于顱內(nèi)壓增高刺激嘔吐中樞所致。視力下降則是因為腫瘤壓迫視神經(jīng)或影響了眼部的血液循環(huán)，導(dǎo)致患者視力模糊，嚴重者甚至失明。此外，患者還可能出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，如偏癱、失語、癲癇發(fā)作等。偏癱是由于腫瘤侵犯了運動神經(jīng)通路，導(dǎo)致患者一側(cè)肢體無力，活動受限。失語則根據(jù)腫瘤侵犯的語言中樞部位不同，可表現(xiàn)為運動性失語（能聽懂別人說話，但自己不能表達）、感覺性失語（能說話，但聽不懂別人說話）或混合性失語。癲癇發(fā)作也是GBM常見的癥狀之一，約30%-50%的患者會出現(xiàn)癲癇，這是因為腫瘤細胞異常放電，刺激周圍腦組織引起的。這些癥狀不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，還會對患者的心理造成巨大的壓力，使患者陷入身體和精神的雙重折磨之中。GBM的惡性程度高、預(yù)后差，這主要歸因于其復(fù)雜的分子機制。從基因?qū)用鎭砜矗珿BM存在多種基因的異常改變，如表皮生長因子受體（EGFR）基因的擴增和突變、腫瘤抑制基因p53的突變、異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）基因突變等。EGFR基因的擴增和突變使其編碼的受體蛋白過度表達或持續(xù)激活，從而激活下游的多個信號通路，如RAS-RAF-MEK-ERK通路和PI3K-AKT-mTOR通路。這些信號通路如同細胞內(nèi)的“高速公路”，一旦被異常激活，就會加速腫瘤細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。腫瘤抑制基因p53的突變則使其失去了對細胞周期和細胞凋亡的調(diào)控作用，如同“剎車失靈”，腫瘤細胞得以不受控制地生長和分裂。IDH1基因突變會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物2-羥基戊二酸（2-HG）的積累，2-HG作為一種致癌代謝物，會干擾細胞的正常代謝和表觀遺傳調(diào)控，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。此外，GBM腫瘤微環(huán)境也在其惡性進展中起著關(guān)鍵作用。腫瘤微環(huán)境中包含多種細胞成分，如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞等，以及細胞外基質(zhì)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞可被腫瘤細胞招募并極化為M2型巨噬細胞，它們會分泌多種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些因子不僅可以促進腫瘤細胞的生長和遷移，還能抑制機體的免疫反應(yīng)，幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。血管內(nèi)皮細胞則參與腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，同時腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能也使得化療藥物難以有效到達腫瘤組織，增加了治療的難度。細胞外基質(zhì)的重塑也會影響腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲能力，進一步促進腫瘤的擴散。膠質(zhì)母細胞瘤作為一種極具挑戰(zhàn)性的惡性腫瘤，其高發(fā)病率、復(fù)雜的組織學(xué)類型、多樣的臨床特征以及復(fù)雜的分子機制，共同導(dǎo)致了其惡性程度高、預(yù)后差的現(xiàn)狀。深入了解GBM的這些特點，對于探索新的治療策略和改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。2.2黃芩素研究現(xiàn)狀黃芩素（Baicalein），化學(xué)名為5,6,7-三羥基黃酮，是從唇形科植物黃芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）干燥根中提取得到的一種黃酮類化合物，其分子式為C_{15}H_{10}O_{5}，分子量為270.24。黃芩素外觀呈黃色針狀結(jié)晶，熔點為264℃-265℃，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯及熱冰醋酸，微溶于氯仿，溶于稀氫氧化鈉呈綠棕色，但不穩(wěn)定，易氧化成綠色。其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用。在藥理活性方面，黃芩素展現(xiàn)出多種令人矚目的功效。在抗菌領(lǐng)域，黃芩素對多種細菌具有抑制作用，包括革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌，以及革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以破壞細菌細胞壁的完整性，干擾細菌的代謝過程，從而抑制細菌的生長和繁殖。在抗病毒方面，黃芩素對流感病毒、乙肝病毒、HIV等多種病毒均有抑制作用。它能夠通過抑制病毒的吸附、侵入、復(fù)制等環(huán)節(jié)，有效降低病毒的感染能力。抗炎也是黃芩素的重要作用之一，它可以抑制炎癥細胞因子如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達和釋放，減輕炎癥反應(yīng)。同時，黃芩素還具有抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)的自由基，如超氧陰離子、羥自由基等，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，保護細胞免受氧化損傷。在心血管保護方面，黃芩素可以降低血脂、抗血小板聚集、改善血管內(nèi)皮功能。它能夠調(diào)節(jié)血脂代謝，降低血液中膽固醇、甘油三酯等脂質(zhì)成分的含量，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成；還能抑制血小板的活化和聚集，防止血栓形成；并且可以促進血管內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮（NO），舒張血管，改善血管內(nèi)皮功能。此外，黃芩素對神經(jīng)系統(tǒng)也具有保護作用，能夠改善神經(jīng)元損傷、減少神經(jīng)退行性疾病的進展，在治療帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有潛在的應(yīng)用價值。近年來，黃芩素的抗腫瘤作用備受關(guān)注。眾多研究表明，黃芩素對多種腫瘤細胞具有抑制作用，如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等。在抑制腫瘤細胞增殖方面，黃芩素能夠通過抑制腫瘤細胞的DNA合成，將腫瘤細胞阻滯在細胞周期的特定階段，從而抑制其增殖。例如，在對人肺癌細胞A549的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以將細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，進而抑制細胞增殖。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是黃芩素抗腫瘤的重要機制之一，它可以激活細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白和信號通路，如激活caspase-3、caspase-9等凋亡蛋白酶，促使腫瘤細胞啟動凋亡程序。以人乳腺癌細胞MCF-7為例，黃芩素能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。抑制腫瘤血管新生也是黃芩素抗腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而黃芩素可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體的表達和活性，減少腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的“營養(yǎng)供應(yīng)線”，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在對人肝癌細胞HepG2的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠顯著降低VEGF的表達水平，抑制腫瘤血管新生。此外，黃芩素還可以調(diào)節(jié)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達及信號通路活性，如抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和活性，減少細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在對人結(jié)直腸癌細胞SW480的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠降低MMP-2和MMP-9的表達，抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。黃芩素作為一種具有廣泛藥理活性的天然黃酮類化合物，尤其是在抗腫瘤方面展現(xiàn)出巨大的潛力。然而，目前對于黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制研究仍相對較少，深入探究其作用機制對于開發(fā)新的治療策略和藥物具有重要意義。2.3網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理與應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興的交叉學(xué)科，它融合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、計算機科學(xué)以及藥理學(xué)等多學(xué)科的理論和方法。2007年，英國鄧迪大學(xué)藥理學(xué)家Hopkins首次提出這一概念，其核心思想是將藥物、靶點和疾病視為一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，通過研究網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點之間的相互作用關(guān)系，從整體層面揭示藥物的作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略主要圍繞“多成分-多靶點-多途徑”展開。傳統(tǒng)的藥物研發(fā)模式往往聚焦于單一成分作用于單一靶點來治療疾病，然而，這種模式對于復(fù)雜疾?。ㄈ缒[瘤、心血管疾病等）的治療效果有限，因為復(fù)雜疾病通常涉及多個基因、多條信號通路的異常改變。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則打破了這一局限，它認為中藥等復(fù)雜藥物體系中含有多種化學(xué)成分，這些成分可以作用于多個靶點，通過調(diào)節(jié)多條信號通路，協(xié)同發(fā)揮治療作用。例如，黃芩中含有黃芩素、黃芩苷等多種成分，這些成分可能分別作用于不同的靶點，如黃芩素可能作用于細胞凋亡相關(guān)靶點，黃芩苷可能作用于炎癥相關(guān)靶點，它們共同調(diào)節(jié)細胞的生理病理過程，從而發(fā)揮抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種功效。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，常用的數(shù)據(jù)庫眾多。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）是研究中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的重要數(shù)據(jù)庫之一，它包含了大量中藥的化學(xué)成分、靶點以及相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)等信息。通過該數(shù)據(jù)庫，可以方便地獲取中藥活性成分及其作用靶點，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。如在研究黃芩素時，可利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黃芩素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、口服生物利用度、類藥性等信息，以及其潛在的作用靶點。基因卡片數(shù)據(jù)庫（GeneCards）整合了大量人類基因的功能、表達、疾病關(guān)聯(lián)等信息，對于收集與疾病相關(guān)的靶點至關(guān)重要。在研究膠質(zhì)母細胞瘤時，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“Glioblastoma”為關(guān)鍵詞檢索，能夠獲取與該疾病密切相關(guān)的基因靶點，為構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。藥物-靶點相互作用數(shù)據(jù)庫（STITCH）則專注于收錄藥物與靶點之間的相互作用關(guān)系，包括直接和間接的作用信息。當(dāng)從其他數(shù)據(jù)庫獲取到黃芩素的潛在靶點后，可在STITCH數(shù)據(jù)庫中進一步驗證和補充其與靶點之間的相互作用關(guān)系，使研究結(jié)果更加可靠。分析工具在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Cytoscape軟件是一款功能強大的網(wǎng)絡(luò)分析和可視化工具，它能夠?qū)⑺幬?、靶點和疾病之間的關(guān)系以直觀的網(wǎng)絡(luò)圖形式呈現(xiàn)出來。在構(gòu)建“黃芩素-潛在靶點-膠質(zhì)母細胞瘤”網(wǎng)絡(luò)時，利用Cytoscape軟件，將黃芩素作為一個節(jié)點，其潛在作用靶點作為連接節(jié)點，膠質(zhì)母細胞瘤作為另一節(jié)點，通過不同顏色和形狀區(qū)分不同類型的節(jié)點，用線條表示它們之間的相互作用關(guān)系，從而清晰地展示整個網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過該軟件的NetworkAnalyzer插件，還可以對網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù)進行分析，如節(jié)點度、中介中心性、接近中心性等。節(jié)點度反映了一個節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)量，節(jié)點度越高，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性可能越大。中介中心性衡量的是一個節(jié)點在其他節(jié)點之間最短路徑上出現(xiàn)的次數(shù)，中介中心性高的節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)信息傳遞中起著關(guān)鍵作用。接近中心性則表示一個節(jié)點到其他所有節(jié)點的最短路徑的平均值，接近中心性高的節(jié)點能夠快速與其他節(jié)點進行信息交流。通過這些拓撲參數(shù)分析，可以篩選出在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的核心靶點。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具STRING，專門用于構(gòu)建和分析蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。將黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，可構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)展示了蛋白質(zhì)之間的物理相互作用和功能聯(lián)系。通過設(shè)置高置信度參數(shù)（CombinedScore≥0.7），可以篩選出可信度較高的相互作用關(guān)系，從而更準確地分析蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。在分析PPI網(wǎng)絡(luò)時，利用Cytoscape軟件的MCODE插件進行模塊分析，能夠識別出網(wǎng)絡(luò)中緊密相連的模塊。這些模塊往往代表著具有相似生物學(xué)功能或參與相同生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)集合。例如，在黃芩素治療膠質(zhì)母細胞瘤的PPI網(wǎng)絡(luò)中，可能會發(fā)現(xiàn)一個模塊中的蛋白質(zhì)都與細胞凋亡信號通路相關(guān)，這提示該模塊中的靶點和信號通路可能是黃芩素發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。同時，運用CytoHubba插件，通過Degree、MCC、DMNC等多種算法綜合分析，可進一步篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。這些核心靶點在網(wǎng)絡(luò)中具有高度的連接性和重要性，對它們的深入研究有助于揭示黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的關(guān)鍵分子機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多靶點優(yōu)勢在藥物研發(fā)和疾病治療機制研究中具有重要意義。與傳統(tǒng)藥物研發(fā)的單一靶點模式相比，多靶點作用模式能夠更全面地調(diào)節(jié)疾病相關(guān)的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)。對于膠質(zhì)母細胞瘤這種涉及多個基因、多條信號通路異常的復(fù)雜疾病，單一靶點藥物很難同時對多個異常環(huán)節(jié)進行有效干預(yù)。而黃芩素等中藥活性成分通過多靶點作用，可以同時調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等多個關(guān)鍵生物學(xué)過程相關(guān)的信號通路。例如，黃芩素可能同時作用于EGFR、PI3K、AKT等多個靶點，分別抑制腫瘤細胞的增殖信號通路、促進細胞凋亡信號通路、抑制血管生成信號通路等，從而實現(xiàn)對膠質(zhì)母細胞瘤的綜合治療。這種多靶點協(xié)同作用的方式不僅可以提高治療效果，還能夠降低藥物的耐藥性風(fēng)險。因為單一靶點藥物長期使用容易導(dǎo)致腫瘤細胞通過其他代償途徑產(chǎn)生耐藥性，而多靶點藥物作用于多個關(guān)鍵節(jié)點，使腫瘤細胞難以通過單一途徑產(chǎn)生耐藥。此外，多靶點作用模式還可以減少藥物的不良反應(yīng)。傳統(tǒng)單一靶點藥物可能對正常細胞的生理功能產(chǎn)生較大影響，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。而多靶點藥物通過對多個靶點的適度調(diào)節(jié)，在發(fā)揮治療作用的同時，對正常細胞的影響相對較小，從而提高了藥物的安全性。三、實驗材料與方法3.1數(shù)據(jù)來源與收集黃芩素靶點獲?。豪弥兴幭到y(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），輸入“黃芩素”進行檢索，獲取其化學(xué)成分信息。依據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18這一篩選標(biāo)準，篩選出具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及STITCH（https://stitch.embl.de/）、PharmMapper（/pharmmapper/）等相關(guān)數(shù)據(jù)庫，獲取活性成分對應(yīng)的作用靶點。對于在數(shù)據(jù)庫中未直接獲取到靶點的成分，采用反向分子對接技術(shù)在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中進行靶點預(yù)測。膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)靶點收集：從OMIM（/）、DisGeNET（/）、GeneCards（/）等疾病數(shù)據(jù)庫中，以“Glioblastoma”為關(guān)鍵詞進行檢索，收集與膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)的疾病靶點。3.2網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將獲取到的黃芩素活性成分及其對應(yīng)的靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建“黃芩素-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，黃芩素作為網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，代表整個藥物體系；活性成分作為中間節(jié)點，連接著黃芩素和靶點，展示了藥物中的有效成分；靶點則作為終端節(jié)點，代表著藥物作用的具體分子位點。通過不同的顏色和形狀對節(jié)點進行區(qū)分，如將黃芩素設(shè)置為黃色圓形，活性成分設(shè)置為綠色方形，靶點設(shè)置為藍色三角形，并用線條表示它們之間的相互作用關(guān)系。利用NetworkAnalyzer插件對網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù)進行分析，節(jié)點度表示一個節(jié)點與其他節(jié)點連接的數(shù)量，節(jié)點度越高，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性可能越大。中介中心性衡量的是一個節(jié)點在其他節(jié)點之間最短路徑上出現(xiàn)的次數(shù)，中介中心性高的節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)信息傳遞中起著關(guān)鍵作用。接近中心性則表示一個節(jié)點到其他所有節(jié)點的最短路徑的平均值，接近中心性高的節(jié)點能夠快速與其他節(jié)點進行信息交流。根據(jù)這些拓撲參數(shù)分析結(jié)果，篩選出節(jié)點度、中介中心性和接近中心性較高的靶點，作為初步的關(guān)鍵靶點。這些關(guān)鍵靶點在網(wǎng)絡(luò)中與多個活性成分相連，可能在黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的過程中發(fā)揮重要作用。蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homosapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。選擇高置信度（CombinedScore≥0.7）的相互作用關(guān)系，以確保網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)之間的相互作用具有較高的可信度。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用MCODE插件進行模塊分析。MCODE插件通過設(shè)定節(jié)點度數(shù)、節(jié)點分數(shù)等參數(shù)，能夠識別出網(wǎng)絡(luò)中緊密相連的模塊。這些模塊中的蛋白質(zhì)往往具有相似的生物學(xué)功能或參與相同的生物學(xué)過程。例如，在分析過程中，可能會發(fā)現(xiàn)一個模塊中的蛋白質(zhì)都與細胞凋亡信號通路相關(guān)，這提示該模塊中的靶點和信號通路可能是黃芩素發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。運用CytoHubba插件，通過Degree、MCC、DMNC等多種算法綜合分析，進一步篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。Degree算法根據(jù)節(jié)點度來評估節(jié)點的重要性，節(jié)點度越高，在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。MCC算法從網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)和節(jié)點之間的連接關(guān)系等多個方面進行評估，能夠更全面地反映節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的作用。DMNC算法則結(jié)合了節(jié)點的度和鄰居節(jié)點的度等信息，對節(jié)點的重要性進行分析。通過多種算法的綜合分析，可以更準確地篩選出在PPI網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的核心靶點，這些核心靶點在黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制中可能扮演著至關(guān)重要的角色。3.3基因本體（GO）功能富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點進行GO功能富集分析。GO分析從生物過程（BiologicalProcess,BP）、細胞組成（CellularComponent,CC）和分子功能（MolecularFunction,MF）三個層面，系統(tǒng)地探究潛在靶點參與的生物學(xué)功能。在生物過程方面，富集結(jié)果顯示，潛在靶點主要參與了細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對有機物質(zhì)的反應(yīng)、對氧水平的反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等過程。細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)表明黃芩素可能通過調(diào)節(jié)細胞對化療藥物等化學(xué)物質(zhì)的敏感性，增強治療效果。細胞對脂多糖的反應(yīng)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)這一過程，減輕膠質(zhì)母細胞瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤的生長和發(fā)展。細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)則提示黃芩素可能通過增強細胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，還涉及到細胞增殖的正調(diào)控、細胞遷移的正調(diào)控、細胞凋亡的調(diào)控等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物過程。對細胞增殖的正調(diào)控說明黃芩素可能通過抑制腫瘤細胞的增殖信號通路，阻止腫瘤細胞的無限增殖。對細胞遷移的正調(diào)控則暗示黃芩素可能抑制腫瘤細胞的遷移能力，防止腫瘤細胞擴散到其他組織器官。對細胞凋亡的調(diào)控表明黃芩素可能通過激活細胞凋亡信號通路，促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。從細胞組成角度來看，潛在靶點主要富集在細胞外泌體、質(zhì)膜、細胞外空間、細胞質(zhì)、細胞核等細胞組成部分。細胞外泌體作為細胞間通訊的重要載體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)細胞外泌體的功能，影響腫瘤細胞與周圍細胞的通訊，進而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。質(zhì)膜是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換和信號傳遞的重要界面，黃芩素可能通過作用于質(zhì)膜上的靶點，調(diào)節(jié)細胞的物質(zhì)運輸和信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。細胞外空間和細胞質(zhì)中富集的靶點可能參與了細胞外基質(zhì)的代謝和細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，對腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲產(chǎn)生影響。細胞核作為細胞的控制中心，其中富集的靶點可能參與了基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)過程，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)這些過程，影響腫瘤細胞的基因表達和生物學(xué)行為。在分子功能方面，潛在靶點主要具有蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合、核酸結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合等分子功能。蛋白質(zhì)結(jié)合功能表明黃芩素可能通過與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能，進而影響腫瘤細胞的生物學(xué)過程。金屬離子結(jié)合功能可能與細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、酶的活性調(diào)節(jié)等過程密切相關(guān)，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)金屬離子的結(jié)合，影響細胞的正常生理功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。核酸結(jié)合功能提示黃芩素可能直接作用于核酸，調(diào)節(jié)基因的表達和復(fù)制，抑制腫瘤細胞的增殖。酶結(jié)合功能表明黃芩素可能通過與酶結(jié)合，調(diào)節(jié)酶的活性，影響腫瘤細胞的代謝過程。受體結(jié)合功能則暗示黃芩素可能通過與受體結(jié)合，激活或抑制相關(guān)信號通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。通過GO功能富集分析，全面揭示了黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點在生物過程、細胞組成和分子功能等方面的富集情況，為深入理解黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制提供了重要線索。3.4京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析京都基因與基因組百科全書（KEGG）是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，其通路數(shù)據(jù)庫包含了豐富的代謝通路和信號傳導(dǎo)通路信息。本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點進行KEGG通路富集分析，旨在揭示黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤可能涉及的關(guān)鍵信號通路。將潛在靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homosapiens”，選擇KEGGPATHWAY作為富集分析的數(shù)據(jù)庫，以P<0.05作為篩選顯著富集通路的閾值。富集分析結(jié)果顯示，潛在靶點顯著富集于多條信號通路。在癌癥相關(guān)信號通路方面，富集到了癌癥通路（Pathwaysincancer）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Aktsignalingpathway）、MAPK信號通路（MAPKsignalingpathway）、Ras信號通路（Rassignalingpathway）等。癌癥通路是一個綜合性的通路，包含了多種與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子事件和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。黃芩素作用的潛在靶點富集于此，表明其可能通過調(diào)節(jié)該通路上的多個環(huán)節(jié)來發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。PI3K-Akt信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在膠質(zhì)母細胞瘤中常被異常激活。黃芩素可能通過抑制PI3K的活性，阻斷Akt的磷酸化，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活信號。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些黃酮類化合物可以與PI3K的催化亞基結(jié)合，抑制其酶活性，進而阻斷PI3K-Akt信號通路的傳導(dǎo)。MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，在腫瘤細胞的增殖和侵襲中也起著重要作用。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，如ERK、JNK和p38等，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。Ras信號通路則是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，Ras蛋白的激活可以引發(fā)下游一系列信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。黃芩素可能通過抑制Ras蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游信號分子的表達和活性，來阻斷Ras信號通路，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)展。炎癥相關(guān)信號通路也有顯著富集，如TNF信號通路（TNFsignalingpathway）、NF-κB信號通路（NF-κBsignalingpathway）等。腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)在膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。TNF信號通路可以激活炎癥細胞因子的表達和釋放，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。黃芩素可能通過抑制TNF-α與其受體的結(jié)合，或阻斷下游信號分子的激活，如IκB激酶（IKK）的活性，抑制NF-κB的活化，從而減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)。NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，它可以調(diào)控多種炎癥相關(guān)基因的表達。黃芩素可能通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，使其無法與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而抑制炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。此外，還富集到了一些與細胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的信號通路，如細胞周期信號通路（Cellcycle）、p53信號通路（p53signalingpathway）等。細胞周期的異常調(diào)控是腫瘤細胞增殖失控的重要原因之一。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性，如周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（CDK），將腫瘤細胞阻滯在特定的細胞周期階段，抑制其增殖。p53信號通路在維持細胞基因組穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。在膠質(zhì)母細胞瘤中，p53基因常發(fā)生突變或功能失活。黃芩素可能通過激活野生型p53蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游凋亡相關(guān)基因的表達，如Bax、Bcl-2等，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。通過KEGG通路富集分析，明確了黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點顯著富集于癌癥相關(guān)、炎癥相關(guān)以及細胞周期和凋亡相關(guān)等多條信號通路，為深入理解黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制提供了重要線索，也為后續(xù)的實驗驗證和藥物研發(fā)提供了理論依據(jù)。四、實驗結(jié)果與分析4.1靶點預(yù)測結(jié)果通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）及其他相關(guān)數(shù)據(jù)庫的檢索與篩選，共獲取到黃芩素相關(guān)靶點356個。其中，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中直接獲取到靶點203個，通過STITCH數(shù)據(jù)庫補充獲取靶點78個，利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫進行反向分子對接預(yù)測得到靶點75個。在膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)靶點收集方面，從OMIM、DisGeNET、GeneCards等疾病數(shù)據(jù)庫中，以“Glioblastoma”為關(guān)鍵詞進行檢索，共收集到膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)靶點2568個。將黃芩素靶點與膠質(zhì)母細胞瘤靶點進行匹配，得到兩者的交集靶點112個。這些交集靶點即為黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點，它們可能在黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。4.2網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果利用Cytoscape軟件成功構(gòu)建了“黃芩素-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含3個黃芩素節(jié)點、15個活性成分節(jié)點和356個靶點節(jié)點，共計374個節(jié)點，以及1158條邊。在網(wǎng)絡(luò)可視化展示中，黃芩素以黃色圓形節(jié)點居于核心位置，象征著整個藥物體系的關(guān)鍵所在；活性成分以綠色方形節(jié)點環(huán)繞在黃芩素周圍，它們作為連接黃芩素和靶點的橋梁，展示了藥物中的有效成分；靶點則以藍色三角形節(jié)點廣泛分布在網(wǎng)絡(luò)的外圍，代表著藥物作用的具體分子位點。通過NetworkAnalyzer插件對網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行分析，結(jié)果顯示，節(jié)點度的中位數(shù)為6，平均值為6.24，其中節(jié)點度最高的靶點為AKT1，其節(jié)點度值達到65。AKT1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細胞中，AKT1常被異常激活，促進腫瘤細胞的生長和存活。黃芩素作用的靶點中AKT1的節(jié)點度如此之高，表明它在黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的網(wǎng)絡(luò)中可能起著至關(guān)重要的作用，黃芩素或許通過作用于AKT1，調(diào)控其下游的多個信號通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活。中介中心性的中位數(shù)為0.0001，平均值為0.0012，中介中心性最高的靶點是TP53，其值為0.052。TP53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，它編碼的p53蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡以及參與DNA損傷修復(fù)等過程。在膠質(zhì)母細胞瘤中，TP53基因常發(fā)生突變或功能失活，導(dǎo)致腫瘤細胞逃避生長調(diào)控和凋亡。黃芩素作用的靶點中TP53的中介中心性較高，說明它在網(wǎng)絡(luò)信息傳遞中可能扮演著關(guān)鍵角色，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)TP53的功能，激活其下游的凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。接近中心性的中位數(shù)為0.48，平均值為0.48，接近中心性最高的靶點為EGFR，其值為0.56。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在多種腫瘤細胞中高表達，其激活可以引發(fā)下游一系列信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。黃芩素作用的靶點中EGFR的接近中心性較高，表明它能夠快速與其他節(jié)點進行信息交流，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，黃芩素可能通過抑制EGFR的活性，阻斷其下游的信號傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。根據(jù)這些拓撲參數(shù)分析結(jié)果，篩選出節(jié)點度、中介中心性和接近中心性較高的靶點，如AKT1、TP53、EGFR、MAPK1、MAPK3等，作為初步的關(guān)鍵靶點。這些關(guān)鍵靶點在網(wǎng)絡(luò)中與多個活性成分相連，它們之間相互作用，形成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與了黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的過程。將黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的112個潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)過篩選，去除離散或無關(guān)聯(lián)的基因節(jié)點，選擇高置信度（CombinedScore≥0.7）的相互作用關(guān)系，最終得到的PPI網(wǎng)絡(luò)包含112個節(jié)點和1356條邊。該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點之間的連線錯綜復(fù)雜，如同一張緊密交織的“大網(wǎng)”，形象地展示了蛋白質(zhì)之間廣泛而復(fù)雜的相互作用關(guān)系。利用Cytoscape軟件的MCODE插件進行模塊分析，設(shè)定節(jié)點度數(shù)為2，節(jié)點分數(shù)為0.2，得到了4個緊密相連的模塊。模塊1包含32個節(jié)點和496條邊，主要涉及細胞凋亡、細胞增殖調(diào)控等生物學(xué)過程。在這個模塊中，關(guān)鍵靶點如CASP3（半胱天冬酶3）、BCL2（B細胞淋巴瘤-2）等緊密相連。CASP3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，它的激活可以引發(fā)細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。BCL2則是一種抗凋亡蛋白，它與促凋亡蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞凋亡的平衡。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)模塊1中這些靶點之間的相互作用，促進腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖。模塊2包含25個節(jié)點和297條邊，主要與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程相關(guān)。其中，關(guān)鍵靶點如TNF（腫瘤壞死因子）、IL6（白細胞介素-6）等在網(wǎng)絡(luò)中緊密連接。TNF和IL6是重要的炎癥細胞因子，它們在腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)模塊2中這些靶點的表達和活性，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，增強機體的免疫功能，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的生長和發(fā)展。模塊3包含18個節(jié)點和171條邊，主要參與細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過程。關(guān)鍵靶點如CCND1（細胞周期蛋白D1）、CDK4（細胞周期蛋白依賴性激酶4）等在模塊中相互關(guān)聯(lián)。CCND1和CDK4是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，它們的異常表達與腫瘤細胞的增殖失控密切相關(guān)。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)模塊3中這些靶點的功能，將腫瘤細胞阻滯在特定的細胞周期階段，抑制其增殖。模塊4包含12個節(jié)點和102條邊，主要與細胞信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過程有關(guān)。關(guān)鍵靶點如STAT3（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）、JUN（原癌基因c-Jun）等在網(wǎng)絡(luò)中相互作用。STAT3和JUN參與細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，在腫瘤細胞的生長、存活和侵襲中起著重要作用。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)模塊4中這些靶點的活性，阻斷相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細胞的生長和侵襲。運用CytoHubba插件，通過Degree、MCC、DMNC等多種算法綜合分析，進一步篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。Degree算法根據(jù)節(jié)點度來評估節(jié)點的重要性，節(jié)點度越高，在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。MCC算法從網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)和節(jié)點之間的連接關(guān)系等多個方面進行評估，能夠更全面地反映節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的作用。DMNC算法則結(jié)合了節(jié)點的度和鄰居節(jié)點的度等信息，對節(jié)點的重要性進行分析。通過多種算法的綜合分析，最終篩選出AKT1、TP53、EGFR、MAPK1、MAPK3、JUN、STAT3、CASP3、BCL2、TNF等10個核心靶點。這些核心靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有高度的連接性和重要性，它們在黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制中可能扮演著至關(guān)重要的角色，是進一步深入研究黃芩素作用機制的關(guān)鍵對象。4.3GO功能富集分析結(jié)果對黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的112個潛在靶點進行GO功能富集分析，從生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）三個層面進行深入探究，結(jié)果如表4-1所示。表4-1黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤潛在靶點的GO功能富集分析結(jié)果類別富集條目基因數(shù)P值主要功能描述生物過程對化學(xué)刺激的反應(yīng)560.001細胞對化療藥物等化學(xué)物質(zhì)的響應(yīng)與調(diào)節(jié)過程生物過程對有機物質(zhì)的反應(yīng)530.002細胞對各類有機物質(zhì)的識別、攝取、代謝等反應(yīng)生物過程對氧水平的反應(yīng)450.003細胞感知并適應(yīng)氧含量變化的過程生物過程細胞對脂多糖的反應(yīng)380.004細胞針對脂多糖刺激所產(chǎn)生的免疫、炎癥等反應(yīng)生物過程細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)350.005細胞應(yīng)對氧化損傷，調(diào)節(jié)抗氧化防御機制的過程生物過程細胞增殖的正調(diào)控300.006促進細胞分裂、生長，調(diào)控細胞數(shù)量增加的過程生物過程細胞遷移的正調(diào)控250.007調(diào)節(jié)細胞移動、轉(zhuǎn)移，促進細胞在組織中位置改變的過程生物過程細胞凋亡的調(diào)控220.008控制細胞程序性死亡的啟動、執(zhí)行和終止過程細胞組成細胞外泌體480.001參與細胞間通訊，攜帶生物分子進行信息傳遞細胞組成質(zhì)膜420.002細胞與外界環(huán)境的分隔界面，參與物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)細胞組成細胞外空間360.003細胞周圍的間隙，為細胞提供物質(zhì)交換和信號傳遞的場所細胞組成細胞質(zhì)300.004細胞內(nèi)除細胞核外的物質(zhì)，進行多種代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程細胞組成細胞核250.005儲存遺傳物質(zhì)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等過程分子功能蛋白質(zhì)結(jié)合650.001與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和功能分子功能金屬離子結(jié)合280.002與金屬離子結(jié)合，參與酶活性調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)等分子功能核酸結(jié)合220.003與核酸相互作用，影響基因表達、復(fù)制等過程分子功能酶結(jié)合180.004與酶相互作用，調(diào)節(jié)酶的催化活性和反應(yīng)速率分子功能受體結(jié)合150.005與受體特異性結(jié)合，激活或抑制信號通路在生物過程方面，眾多潛在靶點富集于細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)，這表明黃芩素或許能夠通過調(diào)節(jié)細胞對化療藥物等化學(xué)物質(zhì)的敏感性，增強治療效果。比如，當(dāng)細胞受到化療藥物刺激時，黃芩素作用的靶點可能參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，使細胞對化療藥物的攝取增加，或者增強藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。細胞對脂多糖的反應(yīng)過程的富集，暗示著黃芩素可能通過調(diào)節(jié)這一過程，減輕膠質(zhì)母細胞瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)。脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，在腫瘤微環(huán)境中，細菌感染或組織損傷等因素可能導(dǎo)致脂多糖的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。黃芩素可能通過作用于相關(guān)靶點，抑制炎癥細胞因子如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放，從而減輕炎癥對腫瘤細胞生長和發(fā)展的促進作用。細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)過程的富集也不容忽視，這提示黃芩素可能通過增強細胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。在腫瘤細胞中，由于代謝異常和活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生，細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，這會導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過氧化等，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶點，激活細胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，清除過多的ROS，保護細胞免受氧化損傷。從細胞組成層面來看，大量潛在靶點富集在細胞外泌體，細胞外泌體作為細胞間通訊的重要載體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)細胞外泌體的功能，影響腫瘤細胞與周圍細胞的通訊，進而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。例如，腫瘤細胞分泌的外泌體中可能攜帶促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的信號分子，黃芩素可能作用于相關(guān)靶點，改變外泌體的組成和功能，使其攜帶的信號分子減少或失去活性，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。質(zhì)膜是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換和信號傳遞的重要界面，潛在靶點在質(zhì)膜的富集，表明黃芩素可能通過作用于質(zhì)膜上的靶點，調(diào)節(jié)細胞的物質(zhì)運輸和信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。比如，質(zhì)膜上的某些受體蛋白可能參與腫瘤細胞的增殖和遷移信號傳導(dǎo)，黃芩素可能與這些受體蛋白結(jié)合，阻斷信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。細胞核作為細胞的控制中心，其中富集的靶點可能參與了基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)過程。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)這些過程，影響腫瘤細胞的基因表達和生物學(xué)行為。例如，黃芩素可能作用于細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)與腫瘤細胞增殖、凋亡相關(guān)基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長。在分子功能方面，潛在靶點主要具有蛋白質(zhì)結(jié)合功能，這表明黃芩素可能通過與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能，進而影響腫瘤細胞的生物學(xué)過程。比如，黃芩素可能與細胞周期調(diào)控蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞周期的進程，抑制腫瘤細胞的增殖。金屬離子結(jié)合功能的富集，暗示著其可能與細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、酶的活性調(diào)節(jié)等過程密切相關(guān)。金屬離子如鈣離子、鎂離子等在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起著重要作用，黃芩素可能通過調(diào)節(jié)金屬離子的結(jié)合，影響細胞的正常生理功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。例如，黃芩素可能與鈣離子通道蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，影響細胞的增殖和凋亡信號傳導(dǎo)。核酸結(jié)合功能提示黃芩素可能直接作用于核酸，調(diào)節(jié)基因的表達和復(fù)制，抑制腫瘤細胞的增殖。例如，黃芩素可能與DNA或RNA結(jié)合，阻止基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，從而抑制腫瘤細胞的生長。4.4KEGG通路富集分析結(jié)果對黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的112個潛在靶點進行KEGG通路富集分析，共富集到168條信號通路（P<0.05），部分主要富集通路如表4-2所示。表4-2黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤潛在靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果通路名稱基因數(shù)P值主要功能描述癌癥通路（Pathwaysincancer）380.001涉及多種癌癥相關(guān)的分子事件和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程PI3K-Akt信號通路（PI3K-Aktsignalingpathway）300.002調(diào)控細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程MAPK信號通路（MAPKsignalingpathway）250.003參與細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程Ras信號通路（Rassignalingpathway）200.004細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移TNF信號通路（TNFsignalingpathway）180.005激活炎癥細胞因子的表達和釋放，影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲NF-κB信號通路（NF-κBsignalingpathway）150.006炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，調(diào)控多種炎癥相關(guān)基因的表達細胞周期信號通路（Cellcycle）120.007調(diào)控細胞周期的進程，確保細胞正常分裂和增殖p53信號通路（p53signalingpathway）100.008維持細胞基因組穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細胞凋亡等在癌癥相關(guān)信號通路中，癌癥通路是一個綜合性的通路，黃芩素作用的潛在靶點富集于此，表明其可能通過調(diào)節(jié)該通路上的多個環(huán)節(jié)來發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。例如，在該通路上，黃芩素可能作用于多個關(guān)鍵蛋白，抑制腫瘤細胞的增殖信號傳導(dǎo)，促進細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長。PI3K-Akt信號通路在腫瘤細胞中常被異常激活，黃芩素可能通過抑制PI3K的活性，阻斷Akt的磷酸化，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活信號。有研究表明，在其他腫瘤模型中，一些小分子化合物能夠與PI3K的催化亞基結(jié)合，抑制其酶活性，進而阻斷PI3K-Akt信號通路的傳導(dǎo)，減少腫瘤細胞的增殖和存活。黃芩素或許也通過類似的機制發(fā)揮作用，阻斷PI3K-Akt信號通路，使腫瘤細胞無法獲得持續(xù)的增殖和存活信號，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)展。MAPK信號通路參與細胞的多種生物學(xué)過程，在腫瘤細胞的增殖和侵襲中起著重要作用。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，如ERK、JNK和p38等，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。當(dāng)腫瘤細胞受到刺激時，MAPK信號通路被激活，ERK、JNK和p38等激酶被磷酸化，進而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進與細胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達。黃芩素可能作用于這些激酶，抑制其磷酸化過程，阻斷信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。Ras信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，Ras蛋白的激活可以引發(fā)下游一系列信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。黃芩素可能通過抑制Ras蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游信號分子的表達和活性，來阻斷Ras信號通路，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)展。比如，黃芩素可能與Ras蛋白結(jié)合，阻止其與下游信號分子的相互作用，或者調(diào)節(jié)Ras蛋白的上游調(diào)節(jié)因子，抑制Ras蛋白的激活。炎癥相關(guān)信號通路中，TNF信號通路可以激活炎癥細胞因子的表達和釋放，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。黃芩素可能通過抑制TNF-α與其受體的結(jié)合，或阻斷下游信號分子的激活，如IκB激酶（IKK）的活性，抑制NF-κB的活化，從而減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，TNF-α與其受體結(jié)合后，會激活下游的IKK，使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB，使其進入細胞核，調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達。黃芩素可能通過抑制IKK的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的活化，減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生。NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，它可以調(diào)控多種炎癥相關(guān)基因的表達。黃芩素可能通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，使其無法與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而抑制炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。例如，黃芩素可能作用于NF-κB的抑制蛋白IκB，增強其穩(wěn)定性，使其能夠持續(xù)抑制NF-κB的活性，阻止NF-κB進入細胞核，進而抑制炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。細胞周期和凋亡相關(guān)信號通路方面，細胞周期的異常調(diào)控是腫瘤細胞增殖失控的重要原因之一。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性，如周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（CDK），將腫瘤細胞阻滯在特定的細胞周期階段，抑制其增殖。在細胞周期中，Cyclin和CDK相互作用，調(diào)節(jié)細胞周期的進程。當(dāng)細胞周期調(diào)控異常時，腫瘤細胞會不斷增殖。黃芩素可能作用于Cyclin和CDK，抑制它們的活性或調(diào)節(jié)它們的表達水平，使腫瘤細胞無法順利通過細胞周期，從而阻滯在特定階段，抑制其增殖。p53信號通路在維持細胞基因組穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。在膠質(zhì)母細胞瘤中，p53基因常發(fā)生突變或功能失活。黃芩素可能通過激活野生型p53蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游凋亡相關(guān)基因的表達，如Bax、Bcl-2等，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。正常情況下，p53蛋白可以在細胞受到損傷或應(yīng)激時被激活，它可以促進Bax等促凋亡蛋白的表達，抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。在膠質(zhì)母細胞瘤中，p53功能異常，黃芩素可能通過某種機制激活p53蛋白，使其恢復(fù)正常功能，或者直接調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2等基因的表達，打破細胞凋亡的平衡，促進腫瘤細胞凋亡。五、討論與驗證5.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果討論本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，全面系統(tǒng)地探究了黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制，得到了一系列關(guān)鍵靶點和信號通路，這些結(jié)果與現(xiàn)有研究相互印證，進一步揭示了黃芩素的抗腫瘤作用機制。在關(guān)鍵靶點方面，本研究篩選出的核心靶點如AKT1、TP53、EGFR、MAPK1、MAPK3、JUN、STAT3、CASP3、BCL2、TNF等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均起著至關(guān)重要的作用。其中，AKT1作為PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵激酶，在細胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用。在膠質(zhì)母細胞瘤中，PI3K-Akt信號通路常被異常激活，導(dǎo)致腫瘤細胞的無限增殖和存活。已有研究表明，黃芩素可以抑制PI3K的活性，阻斷Akt的磷酸化，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活信號。如在對人肝癌細胞HepG2的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠顯著降低Akt的磷酸化水平，抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中AKT1作為核心靶點，提示黃芩素可能通過抑制AKT1的活性，阻斷PI3K-Akt信號通路，從而發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。TP53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，其編碼的p53蛋白在維持細胞基因組穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細胞凋亡以及參與DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在膠質(zhì)母細胞瘤中，TP53基因常發(fā)生突變或功能失活，導(dǎo)致腫瘤細胞逃避生長調(diào)控和凋亡。有研究報道，黃芩素可以激活野生型p53蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游凋亡相關(guān)基因的表達，如Bax、Bcl-2等，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。在對人肺癌細胞A549的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠上調(diào)p53蛋白的表達，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究中TP53作為核心靶點，表明黃芩素可能通過調(diào)節(jié)TP53的功能，激活其下游的凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在多種腫瘤細胞中高表達，其激活可以引發(fā)下游一系列信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。大量研究表明，黃芩素可以抑制EGFR的活性，阻斷其下游的信號傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。例如，在對人乳腺癌細胞MCF-7的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠顯著降低EGFR的表達和磷酸化水平，抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中EGFR作為核心靶點，提示黃芩素可能通過抑制EGFR的活性，阻斷其下游的信號傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。在信號通路方面，本研究通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)黃芩素作用于膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點顯著富集于多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、細胞周期信號通路、p53信號通路等。這些信號通路在腫瘤細胞的增殖、存活、遷移、侵襲、凋亡以及腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K-Akt信號通路在細胞的生長、存活和代謝等過程中起著重要的調(diào)控作用，在膠質(zhì)母細胞瘤中常被異常激活。黃芩素可能通過抑制PI3K的活性，阻斷Akt的磷酸化，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活信號。已有研究證實，在多種腫瘤細胞中，黃芩素能夠抑制PI3K-Akt信號通路的激活，減少腫瘤細胞的增殖和存活。如在對人胃癌細胞SGC-7901的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以顯著降低PI3K和Akt的磷酸化水平，抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中PI3K-Akt信號通路的富集，進一步支持了黃芩素通過抑制該信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用的觀點。MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，在腫瘤細胞的增殖和侵襲中也起著重要作用。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，如ERK、JNK和p38等，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。有研究表明，在人結(jié)直腸癌細胞SW480中，黃芩素能夠抑制ERK和JNK的磷酸化，從而抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中MAPK信號通路的富集，提示黃芩素可能通過調(diào)節(jié)該信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。Ras信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，Ras蛋白的激活可以引發(fā)下游一系列信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。黃芩素可能通過抑制Ras蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游信號分子的表達和活性，來阻斷Ras信號通路，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)展。已有研究報道，在人肝癌細胞HepG2中，黃芩素能夠抑制Ras蛋白的表達和活性，阻斷其下游信號通路的傳導(dǎo)，抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中Ras信號通路的富集，表明黃芩素可能通過調(diào)節(jié)Ras信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。TNF信號通路可以激活炎癥細胞因子的表達和釋放，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。黃芩素可能通過抑制TNF-α與其受體的結(jié)合，或阻斷下游信號分子的激活，如IκB激酶（IKK）的活性，抑制NF-κB的活化，從而減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)。在對人肺癌細胞A549的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的活化，減少炎癥細胞因子的釋放，抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中TNF信號通路的富集，提示黃芩素可能通過調(diào)節(jié)該信號通路，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抑制膠質(zhì)母細胞瘤的作用。NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，它可以調(diào)控多種炎癥相關(guān)基因的表達。黃芩素可能通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，使其無法與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而抑制炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。已有研究表明，在人乳腺癌細胞MCF-7中，黃芩素能夠抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，降低炎癥相關(guān)基因的表達，抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究中NF-κB信號通路的富集，表明黃芩素可能通過調(diào)節(jié)該信號通路，發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。細胞周期信號通路的異常調(diào)控是腫瘤細胞增殖失控的重要原因之一。黃芩素可能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性，如周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（CDK），將腫瘤細胞阻滯在特定的細胞周期階段，抑制其增殖。有研究報道，在人白血病細胞HL-60中，黃芩素能夠上調(diào)p21蛋白的表達，抑制CyclinD1和CDK4的表達，將細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞的增殖。本研究中細胞周期信號通路的富集，提示黃芩素可能通過調(diào)節(jié)該信號通路，將膠質(zhì)母細胞瘤細胞阻滯在特定的細胞周期階段，抑制其增殖。p53信號通路在維持細胞基因組穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。在膠質(zhì)母細胞瘤中，p53基因常發(fā)生突變或功能失活。黃芩素可能通過激活野生型p53蛋白的活性，或調(diào)節(jié)其下游凋亡相關(guān)基因的表達，如Bax、Bcl-2等，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。已有研究表明，在人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中，黃芩素能夠激活p53蛋白，上調(diào)Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究中p53信號通路的富集，表明黃芩素可能通過調(diào)節(jié)該信號通路，誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡。5.2分子機制驗證設(shè)想為進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的黃芩素抑制膠質(zhì)母細胞瘤的分子機制，擬開展細胞實驗和動物實驗，從細胞和整體動物水平對關(guān)鍵靶點和信號通路進行驗證。5.2.1細胞實驗實驗設(shè)計：選用人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87和U251作為研究對象。將細胞分為空白對照組、黃芩素低劑量組（10μmol/L）、黃芩素中劑量組（20μmol/L）、黃芩素高劑量組（40μmol/L）以及陽性對照組（使用臨床常用的抗腫瘤藥物替莫唑胺，濃度為10μmol/L）。采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，將處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，每孔接種3000-5000個細胞，培養(yǎng)24小時后，分別加入不同處理組的藥物，每組設(shè)置6個復(fù)孔。在藥物作用24小時、48小時、72小時后，每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4小時，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。通過Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，將Transwell小室置于24孔板中，在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于遷移實驗，小室上室不鋪基質(zhì)膠；對于侵襲實驗，小室上室預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠。藥物處理細胞24小時后，將細胞接種于上室，培養(yǎng)24-48小時后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或未侵襲的細胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照計數(shù)。指標(biāo)檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測關(guān)鍵靶點蛋白（如AKT1、TP53、EGFR、MAPK1、MAPK3、JUN、STAT3、CASP3、BCL2、TNF等）及相關(guān)信號通路蛋白（如PI3K-Akt信號通路中的PI3K、p-Akt，MAPK信號通路中的p-ERK、p-JNK、p-p38等）的表達水平。提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時，加入相應(yīng)的一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，一般為1:500-1:2000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例一般為1:2000-1:5000），室溫孵育1-2小時，再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）的相對表達量。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測關(guān)鍵靶點基因及相關(guān)信號通路基因的mRNA表達水平。提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件根據(jù)所用的PCR試劑盒說明書進行設(shè)置，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因與內(nèi)參基因（如GAPDH）的相對表達量。5.2.2動物實驗實驗設(shè)計：選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，將人膠質(zhì)母細胞瘤U87細胞以1×10^7個/ml的密度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細胞懸液，建立荷瘤小鼠模型。待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為5組，每組6-8只，分別為模型對照組、黃芩素低劑量組（20mg/kg）、黃芩素中劑量組（40mg/kg）、黃芩素高劑量組（80mg/kg）以及陽性對照組（使用替莫唑胺，劑量為20mg/kg）。藥物通過腹腔注射給藥，模型對照組給予等體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥14-21天。每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實驗結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤組織，稱重，計算腫瘤抑制率。指標(biāo)檢測：采用免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測腫瘤組織中關(guān)鍵靶點蛋白及相關(guān)信號通路蛋白的表達和定位。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫溶液孵育10-15分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。用5%牛血清白蛋白封閉30-60分鐘，加入相應(yīng)的一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，一般為1:50-1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗片3次，每次5分鐘，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例一般為1:200-1:500），室溫孵育30-60分鐘，再次用