CCSB47DB51代替DB51/T844—2008，DB51/T11852025-09-15發(fā)布I II 1 1 1 1 5 10 11 12 13本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件代替DB51/T844—2008《桑蠶微粒子病防治技術(shù)規(guī)程》和DB51/T1185—2011《桑蠶微粒子病診斷技術(shù)規(guī)程》。與DB51/T844—2008和DB51/T1185—2011相比，除結(jié)構(gòu)性調(diào)整和編輯性改動外，——增加了實(shí)時熒光定量PCR檢測法（見4.2）。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口、解釋并組織本文件起草單位：四川省蠶業(yè)管理總站、西南大學(xué)、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究DB51/T844—2008和DB51/T1185—2011的歷次版本發(fā)布情況為：——DB51/T844于2008年首次發(fā)布；DB51/T1185于2011年首次發(fā)布。1桑蠶微粒子病診斷防控技術(shù)規(guī)程GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和DB51/T848養(yǎng)蠶消毒技術(shù)規(guī)程2——普通光學(xué)顯微鏡、相襯（相差）顯微鏡，放大倍數(shù)16倍×40倍；——生化培養(yǎng)箱，溫度范圍10℃~50℃,濕度范圍50%～95%；——普通冰箱，溫度為0℃~4℃、-20℃;——離心機(jī)，轉(zhuǎn)速0r/min～30004.1.2試劑——濃鹽酸[w(HCl)=30％];4.1.3耗材——解剖剪、鑷子、橡皮吸管；——研缽、研磨棒；）；——容量瓶、量筒、燒杯；——載玻片、蓋玻片；——無紡布濾紙。4.1.4外觀觀察b)小蠶期：收蟻后不疏毛；體色深暗、體軀瘦?。话l(fā)育緩腹足外側(cè)部位較多；蛻皮困難、死亡；群體不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鱗毛脫落；腹4.1.5解剖觀察4.1.6顯微鏡檢查樣品采集采集4.1.4描述的典型癥狀的卵、小蠶、大蠶、蛹、樣品處置3c)小蠶期其他階段、大蠶期、蛹期、蛾期樣本制備顯微鏡觀察.1直接觀察法.2離心沉淀法將制備的磨碎液，加入適量無菌水，用無紡布濾紙過濾后，將濾液移入離心管中，經(jīng)3000r/min離心3min，傾去上清液，沉淀物振蕩制成鏡檢樣本，用普通光學(xué)顯微鏡觀察。.3酸溶解法.4過氧化氫法將檢出有微粒子孢子的磨碎液吸取1滴，滴于載玻片上，再加1滴～2滴過氧化氫溶液2O2)=10％]，蓋上蓋玻片，經(jīng)過10mi4.1.7判定a)通過外觀觀察，蠶的不同發(fā)育階段出現(xiàn)4.1.4表述b)通過解剖觀察，大蠶期病蠶絲腺出現(xiàn)可見的乳白色膿皰狀斑塊時，可確診為微粒子?。?根黑色線狀物，表面光滑，孢子活潑，多左右擺動，有時可見翻滾現(xiàn)象時，孢子則為微粒子孢子（參見附錄A原樣品確診為微粒子??；44.2.1主要儀器設(shè)備——水浴鍋；——高壓滅菌鍋；——二級生物安全柜；——普通冰箱，溫度為0℃~4℃、-20℃；超低溫冰箱，溫度為-80℃;——熒光定量PCR儀，溫度范圍4.0℃~99.9℃;——高速冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為0r/min～160004.2.2試劑——超純水（Rnase/Dnasefree,St4.2.3耗材——槍頭、離心管；4.2.4樣品處置樣本制備劑盒說明書步驟提取DNA。DNA普通提取提取好的DNA模板保存于-20℃冰箱備用，保存期限宜在65——正向引物：5'-ACGGAAGAATACCACAAGGAGT-——反向引物：5'-CACTACATCTGTCTAAATGAGGG——探針：5'-FAM-CGTTGAGTCAAATTAAGCCGCACA-TA錄D）替代DNA模板作為陽性對照；以超純水（Rnase/Dnasefr），從第2個步驟開始，共40個循環(huán)?？砂凑掌渌惺凵唐坊噭┖姓f明書進(jìn)行熒光定量PCR4.2.6判定根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。判5.1蠶前防控5.1.1抽樣5.1.3消毒按照DB51/T848中6.1的規(guī)定執(zhí)65.2蠶中防控按照4.1.7或4.2.6的規(guī)定進(jìn)行診斷，診斷出有微粒子的，對號淘汰整張蠶種。平附蠶種催青至點(diǎn)青時，用干凈排筆蘸取含有效氯0.33％的漂白粉液，刷于卵面及蠶連紙正面和背面，用量以蠶連紙濕潤不滴液為度。原原種、母種連紙可直接浸入前述消毒液中消毒10s，取出。蠶種消毒后，平攤于蠶箔中陰干后及時轉(zhuǎn)入黑暗抑制包括蠶體蠶座消毒、蠶室地面及周圍環(huán)境消毒、用具7葉攤?cè)胭A桑室消毒桑葉專用區(qū)域，抖散，保持疏松，預(yù)知檢查抽樣及樣品處置見表4。不需處置。小蠶每10頭～20頭、大蠶每3頭～5頭為1個樣8選出淘汰具有下列癥狀的蠶、繭、蛹、蛾，經(jīng)消毒后集中處c)蛹期：病死蛹、肥胖蛹、黑斑蛹、腹部環(huán)節(jié)松弛并手d)蛾期：苗蛾、尾蛾，以及卷翅、黑環(huán)節(jié)、大肚、鱗毛脫落、黑斑等5.3蠶后防控養(yǎng)蠶制種結(jié)束后，養(yǎng)蠶相關(guān)環(huán)境用具應(yīng)及時全面清洗、消毒。消毒方法按照DB51/T848中6.3的規(guī).1使用前、后，催青室、保種室、蠶種整理室、浸酸浴消場、冷庫、檢驗(yàn)室等附屬室，應(yīng)清蠶種架、蠶種筐、蠶箔等相關(guān)用具消毒按照DB.2使用結(jié)束，催青室、保種室、蠶種整理室清掃后，應(yīng)密閉消毒1次，方法按照DB51/T8489——水浴鍋；——高壓滅菌鍋；——普通冰箱，溫度為0℃~4℃、-20℃；超低溫冰箱，溫度為-80℃;——高速冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為0r/min~16000r/mmol/L；pH=7.2～7.4)]；——Tris飽和酚[10mmol/L；pH=7.8——TEbuffer[10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH取制備好的樣品2.0g，加入500mLPBS緩沖液和5μL蛋白酶K溶液，55將DNA再洗一次，12000r/min離心2min，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上，數(shù)分鐘后直立離心管，自然風(fēng)干。加入100μLTEbuffer（pH8.0）溶解DNA，在37℃金屬浴中保溫30min；使家蠶微孢子蟲GNL8rRNA基因，GenBank擴(kuò)增產(chǎn)物基因序列為：ACGGAAGAATACCACAAGGAGTGGATTGTGCGGCTTAATTTGACTCAACGCGGGGTAGGTATAACATGGTATAATATTTTATCATGATAGTGGTGCATGGCCGTTTCCAATGGATGCTGTGAAGTAATGATTAATTTCAACAAGATGTGAGACCCTCATTTAGACAGATGTAGTG取5μLPCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，按試劑盒說明書進(jìn)行膠回收純化目的片段，將目的片段與克隆