維生素C的檢測方法研究國內外文獻綜述目錄TOC\o"1-3"\h\u2094維生素C的檢測方法研究國內外文獻綜述 1283711.1滴定法 1133181.2電化學法 1176541.3色譜法 2196421.4熒光檢測法 2125781.5比色法 2Vc是一種很容易被氧化的不穩(wěn)定物質，加熱、金屬離子的存在都會加速Vc的氧化，因此，測定新鮮水果和蔬菜中的Vc含量對于人類膳食指導尤為重要。1.1滴定法滴定法包括氧化還原滴定法和電位滴定法。氧化還原滴定法包括碘量法和2,6-二氯靛酚滴定法。碘量法是通過添加的碘與具有強還原性的Vc發(fā)生氧化還原反應，當?shù)庖哼^量時指示劑淀粉與之發(fā)生反應產(chǎn)生藍色即到達滴定終點，通過計算碘標準液用量間接測定Vc含量（GB5009.86-2016）；后者則是是在酸性溶液中還原2,6-二氯靛酚染料，通過計算染料用量間接測定Vc含量。該方法測定結果比較準確，但在測定時對于滴定終點的判斷存在較大試驗誤差，樣品的堿度也會影響測定結果。且果蔬或生物材料中存在單寧、甜菜堿和巰基化合物等易被染料氧化的物質，僅適用于脫氫抗壞血酸濃度可忽略不計的情況，這些缺陷限制了該方法在食品領域的廣泛應用。電位滴定法是通過測量電位的變化來確定滴定終點，其對溶液的渾濁度和顏色抗干擾性良好。陳秋麗等采用該方法測定了9種果蔬樣品中的Vc含量，試驗結果顯示回收率在80-120%之間，且變異系數(shù)小，但此方法耗時、煩瑣（陳秋麗等2004）。兩點電位滴定法在測定過程中只需記錄2次數(shù)據(jù)，因此在一定程度上克服了傳統(tǒng)電位滴定法的不足。陳志慧分別采用兩點滴定法與傳統(tǒng)的電位滴定法測定了荔枝中Vc的含量，結果表明兩種方法相對誤差僅為0.1%（陳志慧2006），可見兩種方法具有相同的準確度。1.2電化學法電化學分析法是在電化學池中發(fā)生的電化學反應，電化學池是由兩個電極和電解質溶液組成，而且兩電極用外電路接通（楊玲2015）。相比于傳統(tǒng)檢測法，該法在檢測Vc時直接利用電信號的變化實現(xiàn)Vc氧化還原，該法易自動控制、儀器設備自動化且簡單，目前已被廣泛應用于水果、蔬菜中Vc的快速檢測。根據(jù)所測量電學量的不同，主要分為毛細管電泳法，電導分析法，電位/庫侖滴定法，極譜分析法，伏安法（左春艷2012）。其中伏安法是最常見的測定Vc含量的電化學分析法，可以通過修飾電極的策略提高方法的選擇性和靈敏性。然而，Vc在金屬電極或玻碳電極上的過電位較大，其氧化產(chǎn)物吸附在電極表面后容易污染電極，從而降低電極靈敏度。1.3色譜法色譜法被公認為是一種具有高靈敏度和高選擇性的檢測方法，能夠簡便地確定被分析物含量。色譜法中的液相色譜法（HPLC）因操作自動化、分析結果可靠等優(yōu)點廣泛用于分析復雜基質中的檢測物。在測定果蔬中Vc的過程中，Vc的提取環(huán)節(jié)異常重要，Vc在堿性條件下容易被氧化，故需要選擇合適的提取溶劑以確保果蔬樣品的穩(wěn)定性，如高離子強度酸性提取溶劑，可通過破碎細胞和沉淀蛋白質抑制代謝活性。由于偏磷酸可以防止Vc的氧化，也被用作Vc的提取保護劑，草酸也被用來提取Vc，且草酸的價格較偏磷酸便宜、低毒。另外，HPLC測定Vc時耗時較長，可能會導致測量值低于實際值，而且由于設備原因不適合用于現(xiàn)場檢測，為此開發(fā)一種靈敏、快速、適于現(xiàn)場檢測的Vc分析方法是必要的。1.4熒光檢測法熒光檢測法是利用物質的熒光特性進行定性或定量分析的一種方法。在測定Vc含量的方法中，熒光分析法因其對樣品低要求、低成本和高效率而備受關注，其中碳納米材料已被證實可用于構建熒光傳感器。Lu等人設計了一種基于靶點引發(fā)的解離的猝滅劑策略，用于熒光檢測Vc，SiNPs的熒光可以通過表面能轉移和內部濾光效應過程被羥基氧化鈷納米顆粒（CoOOHNPs）淬滅，維生素C可以通過與CoOOHNPs反應生成Co2+導致CoOOHNPs分解，在此過程中SiNPs的藍色熒光恢復，為測定復雜食品基質中的Vc提供了一種新穎實用的方法（Luetal.2019）。然而，大多數(shù)此類熒光傳感器都包含有毒金屬離子或有機試劑，這些物質對環(huán)境和食品安全都是有害的，因此，開發(fā)一種檢測食品中Vc的有效環(huán)保型熒光傳感器的仍然迫在眉睫。1.5比色法該法以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過比較或測量有色物質溶液色度差來確定待測組分含量。該法因直觀、低成本、無需大型儀器設備和可實現(xiàn)直接現(xiàn)場檢測等優(yōu)點而備受人們關注。Yao等人利用具有有效的內源過氧化物酶性質的氨基功能化銅金屬有機骨架納米粒子（Cu-BDC-NH2NPs）提出了一種快速、靈敏的抗壞血酸（AA）的比色分析策略，如圖1-2所示，Cu-BDC-NH2NPs催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB）生成藍色的氧化態(tài)TMB（oxTMB）。AA可以減少ox-TMB的生成，導致生成的藍色明顯退色以及吸光度的減小。結果表明該比色方法具有在0.5-60μmol/L的檢測范圍內具有較低的檢測限，為0.15μmol/L。除此之外，Cu-BDC-NH2NPs傳感系統(tǒng)還可以成功應用于比色檢測人血清、食品和制藥樣本中的AA，為檢測AA提供高選擇性、靈敏的光學傳感系統(tǒng)、開發(fā)具有模擬酶活性的金屬有機骨架納米顆粒在比色生物傳感中的廣泛應用提供新的平臺（Yaoetal.2019a）。圖1-2（A）存在不同濃度AA時溶液體系的照片（AA從左到右的濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/L）（B）不同濃度AA存在時的紫外吸收光譜（C）ΔA與AA濃度的關系圖（插圖：檢測AA的線性校準圖）（Yaoetal.2019a）Fig.1-2(A)PhotographsofthesolutionsystemsintheabsenceandpresenceofdifferentconcentrationsofAA.(ConcentrationsofAAfromlefttorightare0,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90and100mM,respectively.)(B)UV-visabsorptionspectraoftheproposedsysteminthepresenceofdifferentconcentrationsofAA.(C)RelationshipofDAandtheconcentrationofAA.(Inset:thelinearcalibrationplotfordetectionofAA)（Yaoetal.2019a）比色法是基于顏色變化的原位視覺觀測，不需要借助復雜的儀器，因此在現(xiàn)場快速檢測領域具有潛在的應用價值。目前各種納米材料已廣泛應用于Vc檢測以及其他各種目標分子的比色檢測，特別是基于酶的納米材料的傳感器已經(jīng)成為一個相當重要的比色平臺（Huangetal.2019a）。酶是具有高催化特異性和反應活性的一種生物催化劑，因其催化特異性、效率高、環(huán)境友好等特性廣泛應用于比色法中。天然酶是一類高效的生物催化劑，主要由蛋白質組成，少數(shù)是RNA分子。天然酶具有高催化活性、底物特異性和反應條件溫和等特性，在傳感、生物醫(yī)學、農業(yè)科學和食品加工等領域有著廣泛應用（Huangetal.2019b）。然而，天然酶催化活性不穩(wěn)定、制備和純化工藝復雜、回收困難、價格高昂以及難以滿足現(xiàn)在工業(yè)的需求等，這些缺陷限制了它們的進一步應用。因而，開發(fā)具有強穩(wěn)定性、低成本及制備簡單等優(yōu)點的模擬酶來滿足現(xiàn)代工業(yè)需求必將成為趨勢。模擬酶是一種人工合成的具有類天然酶活性的催化劑材料，不僅具有天然酶高效的催化性活性，還能克服天然酶穩(wěn)定性差的缺點。目前，模擬酶的研究已取得很多成果，開發(fā)出了大量新型高效的模擬酶，如卟啉、血紅素、血紅蛋白、蛋白質、樹枝狀分子、超分子等（Songetal.2019b）。傳統(tǒng)的模擬酶主要從天然酶的金屬離子、活性中心結構、整體模型三個方向模擬，其具有價格便宜、熱穩(wěn)定性好以及耐酸堿等優(yōu)點。但仍存在一些猶如催化效率低、催化活性位點單一、難重復利用等缺陷，因此發(fā)展一種具有高活性、穩(wěn)定性強且易制備的新型模擬酶成為人們研究的熱點問題。納米技術的發(fā)展為上述問題提供了思路，其具有的獨特理化性質不僅賦予納米酶多樣化的功能，還為有針對性的設計材料以及潛在的應用領域創(chuàng)造了條件。納米酶這一專業(yè)術語是Manea等人在2004年提出來的，特指具有出色類酶活性的納米材料，用于描述由三氮雜環(huán)環(huán)烷圖1-3近年來納米酶應用于生物傳感、環(huán)境處理、抗菌、癌癥治療和細胞保護等領域（Wuetal.2019）Fig.1-3Inrecentyears,nanoenzymeshavebeenusedinbiosensorsforenvironmentaltreatmentofantimicrobialcancertherapyandcellprotection.（Wuetal.2019）官能化硫醇自組裝到金納米顆粒表面上形成的基于金納米顆粒的轉磷酸化作用模擬物（Maneaetal.2004）。2007年，Gao等第一次提出磁性納米顆粒可以用來模擬辣根過氧化物酶的催化（Gaoetal.2007）。2013年，WeiandWang論述了具體關于納米酶的定義，既具有類酶活性的納米材料（WeiandWang2013）。到目前為止，如圖1-3所示，研究人員開發(fā)出大量具有各種類酶活性的納米材料應用于生物傳感、環(huán)境處理、抗菌、癌癥治療及細胞保護等領域中（Huetal.2017;Muetal.2019;Sangetal.2019;Fanetal.2018;Sohetal.2017;Wuetal.2019），對提高人類生命質量以及改善自然環(huán)境做出巨大貢獻。各種各樣的納米材料被報道出具有類酶活性，主要包括層狀雙金屬氫氧化物納米材料、碳基納米材料、金屬納米材料及金屬氧化物納米材料。（1）層狀雙金屬氫氧化物納米酶層狀雙金屬氫氧化物（Layereddoublehydroxides,LDHs）是一類具有層狀結構的無機功能材料（周潔2015），結構如圖1-4所示。LDHs通常用公式[[MII1-xMIIIx(OH)2][Anx/n]xH2O]表示，其因巨大的表面積和獨特的物理化學性質在在傳感器、催化、能源設備和生物醫(yī)學應用領域成為一個熱門的研究話題（Sunetal.2014）。近年來，被報道出一些典型的層狀雙金屬氫氧化物具有類氧化酶和類過氧化物酶活性（Fanetal.2014）。例如，通過共沉淀法改進合成的CoFe-LDH納米片用于模擬過氧化物酶，制備的CoFe-LDH納米片具有優(yōu)異的類過氧化物酶，在酸性條件下H2O2催化氧化TMB，在較寬范圍的pH（2-10）和溫度（0-60°C）條件下處理后，并在水溶液中保存2個月后仍能保持其催化活性，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（Zhangetal.2012）。另外，材料結構的不同會帶來意想不到的結果。Zhao等以六方相溶致液晶為納米反應器，也合成了具有分層繩索狀結構的CoFe-LDH納米片（Zhaoetal.2013），制備得到的CoFe-LDHs納米片具有較強的類氧化酶活性，可通過溶解氧氧化底物TMB。動力學研究結果顯示，以TMB為底物時，米氏常數(shù)Km值低至0.05mmol/L，遠遠低于辣根過氧化物酶（HRP）和許多典型納米酶的Km值，表明CoFe-LDHs納米片對TMB有非凡的親和力。層次分明的繩狀結構對其類氧化酶活性高低起著重要作用。相比之下，在沒有表面活性劑的情況下合成的20-30nm納米片和添加表面活性劑（曲拉通）制備得到的表面形貌為納米片或小顆粒的樣品，其類氧化酶活性更低。圖1-4LDHs的結構圖（Sunetal.2014）Fig.1-4StructurediagramofLDHs.（Sunetal.2014）（2）碳基納米酶隨著納米制造技術的迅速發(fā)展，愈來愈多的碳基納米材料被合成且被報道具有內在的類過氧化物酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，功能化的羧基和羥基對過氧化物酶的性質起著重要的作用。Song等報道的羧基修飾氧化石墨烯（GO-COOH）可在H2O2的幫助下催化TMB氧化，表現(xiàn)出良好的類過氧化物酶活性（Songetal.2010）。動力學研究結果表明，氧化石墨烯的-COOH對TMB底物的親和力高于HRP，表現(xiàn)出優(yōu)異的催化效率。由于羧基和羥基的修飾，GO-COOH與過氧化物酶底物H2O2和TMB之間的相互作用促進了電子的轉移從而提高了類過氧化物酶的活性。除石墨烯，自2004年首次報告碳點，其因獨特的物理化學特性而受到越來越多的關注（Xuetal.2004）?，F(xiàn)已有研究報道，碳點（CDs）也擁有固有的類過氧化物酶活性，可以作為高效的納米酶，這是因為CDs可以接收TMB氨基上的孤對電子，并能將電子轉移到H2O2（Zhengetal.2013）。石墨烯量子點是一種典型的碳點，可由石墨烯或小分子熱解制備。研究發(fā)現(xiàn)，由于石墨烯量子點具有更小的體積，與氧化石墨烯相比，它有著更高的類過氧化物酶催化活性。此外，如單鏈碳納米角（SWCNHs）的碳材料也被報道表現(xiàn)出優(yōu)異的類過氧化物酶的活性，而且羧基功能化的單鏈碳納米角在溫度和pH條件下比HRP具有更高的穩(wěn)定性（Zhuetal.2015）。（3）金屬納米酶金屬納米酶具有優(yōu)異的電子性能和生物相容性，廣泛應用于電催化、傳感和生物醫(yī)學等領域（Cobleyetal.2011），其中貴金屬類納米材料的研究頗多。Jv等報道了帶有正電荷、平均粒徑為34nm、zeta電位約為+11.3mV的金納米顆粒，具有較強的類過氧化物酶活性，這與其修飾的半胱胺的NH3+基團有關（Jvetal.2010）。研究結果表明，與帶有正電荷的金納米顆粒相比，檸檬酸修飾的帶有負電荷的金納米顆粒的類過氧化物酶催化活性要低得多。研究者們進一步探究了配體對酶類催化活性的影響（Wangetal.2016;Zhaoetal.2015;Jiangetal.2017），結果表明，pH值在決定酶類效率方面起著至關重要的作用。例如，金納米顆粒通常在酸性溶液（pH=4.0左右）中表現(xiàn)出最大的類過氧化物酶活性，但在生理pH值時則相當?shù)?，從而限制了在生物方面的應用（Heetal.2013）。對此問題可以通過在中性條件下引入肝素可以顯著提高金納米顆粒的類過氧化物酶活性，這是因為底物TMB與肝素修飾的帶負電荷金納米晶之間的靜電相互作用有助于增強金納米顆粒的催化活性（Huetal.2018）。除具有類過氧化物酶活性外，金納米顆粒還被證明具有類氧化酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶活性（Lienetal.2013;Caoetal.2016;Borgheietal.2018;Luoetal.2010）。有研究證明金納米顆粒表面金屬離子的沉積可以控制酶模擬的類型（Lienetal.2013）。如圖1-5所示，在金納米顆粒表面用Ag+、Bi3+或Pb2+修飾后，可獲得較強的類過氧化物酶活性；然而，分別修飾Ag+/Hg2+和Hg2+/Bi3+后，表現(xiàn)出優(yōu)良的類氧化酶和類過氧化氫酶活性，這一結果證實了金納米顆粒的氧化狀態(tài)在類酶活性性質中起著關鍵作用。另外，小尺寸的金納米顆粒能夠催化葡萄糖氧化生成葡萄酸鹽和H2O2，可以模擬天然的葡萄糖氧化酶，且與天然葡萄糖氧化酶相比，制備的具有類葡萄糖氧化酶的金納米顆粒具有更好的pH、熱穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性（Luoetal.2010）。圖1-5金納米顆粒經(jīng)金屬離子修飾后表現(xiàn)出（A）過氧化物酶、類氧化酶和（B）類過氧化氫酶活性的示意圖（Lienetal.2013）Fig.1-5SchematicillustrationsofAunanoparticlesexhibiting(A)peroxidaseandoxidase-likeand(B)catalase-likeactivitiesaftermodificationwithmetalions.（Lienetal.2013）與金納米顆粒類似，鉑、鈀、銀納米顆粒也作為生產(chǎn)酶的模擬物相繼出現(xiàn)（Liuetal.2014;Weietal.2015;Songetal.2019a）。例如Liu等報道的鉑納米顆粒通常在酸性溶液中表現(xiàn)出優(yōu)良的類過氧化物酶活性，在中性和堿性介質中表現(xiàn)出明顯的過氧化氫酶和清除1O2自由基活性，而在中性溶液中具有超氧化物歧化酶活性（Liuetal.2014）。Rostami等人基于銀納米粒子（AgNPs）的種子介導生長建立了一種簡單、靈敏的檢測抗壞血酸（AA）的方法，生長液中存在的銀離子通過與AA的氧化還原反應還原為銀種子表面的銀原子，如圖1-6所示。在420nm處出現(xiàn)紫外吸收帶，這是由于AgNPs局部表面產(chǎn)生的等離子體共振峰，導致體系溶液顏色由無色變?yōu)辄S色。試驗結果表明，該比色傳感器在0.25-25μmol/L的檢測范圍內具有較低的檢測限，為0.054μmol/L。另外，該方法對AA檢測具有較高的選擇性且可與AA共存（RostamiSetal.2016）。聚乙烯吡咯烷酮修飾的銥納米粒子和檸檬酸鹽覆蓋的釕納米粒子均可作為高效酶模擬物，研究表明出它們具有內在的過氧化氫酶和過氧化物酶樣活性（Suetal.2015;Cholevaetal.2018）。銥納米顆粒粒徑?。▋H1.5nm），不僅具有較好的過氧化氫酶和過氧化物酶活性，而且還有著良好的生物相容性和抗氧化性，適于生物醫(yī)學方面的應用（Suetal.2015）。除貴金屬納米材料外，納米銅等非貴金屬也因其合成容易、催化活性高、成本低而被認為是一種高效的酶仿生材料（Yanetal.2017b;Xuetal.2016）。更有趣的是，包覆有牛血清白蛋白的銅納米團簇在pH值（2.0-10.0）和溫度（20-80°C）范圍內均表現(xiàn)出非常穩(wěn)定的催化活性，也進一步擴大了其在生物化學和環(huán)境工程領域的應用。牛血清白蛋白修飾的銅納米團簇之所以擁有的優(yōu)異的穩(wěn)定性可能與銅組分的內在特性有關，這也是啟發(fā)研究者們關注這類材料的原因之一。圖1-6（a）銀納米顆粒比色檢測AA的照片；（b）不同AA濃度在420nm處的吸收變化校準曲線（RostamiSetal.2016）（A）銀納米顆粒比色檢測AA的照片；（B）不同AA濃度在420nm處的吸收變化校準曲線Fig.1-6(a)PhotographofAgNPssolutionforcolorimetricdetectionofAA.(b)Calibrationcurveoftheabsorptionchangeat420nmwithdifferentconcentrationsofAA.（RostamiSetal.2016）（4）金屬氧化物納米酶除上述納米材料外，金屬氧化物基納米材料也是制造高效模擬酶的潛在材料之一（Heetal.2014）。其中，F(xiàn)e3O4具有較強的類過氧化物酶活性，在生物傳感等方面具有良好的應用前景（Chenetal.2012;Chenetal.2018）。Gao等首次報道不同尺寸的Fe3O4納米顆?？梢源呋孜颰MB、重氮氨基苯（DAB）和鄰苯二胺（OPD）氧化，溶液分別呈現(xiàn)藍色、棕色和橙色，表現(xiàn)出較強的類過氧化物酶活性（Gaoetal.2007），（圖1-7），其中潛在的原因可能是納米Fe3O4中亞鐵離子的存在對其類過氧化物酶活性起主導作用。動力學試驗結果顯示，相比于HRP，F(xiàn)e3O4納米顆粒具有更低的Km值，說明Fe3O4納米顆粒對TMB的親和力更強。CeO2納米酶具有良好的類氧化酶活性，可以催化一系列有機染料和小分子的氧化。Asati等通過分別制備葡聚糖和聚丙烯酸包覆的CeO2納米顆粒，探究了材料的類酶活性（Asatietal.2009b）。葡聚糖和聚丙烯酸包覆的CeO2納米顆粒在酸性介質中表現(xiàn)出類氧化酶活性，該活性與pH、CeO2納米顆粒的大小、聚合物涂層的厚度密切相關，較低的pH值（4.0）、較小的CeO2尺寸和較薄的聚合物涂層均可使CeO2納米顆粒具有更高的類氧化酶活性。此外，CeO2納米材料還可以模擬其他類型的酶。例如CeO2-x納米棒還具有類脲性質，它可以催化尿素水解，類脲酶催化活性（Kcat）估計為每秒95.8，僅略低于天然的洋刀豆脲酶（Korscheltetal.2018）；而且CeO2-x納米棒具有成本低、生物相容性好、長期穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可作為一種綠色酶的替代品。Lian等制備了苝酰亞胺（PDI）修飾的磁性gamma--Fe2O3/CeO2納米顆粒（gamma-Fe2O3/CeO2-PDI），具有良好的過氧化物酶活性。由于PDI的修飾，gamma-Fe2O3/CeO2-PDI比gamma-Fe2O3/CeO2具有更多表面缺陷（Ce3+）和活性氧物種，因此具有更加優(yōu)異的催化性能，對Vc也表現(xiàn)出較好的選擇性，在生物醫(yī)學和食品分析領域具有廣闊的應用前景（Lianetal.2019）。與Fe3O4和CeO2類似，VOx納米材料也表現(xiàn)出優(yōu)異的類酶性能（Andreetal.2011;Sunetal.2016）。Andre等制備的V2O5納米線在酸性條件下（pH=4.0），類過氧化物酶活性最佳（Andreetal.2011），動力學試驗結果表明，V2O5納米線的Km值遠低于辣根過氧化物酶，表明底物對V2O5納米線有更好的親和力。此外，通過水熱反應合成的平均寬度為103.1nm的VO2納米帶也是一種有效的過氧化物酶模擬物（Nieetal.2014），而且基于VO2納米帶的類過氧化物酶催化反應的機理遵循雙底物反應的順序原理。圖1-7（A）不同粒徑的Fe3O4納米顆粒的TEM圖；（B）Fe3O4納米顆粒催化H2O2氧化底物TMB、DAB和OPD產(chǎn)生不同的顏色；（C）類過氧化物酶催化反應示意圖（Gaoetal.2007）Fig.1-7(A)TEMimagesofFe3O4nanoparticleswithvaried