ICS11.220

CCSB41

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—XXXX

非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、基因

Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鑒別三重?zé)晒?/p>

PCR檢測(cè)方法

AfricanSwineFeverVirusTriplexFluorescencePCRKitfor

DifferentiatingGenotypeⅠandⅡRecombinantStrain,GenotypeⅠLow

VirulentStrainandGenotypeⅡStrain

征求意見(jiàn)稿

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CVMAXXXXX—XXXX

非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒

株鑒別三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鑒別的熒光PCR檢

測(cè)方法技術(shù)要求。

本文件適用于豬血清、組織、口腔拭子、肛門(mén)拭子等樣品中的非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)及基因Ⅰ/Ⅱ型

重組毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株的鑒別診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4符號(hào)和縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

實(shí)時(shí)熒光PCR：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timefluorescencepolymerasechainreaction）

ASFV：非洲豬瘟病毒毒（Africanswinefevervirus）

BHQ：無(wú)熒光淬滅基團(tuán)（Blackholequencher）

Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）

DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate）

DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

FAM：羧基熒光素（Carboxyfluorescein）

HEX：六氯-6-甲基熒光素（Hexachlorofluorescein）

PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）

ROX：無(wú)活性熒光參考染料（Carboxy-X-rhodamine）

1

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CY5：花青素?zé)晒馊玖希–yanine5）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApoiymerase）

TEBuffer：Tris-EDTA緩沖液（Tris-EDTAbuffersolution）

5試劑

5.1提取試劑

選取商品化的病毒DNA與RNA共提取試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取。

5.2擴(kuò)增試劑

選取商品化的Taq酶擴(kuò)增試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配液與擴(kuò)增。

5.3引物探針

本方法使用引物、探針信息見(jiàn)表1。

表1引物、探針信息表

檢測(cè)靶標(biāo)名稱(chēng)序列

B646L-F15’-TGGTATTCCTCCCGTGGC-3’

B646LB646L-R15’-TGCAGCTCTTACATACCCTTCC-3’

B646L-Probe1FAM-5’-CCGATGATCCGGGTGCGAT-3’TAMRA-N

X64R-F15’-GGTTCCAAAACAATATTGGCC-3’

X64RX64R-R15’-TATTTCACATCCGTGGCATCT-3’

X64R-Probe1VIC-5’-ATGGCTTACATGGTATATAC-3’-MGB

MGF-F15’-AGGATTTTAGGTTGGCCACT-3’

MGF_360-1

MGF-R15’-CGGCTGTGTGCGGAACT-3’

4L

MGF-Probe1CY5-5’-CAGAAGACGGGGTTCGGATACA-3’-BHQ2

IC-F15’-TGGTACATGGCGGCGAAT-3’

IC-GIC-R15’-TCGGCGAGAAGCTGATGTCT-3’

IC-P-ROXROX-5’-ACAGCATCCAGGGCCATTCAGATGTC-3’-BHQ2

5.4陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照的制備見(jiàn)附錄A.1。

陰性對(duì)照的制備見(jiàn)附錄A.2。

5.5其它試劑

dNTPMixture（2.5mMeach），Lyo-TaqStorageBuffer，1×TE緩沖液，DEPC處理水均為商品化產(chǎn)品，

PBS的制備見(jiàn)附錄A.3。

2

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6儀器和耗材

超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、電腦、實(shí)時(shí)熒光PCR儀及配套反應(yīng)管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、微

量移液器（0.5～10μl，5～50μl，20～200μl，100～1000μl），移液器吸頭（10μl，200μl，1000μl），1.5ml

無(wú)菌離心管，無(wú)菌注射器等。

7操作步驟

7.1樣品采集

7.1.1血清樣品采集：用無(wú)菌注射器抽取受檢豬靜脈血5ml，置于無(wú)菌離心管內(nèi)，室溫或者37℃傾斜

放置自然凝集20～30min，2000～3000r/min離心10min，分離血清裝入新的離心管中，密封后冷藏或冷

凍保存。

7.1.2組織樣品采集：采集受檢豬的組織樣品，首選脾臟，其次為淋巴結(jié)等。脾臟采集約3cm×3cm大

小，淋巴結(jié)選取出血嚴(yán)重的整體采集，將所采集樣品放入50%甘油-PBS保存液中，密封后冷藏或冷凍

保存。

7.1.3口腔拭子樣品采集：用醫(yī)用棉簽在口腔轉(zhuǎn)動(dòng)至少3次，采集口腔分泌物；蘸取分泌物后，立即

將拭子浸入1ml50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，蓋緊離心管蓋，密封后冷藏或冷凍保存。

7.1.4肛門(mén)拭子樣品采集：用棉拭子深入直腸，轉(zhuǎn)圈，蘸取到粘液，立即將拭子浸入1ml50%甘油-PBS

保存液中，剪去露出部分，蓋緊離心管蓋，密封后冷藏或冷凍保存。

7.2樣品保存與運(yùn)輸采集的樣品可立即用于檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的樣品，2～8℃保存應(yīng)不超過(guò)24h。

-20±5℃下應(yīng)不超過(guò)3個(gè)月，-70℃以下可長(zhǎng)期保存。樣品運(yùn)送采用低溫保存進(jìn)行運(yùn)輸，并在規(guī)定溫度下

的保存期內(nèi)送達(dá)。

7.3樣本處理及核酸提取

7.3.1血清樣品：無(wú)需進(jìn)行前處理，直接用于核酸提取。

7.3.2組織樣品：取待檢組織樣品約1g剪碎置于滅菌的組織研磨器中充分研磨，加入PBS混勻制備

10%組織勻漿液，3000r/min離心15min，取上清用于核酸提取。

7.3.3口腔拭子樣品、肛門(mén)拭子樣品：充分渦旋震蕩含有口腔拭子的管子30s，盡力擠壓拭子后，

3000r/min離心1min，取上清用于核酸提取。

7.3.4處理后的樣本使用市售商品化病毒DNA與RNA共提取試劑盒提取病毒核酸，提取步驟嚴(yán)格參

照說(shuō)明書(shū)。

8熒光PCR檢測(cè)

8.1反應(yīng)液配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）根據(jù)檢測(cè)樣品數(shù)量n（n=待測(cè)樣品數(shù)+陰性對(duì)照數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)），按

下表每1反應(yīng)配比，配制n+1個(gè)反應(yīng)用量，最后充分混勻，瞬時(shí)離心，定量（20μl/管）分裝至PCR反

應(yīng)管中蓋上PCR反應(yīng)管蓋，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)備用。A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應(yīng)液的制備見(jiàn)附錄A.4，

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液的制備見(jiàn)附錄A.5，A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-內(nèi)標(biāo)的制備見(jiàn)附錄A.6。

3

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表2反應(yīng)液配制

組分體積(μl)/反應(yīng)

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應(yīng)液18.50

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液1.00

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-內(nèi)標(biāo)0.50

8.2加樣（樣本處理區(qū)）待測(cè)樣品提取核酸、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各5μl，分別加入對(duì)應(yīng)PCR反應(yīng)

管，蓋好管蓋，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。

8.3熒光PCR擴(kuò)增（PCR擴(kuò)增區(qū)）（1）開(kāi)機(jī)預(yù)熱并檢驗(yàn)儀器性能。（2）將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀檢

測(cè)孔內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及待檢樣本名稱(chēng)；按下表設(shè)置相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行熒光PCR

擴(kuò)增。

體系反應(yīng)體系設(shè)為25μl

信號(hào)采集FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道采集熒光信號(hào)

階段條件循環(huán)數(shù)

預(yù)變性95℃：2min1

反應(yīng)條件

變性95℃：15s

40

退火，延伸，熒光采集60℃：30s（此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)）

9判定

9.1合理調(diào)整閾值線(xiàn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

9.2試驗(yàn)成立的條件

對(duì)照名稱(chēng)FAM通道HEX/VIC通道CY5通道ROX通道

Ct值＞38.00或無(wú)Ct值＞38.00或無(wú)Ct值＞38.00或無(wú)

Ct值≤35.00,呈

陰性對(duì)照Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增

典型擴(kuò)增曲線(xiàn)

曲線(xiàn)曲線(xiàn)曲線(xiàn)

Ct值≤38.00，呈Ct值≤38.00，呈典Ct值≤38.00,呈典Ct值≤35.00,呈

陽(yáng)性對(duì)照

典型擴(kuò)增曲線(xiàn)型擴(kuò)增曲線(xiàn)型擴(kuò)增曲線(xiàn)典型擴(kuò)增曲線(xiàn)

9.3結(jié)果判定

FAM通道HEX/VIC通道CY5通道ROX通道結(jié)果判定

Ct值≤38.00，呈典Ct值≤38.00，呈典型Ct值≤38.00，呈典Ct值≤35.00,呈典

Ⅰ/Ⅱ型重組毒株

型擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)型擴(kuò)增曲線(xiàn)型擴(kuò)增曲線(xiàn)

Ct值≤38.00，呈典Ct值≤38.00，呈典型Ct值＞38.00或無(wú)Ct值≤35.00,呈典

Ⅰ型弱毒株

型擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增型擴(kuò)增曲線(xiàn)

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曲線(xiàn)

Ct值＞38.00或無(wú)

Ct值≤38.00，呈典Ct值≤35.00,呈典

Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增任意值Ⅱ型毒株

型擴(kuò)增曲線(xiàn)型擴(kuò)增曲線(xiàn)

曲線(xiàn)

Ct值＞38.00或無(wú)Ct值＞38.00或無(wú)Ct值＞38.00或無(wú)

Ct值≤35.00,呈典非洲豬瘟病毒

Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增

型擴(kuò)增曲線(xiàn)陰性

曲線(xiàn)曲線(xiàn)曲線(xiàn)

Ct值＞35.00或無(wú)

任意值任意值任意值Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增結(jié)果無(wú)效*a

曲線(xiàn)

注：*a無(wú)效結(jié)果，應(yīng)查找并排除原因,并對(duì)此樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

10實(shí)驗(yàn)室生物安全要求

10.1本方法涉及非洲豬瘟感染性樣品的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在(動(dòng)物)生物安全三級(jí)試驗(yàn)室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室生物

安全管理要求見(jiàn)GB19489。國(guó)家農(nóng)業(yè)行政主管部門(mén)另有規(guī)定的，按其規(guī)定執(zhí)行。

10.2使用過(guò)的實(shí)驗(yàn)器材和液體廢棄物應(yīng)先經(jīng)過(guò)消毒液浸泡處理，再經(jīng)高溫高壓處理后廢棄。剩余樣品

等固體廢棄物應(yīng)在生物安全柜中密封包裝，經(jīng)表面消毒后移出，再經(jīng)高溫高壓處理后廢棄。

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附錄A

（規(guī)范性）

陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及熒光PCR主要反應(yīng)組分

A.1陽(yáng)性對(duì)照

擴(kuò)增非洲豬瘟病毒HLJ/18株B646L基因全長(zhǎng)(1941bp)，序列參見(jiàn)附錄B.1，將非洲豬瘟病毒B646L基

因全長(zhǎng)(1941bp)連接于pCAGGS載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-3P；擴(kuò)增非洲豬瘟病毒SD/DY-I/21株X64R

基因全長(zhǎng)及其兩端序列(963bp)，序列參見(jiàn)附錄B.2，將非洲豬瘟病毒X64R基因全長(zhǎng)及其兩端序列(963bp)

連接于pCAGGS載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-3X；擴(kuò)增非洲豬瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全

長(zhǎng)及其兩端序列(1321bp)，序列參見(jiàn)附錄B.3，將非洲豬瘟病毒MGF_360-14L基因全長(zhǎng)及其兩端序列

(1321bp)連接于pCAGGS載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-3M；用1×TE緩沖液將重組質(zhì)粒pCAGGS-3P、

pCAGGS-3X、pCAGGS-3M稀釋至分別約104copies/μl，保存于-20℃?zhèn)溆谩CAGGS載體質(zhì)粒圖譜及序

列參見(jiàn)附錄B.4。

A.2陰性對(duì)照

陰性對(duì)照為DEPC處理水。

A.3PBS（0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4）

PBS（0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4）配方見(jiàn)表A.3

試劑用量

氯化鈉（NaCl）8.00g

氯化鉀（KCl）0.20g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.44g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.24g

蒸餾水加至1000mL

將上述成分依次溶解，用鹽酸（HCl）調(diào)pH至7.4，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應(yīng)液

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應(yīng)液配方見(jiàn)表A.4

表A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應(yīng)液配方

組分體積(μl)/反應(yīng)

DEPC處理水4.625

10×HABuffer2.50

5×ProbeqPCRBuffer5.00

dNTPMixture（2.5mMeach）2.00

B646L-F1（10μM）0.50

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組分體積(μl)/反應(yīng)

B646L-R1（10μM）0.50

B646L-Probe1（10μM）0.25

X64R-F1（10μM）0.50

X64R-R1（10μM）0.50

X64R-Probe1（10μM）0.25

MGF-F1（10μM）0.50

MGF-R1（10μM）0.50

MGF-Probe1（10μM）0.25

IC-F1（10μM）0.25

IC-R1（10μM）0.25

IC-P-ROX（10μM）0.125

Total18.50

A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液配方見(jiàn)表A.5

表A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液配方

組分體積(μl)/反應(yīng)

HighAffinityHotStartTaq(5U/μl)0.25

Lyo-TaqStorageBuffer0.75

A.6A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-內(nèi)標(biāo)

人工合成一段隨機(jī)DNA片段（67bp）作為內(nèi)標(biāo)序列片段，序列參見(jiàn)附錄B.5，將合成的內(nèi)標(biāo)序列片

段（67bp）連接于pUC57載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-IC-G；用1×TE緩沖液將重組質(zhì)粒pUC57-IC-G稀釋至

約104copies/μl，保存于-20℃?zhèn)溆?。pUC57載體質(zhì)粒圖譜及序列參見(jiàn)附錄B.6。

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附錄B

（資料性）

非洲豬瘟病毒B646L基因、X64R基因、MGF_360-14L基因、內(nèi)標(biāo)及相關(guān)載體質(zhì)粒序列

B.1非洲豬瘟病毒HLJ/18株B646L基因全長(zhǎng)(1941bp)

非洲豬瘟病毒HLJ/18株(GenBank：MK333180.1)基因組103,618-105,558bp

genecomplement(103618..105558)

/gene="B646L"

CDScomplement(103618..105558)

/gene="B646L"

/codon_start=1

/product="B646L"

/protein_id="QBH90570.1"

/translation="MASGGAFCLIANDGKADKIILAQDLLNSRISNIKNVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPVGFEYN

KVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHDMVGHHILGACHSSWQDAPIQGTSQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRP

IVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQ

SKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQPPLALWIKLRFWFNENVN

LAIPSVSIPFGERFITIKLASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRV

RFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACS

SISDISPVTYPITLPIIKNISVTAHGINLIDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYIS

WDTDYVGSITTADLVVSASAINFLLLQNGSAVLRYST"

B646L基因全長(zhǎng)序列

ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATTGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGAT

CTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATT

TTAATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAG

CTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGA

TGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACAC

CCTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTAC

TACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCAC

AACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCA

GTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGAACG

TGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCC

TATCACGGACGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTC

TTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTT

ATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCCC

8

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CAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATA

ACCTGTTTGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCAC

ACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAA

CATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAG

AGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTA

CCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCT

TCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCA

ACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATC

TTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCTAA

注：劃線(xiàn)部分為質(zhì)粒pCAGGS-3P構(gòu)建用引物覆蓋部分，加粗部分為非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、Ⅰ型弱毒株

和Ⅱ型毒株鑒別三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中FAM通道檢測(cè)靶標(biāo)（B646L基因）所使用引物、探針序列覆蓋部分。

B.2非洲豬瘟病毒SD/DY-I/21株X64R基因全長(zhǎng)及其兩端序列(963bp)

非洲豬瘟病毒SD/DY-I/21(GenBank：MZ945537.1)基因組15,777-16,739bp

gene16113..16307

/gene="X64R"

CDS16113..16307

/gene="X64R"

/codon_start=1

/product="X64R"

/protein_id="UEN73189.1"

/translation="MLLYIVIIVAYVSYKLVPKQYWPILMFMAYMVYTHEKLDINERSGFWKYIIAKLFRCHGCEICK"

X64R基因全長(zhǎng)及其兩端序列

TGGTTTGCTGACTATTTGGAATTTATAGAAGCAAAAATAGATACTTTTACTAATAGCAGTGCATTATAAGTGATCAAAATTTAATATCT

CATAAAAAAGGTACACATCAACATCATTCATTTGTTTCATGATGTTTGATTCATTACTTTCTACAATCACTGGGGGGGGGGTCTCTCAT

AGCTTTAGTATTGCTATGGTTTACTAATTATTATGTAGAATTTATAGGAGCAGATATATATGGTGGTAATTGTACTCTATAAGTTTATA

AAAATTTCAGTATATTTTTTTTGTTAATATAACAGAAATGATTTAAATTACAAAAAAAAGAGAATCATCATGCTATTATACATTGTTAT

TATAGTAGCATATGTAAGTTATAAATTGGTTCCAAAACAATATTGGCCAATACTCATGTTTATGGCTTACATGGTATATACCCATGAA

AAATTAGATATAAATGAAAGATCCGGATTTTGGAAATATATTATAGCAAAACTATTCAGATGCCACGGATGTGAAATATGTAAGTGAT

ATTAAAAACATAATACGAAGTGTAATAATTGACTATTTTTTGTTGAATGGAAACTGTTTTTGAGTAATATGTTGAACATAATGGTTTTT

ATAGATGTTAAATCATTTGATTGTAGTAATTGTACTAAATGATGTGAGATATAAACCTAGTTCAATCAAAATTTAATTTTTTTATAAAA

AGCTACAGAGTGTTTTATTAAACGTAGCTTATTTAAAAAGTTACACAATGTTAAAATCTCTACTTACTTTAATTCTTTGTGGGGTTTTA

tTAACTTTATCCATATTATGGCTTATTACTTACCATGTAGAACTTATAGAAGCAATAGATGATTTCTACGACTGAAATATAGAATAGTT

CATTTTCTATTTGTAAAATAATGATTTATATTCTCTCCTAAAAATACGATCGATCCTTTATATGCTTTGAAAACG

注：劃線(xiàn)部分為質(zhì)粒pCAGGS-3X構(gòu)建用引物覆蓋部分，加粗部分為非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、Ⅰ型弱毒株和

Ⅱ型毒株鑒別三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中HEX/VIC通道檢測(cè)靶標(biāo)（X64R基因）所使用引物、探針序列覆蓋部分。

9

T/CVMAXXXXX—XXXX

B.3非洲豬瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全長(zhǎng)及其兩端序列(1321bp)

非洲豬瘟病毒JS/LG/21株(GenBank：OQ504956.1)基因組27,272-28,592bp

genecomplement(27568..28431)

/gene="MGF_360-14L"

CDScomplement(27568..28431)

/gene="MGF_360-14L"

/codon_start=1

/product="MGF_360-14L"

/protein_id="WFS78480.1"

/translation="MLSLQTLAKKVVACNYLSSDYDYTLQRFGLWWDLGPIHLCNNCKQVFSYKHLQCFSEDDLCLEAALVKAVKSDNL

ELIRLFVDWGANPEYGLIRVPAVYLKRLCAELGGLTPVSEPRLLEILKEVARLKSCAGVLLGYDMFCHNPLLETVTRTTLDTVTYTCSN

IPLTGDTAHHLLTKFWFALALRHNFTKAIHYFYKRHKNHLYWRVACSLYFNNIFDIHELCREKEICISPNLMMKFACLREKNYAAIYYC

HRLGASLDYGMNLSIYNNNTLNMFFCIDLGGCRF"

MGF_360-14L基因全長(zhǎng)及其兩端序列

TAATAACGCTAGAAGGCTTGTTTATAAGACAGTCATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATGACTTAG

TCTATAACTATAATTTCTGGATGGGCTGTAAGATACTCTTCGGCTCGTTTCAGATTTTTTGAAGTATATGTCTTTAGCATATCATATAT

TTCCTGGGGTTCGGTTACATCTAATACCAAGGTCACATCACGGCTGAAAAGCTGCTTTACTAAGAAAATGTTGCTCAAGTTATACATAT

AAGCTTTGTGCGCAATGAGTTGTGCCCTATCAAAATCGGCAGCCCCCCAAATCAATACAGAAAAACATGTTTAAAGTATTATTGTTATA

GATAGAAAGATTCATGCCATAATCGAGACTAGCCCCCAACCTATGACAGTAATAAATGGCCGCGTAATTTTTTTCCCGCAAGCAAGCAA

ATTTCATCATCAGATTAGGGCTGATGCAAATCTCTTTTTCACGACACAACTCGTGTATGTCAAAAATGTTATTAAAATAAAGGCTACAA

GCTACCCGCCAATAGAGGTGATTTTTATGCCTTTTATAGAAATAGTGAATAGCCTTTGTAAAATTATGTCGTAATGCCAGGGCAAACCA

AAACTTTGTTAATAGGTGGTGCGCCGTATCCCCCGTCAACGGAATGTTTGAACAGGTGTACGTAACTGTGTCTAAAGTGGTTCTAGTTA

CGGTTTCCAAGAGTGGATTATGACAAAACATGTCATAACCCAGCAGAACTCCTGCACAGGATTTTAGCCTGGCCACTTCTTTTAAAAT

TTCCAGAAGACGGGGTTCGGATACAGGCGTTAAGCCTCCCAGTTCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACGGCAGGAACACGTATAAGC

CCATATTCAGGATTTGCGCCCCAATCCACAAATAAACGTATAAGTTCAAGATTATCGCTCTTCACGGCCTTTACTAGCGCCGCTTCGAG

ACAAAGATCATCCTCAGAAAAACACTGTAAATGTTTATACGAAAAAACTTGCTTACAATTGTTACATAGGTGAATAGGACCTAAATCCC

ACCACAAACCAAAACGCTGCAACGTATAATCATAGTCACTTGAAAGATAATTGCATGCCACAACTTTTTTGGCCAACGTTTGTAAAGAC

AACATACTAAGTTTAAAACATCTTAAATCTAAGCTAGCTAACTTTCAAGAAAACCCTCTATCCCTAAGAATATATCTTATAACTAGACT

TATAGCAGTAAAAATCAACTTTGGTTATTCTTTTTAATATAAAACGTCTAATTACTTGCAAAGGACTATAAAGCCCA

注：劃線(xiàn)部分為質(zhì)粒pCAGGS-3M構(gòu)建用引物覆蓋部分，加粗部分為非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、Ⅰ型弱毒株和

Ⅱ型毒株鑒別三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中CY5通道檢測(cè)靶標(biāo)（MGF_360-14L基因）所使用引物、探針序列覆蓋部分。

B.4pCAGGS載體質(zhì)粒圖譜及序列

質(zhì)粒圖譜

10

T/CVMAXXXXX—XXXX

PropagationinE.coli

（1）克隆菌株：DH5α、TOP10、XL1-Blue等均可。

（2）原核抗性：Amp+，工作濃度建議為100ug/ml。

（3）培養(yǎng)溫度：37℃。

DNA序列

GTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA

CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT

AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGC

CCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC

TACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAA

TTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGCCGCGCGCCAGCCGGGGCGGGGCGGGGCGA

GGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGC

GGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGC

CGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGT

TTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGG

GGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTT

TGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGC

GGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGA

GCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGC

11

T/CVMAXXXXX—XXXX

CGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGA

GCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGC

GCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGC

GCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCT

TCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTT

GTTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGAGCTCATCGATGCATGGTACCCGGGCATGCTCGAGCTAGCAGATCTTTTTCCCTC

TGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT

GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCA

ACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTAT

TCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTA

CATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCA

GCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGC

ATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT

GTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTC

CGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT

GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCA

CAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGC

TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCG

GTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT

GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC

ACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGC

TCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAG

GTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTA

ACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTA

GGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGT

TACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTA

CGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATT

TTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTA

AACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCC

CCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCA

GATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTG

TTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGT

CGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCC

TTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCAT

GCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCC

CGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCA

AGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTC

TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTC

AATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCG

CGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG

12

T/CVMAXXXXX—XXXX

B.5內(nèi)標(biāo)序列片段（67bp）

TGGTACATGGCGGCGAATAACAGCATCCAGGGCCATTCAGATGTCGGAGACATCAGCTTCTCGCCGA

注：加粗部分為豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒、豬delta冠狀病毒三重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法中檢測(cè)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)

（HEX/VIC通道）所使用引物、探針序列覆蓋部分。

B.6pUC57載體質(zhì)粒圖譜及序列

質(zhì)粒圖譜

DNA序列

GAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAAT

CATGGTCATAGCTGTTTCCT