(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專(zhuān)利62/954,7382019.12.30US地址中國(guó)臺(tái)灣花蓮市(72)發(fā)明人李原杰孫立易公司11314A61P27/02(2006.01)TW201510220A,2015.03.16mesenchymalstemcellcondiofhepatocytesinacetaminophen-induced審查員張婷本公開(kāi)提供一種預(yù)防或治療眼疾的組合物數(shù)小時(shí)于以胎牛血清及間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑補(bǔ)充的培養(yǎng)基中，以取得間質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)開(kāi)也提供用于預(yù)防或治療例如干眼癥的眼部上對(duì)照組R21.一種醫(yī)藥組合物在制備用于預(yù)防或治療有其需要的個(gè)體中眼部上皮組織病癥的用途，所述醫(yī)藥組合物包含治療有效量的生物活性制劑，所述生物活性制劑包含如下制備的組合物：取得間質(zhì)干細(xì)胞；于培養(yǎng)基中維持所述間質(zhì)干細(xì)胞；自采集的所述培養(yǎng)基中取得含有分子量小于10kDa的活性成分的部分；其中所述培養(yǎng)基添加有血清及間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑；其中所述間質(zhì)干細(xì)胞自脂肪組織取得；其中所述眼部上皮組織病癥為干眼癥；以及其中所述間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑包含纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、N-乙?；?L-半胱氨酸及L-抗壞血酸-2-磷酸鹽中的至少其中一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述血清為胎牛血清或人類(lèi)血清，其在所述培養(yǎng)基中的濃度介于5%至15%的范圍。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在所述間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑中的濃度范圍為5ng/mL至15ng/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述N-乙?；?L-半胱氨酸在所述間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述L-抗壞血酸-2-磷酸鹽在所述間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑中的濃度范圍為0.1mM至0.5mM。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中含有所述活性成分的所述部分的分子量小于3kDa。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中含有所述活性成分的所述部分的分子量小于1kDa。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述間質(zhì)干細(xì)胞于所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2代。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述間質(zhì)干細(xì)胞自另一個(gè)體取得。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述另一個(gè)體是哺乳動(dòng)物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述另一個(gè)體是人類(lèi)。12.一種組合物，其由根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所取得的小于10kDa的所述部分和藥學(xué)上可接受的載體所組成。3預(yù)防或治療眼疾的組合物及方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本公開(kāi)涉及脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，尤其涉及用于預(yù)防或治療眼部病癥的脂肪來(lái)源干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。本公開(kāi)也涉及制備脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法。背景技術(shù)[0002]干眼綜合征(dryeyesyndrome,DES)或干眼征的發(fā)病率日趨增加。干眼造成眼部不適并損害視覺(jué)品質(zhì)(1)。目前用于干眼綜合征的治療策略包括提供潤(rùn)滑劑、抗炎藥物諸如皮質(zhì)類(lèi)固醇或環(huán)孢素、淚點(diǎn)阻塞法、甚或自體血清。淚點(diǎn)阻塞法降低淚膜損失，但增加淚膜中的炎性細(xì)胞激素或酶(2)。外用使用自體血清滴液提供模擬天然淚液的潤(rùn)滑以及某些生化組分。但自體血清的制備及保存不便利，且其對(duì)于干眼的癥狀及征候的效果不一致或缺少效果(3)。由于傳統(tǒng)治療方法于日常實(shí)踐中并不理想，因此需要進(jìn)一步探索。[0003]據(jù)信，干細(xì)胞于退化性病變中具有極佳的功用，且已有報(bào)導(dǎo)，干細(xì)胞產(chǎn)生的旁分泌因子可增強(qiáng)組織再生及愈合作用(4-6)。它們于上皮損害中的修復(fù)能力及抗炎效果也業(yè)經(jīng)證明(7,8)。由于角膜及結(jié)膜上皮損害及發(fā)炎是干眼的兩個(gè)重要肇因，故干細(xì)胞及旁分泌因子對(duì)干眼的效果值得更深入的研究。盡管干細(xì)胞自身可能具備致腫瘤特性及抗原特性，但相關(guān)領(lǐng)域中亟待解決的問(wèn)題是研發(fā)用于有效預(yù)防或治療干眼的醫(yī)藥組合物。發(fā)明內(nèi)容[0004]本公開(kāi)提供一種治療有此需要的個(gè)體的眼部上皮組織病癥的方法，包括向所述個(gè)體投予治療有效量的生物活性制劑，該生物活性制劑包含通過(guò)下述制備的組合物：獲得間質(zhì)干細(xì)胞；于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該間質(zhì)干細(xì)胞；采集該培養(yǎng)基；以及從采集的該培養(yǎng)基中取得小于30kD的部分(fraction)。于至少一個(gè)實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基添加血清(serum)及間質(zhì)干細(xì)血清為胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)或人類(lèi)血清，其于培養(yǎng)基中的濃度范圍為5%至15%。于某些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基添加10%血清及間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑。于某些實(shí)施方案中，該血清(例如FBS)以5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的[0005]于至少一個(gè)實(shí)施方案中，間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑包含纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(L-ascorbicacid-2-phosphate,AsA2P)中的至少其中一種。于某些實(shí)施方案中，該纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑中的濃度范圍為5ng/mL至15ng/mL。于某些實(shí)施方案中，該纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑中的濃度為5ng/mL、6ng/mL、7ng/[0006]于至少一個(gè)實(shí)施方案中，N-乙酰基-L-半胱氨酸在間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑中的濃4[0007]于至少一個(gè)實(shí)施方案中，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽在間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑中的濃[0008]于某些實(shí)施方案中，間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基包含約10ng/mL纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)、約2mMN-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及0.2mML-抗壞血酸-2-磷酸鹽(L-ascorbicacid-2-phosphate,AsA2P)。[0009]于至少一個(gè)實(shí)施方案中，間質(zhì)干細(xì)胞于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2次傳代，例如3次傳代、4次傳代或5次傳代。[0010]于至少一實(shí)施方案中，間質(zhì)干細(xì)胞自一個(gè)體獲得，其中所述個(gè)體為另一個(gè)體。于某間質(zhì)干細(xì)胞自一個(gè)體的脂肪組織獲得。[0011]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)也提供一種組合物，其包含以如下方式制備的小于30kDa的部分：自個(gè)體獲得間質(zhì)干細(xì)胞；于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該間質(zhì)干細(xì)胞；采集該培養(yǎng)基；以及從采集的該培養(yǎng)基中獲得小于30kD的部分。[0012]于至少一個(gè)實(shí)施方案中，從采集的該培養(yǎng)基中獲得小于10kDa(例如小于8kDa、小[0013]于本公開(kāi)的至少一實(shí)施方案中，本公開(kāi)也提供一種組合物外用于治療眼部上皮組織病癥的用途，該組合物包含小于30kDa的部分。于某些實(shí)施方案中，該眼部上皮組織病癥為干眼癥。于某些實(shí)施方案中，該干眼癥由以下至少一種原因造成：淚液缺乏、干燥空氣或老化。[0014]本公開(kāi)提供一種治療有此需要的個(gè)體的干眼綜合征的方法，包括向所述個(gè)體投予治療有效量的生物活性制劑，該生物活性制劑包含通過(guò)下述制備的組合物：獲得脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(adipose-derivedstemcell,ADSC);于第一培養(yǎng)基中維持該脂肪來(lái)源的干細(xì)胞；于第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)該脂肪來(lái)源的干細(xì)胞；采集該第二培養(yǎng)基；以及從采集的該第二培養(yǎng)基獲得小于30kD(<30kDa)的部分(fraction)。[0015]于某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種制備脂肪來(lái)源的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(adipose-derivedstemcell-condi肪來(lái)源的干細(xì)胞(ADSC);將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞維持于間質(zhì)干細(xì)胞維持培養(yǎng)基中；收集第2至5代的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞；將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞于以1mM至5mM谷氨酰氨、5%至15%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)及間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基佐劑(mesenchymalstemcellcultureadjuvant,MCA)補(bǔ)充的無(wú)酚紅伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養(yǎng)基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium,IMDM)中培養(yǎng)36小時(shí)至132小時(shí)，以獲得脂肪來(lái)源的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ADSC-CM);采集脂肪來(lái)源的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基；以及離心，之后過(guò)濾。于某些實(shí)以5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的量補(bǔ)充36小時(shí)、48小時(shí)、60[0016]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，ADSC-CM包含分子量小于30kDa的活性成分，例[0017]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM),5其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基是以前述方法獲得，并且該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培[0018]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0019]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM),其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基是以前述方法獲得，并且該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0020]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0021]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM),其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基是以前述方法獲得，并且該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0022]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的方法，包括將以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基投予至個(gè)體眼部，其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于30kDa的活性成分。[0023]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的方法，包括將以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基投予至個(gè)體眼部，其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0024]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的方法，包括將以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基投予至個(gè)體眼部，其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0025]本公開(kāi)還提供包含以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的組合物，其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于30kDa的活性成分。[0026]本公開(kāi)還提供包含以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的組合物，其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0027]本公開(kāi)還提供包含以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的組合物，其中該脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。附圖說(shuō)明[0028]通過(guò)閱讀下述實(shí)施例的說(shuō)明并參照所附圖示，可更完全地理解本公開(kāi)，其中：[0029]圖1顯示，在干燥應(yīng)激研究中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CellCountingKit-8,CCK-8測(cè)定)測(cè)量不同培養(yǎng)基制劑對(duì)于人角膜上皮細(xì)胞(HCEC)存活率的效果。令HCEC生長(zhǎng)至大約80%融合度，隨后令其空氣干燥10分鐘。干燥后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不同培養(yǎng)基中。溫育2小時(shí)后，使用CCK-8測(cè)定計(jì)數(shù)細(xì)胞。對(duì)照組代表未經(jīng)空氣干燥處理的HCEC。R代表清爽潤(rùn)滑表示以10ng/mL纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)、2mMN-乙酰基-L-半胱氨酸及0.2mML-抗壞血酸-2-磷酸酯補(bǔ)充的IM。ADSC-CM表示通過(guò)培養(yǎng)脂肪來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞而條件化的IMMCA。CEM表示以角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)試劑盒組分補(bǔ)充的角膜上皮細(xì)胞基本培養(yǎng)基。數(shù)值呈現(xiàn)為三6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,與對(duì)照組比較。#P<0.05,###P<0.001,與CEM組比較；[0030]圖2顯示，來(lái)自干燥應(yīng)激研究中的HCEC中JUK、P38及Erk1/2基因表達(dá)的免疫印跡分[0031]圖3顯示，經(jīng)不同滴眼液治療的圈養(yǎng)于人工氣候室(CEC)中的BALB/c小鼠的淚液體<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#代表與干燥對(duì)照組比較，#p代表與IMMCA組比較，&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001.%代表與清爽滴眼液組比較，%p<0.05,%%p<0.01,%%%p<0.001。均值±SEM,N=4.每日一次，將0.2%苯扎氯胺(BAK)投藥至每只眼睛；[0032]圖4顯示BALB/c小鼠的熒光素染色及孟加拉玫瑰紅染色。來(lái)自CEC的小鼠的角膜染無(wú)染色；1=輕微的點(diǎn)狀染色(<30點(diǎn));2=點(diǎn)狀染色(>30點(diǎn))但無(wú)彌散；3=嚴(yán)重的彌散染色，但無(wú)陽(yáng)性斑塊；以及，4=陽(yáng)性熒光素斑塊。角膜的孟加拉玫瑰紅染色評(píng)分如下：1=少量分離的點(diǎn)；2=眾多分離的點(diǎn)；以及，3=融合的點(diǎn)(最大得分為9分)。*p<0.05,與非干燥對(duì)照組連接屏障完整性的共焦顯微鏡檢查。BF:亮視野；[0034]圖6A至6E顯示，不同組的人工氣候室(CEC)誘導(dǎo)的干眼中，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的希夫氏過(guò)碘酸(PAS)染色結(jié)果。圖6A:非干燥對(duì)照組。圖6B至6E:來(lái)自CEC作為干燥對(duì)照組的小鼠(圖非干燥對(duì)照組比較，*p<0.05,***p<0.001。+代表與非干燥對(duì)照組比較，+p<0.05,+++p<[0036]圖7顯示，通過(guò)免疫組織化學(xué)分析，不同滴眼液對(duì)于CEC中的BALB/c小鼠的結(jié)膜上[0037]圖8A至8E顯示，來(lái)自使用不同滴眼液治療的圈養(yǎng)于CEC中的BALB/c小鼠的角膜的[0038]圖9A至9E顯示，來(lái)自使用不同滴眼液治療圈[0039]圖10A至10D顯示，于干燥應(yīng)激研究及高滲透壓應(yīng)激研究中，通過(guò)CCK-8測(cè)量不同培7[0040]圖11顯示，于干燥應(yīng)激研究中，通過(guò)CCK-8測(cè)量不同培養(yǎng)基制劑及ADSC-CM部分對(duì)于HCEC存活率的影響。數(shù)值呈現(xiàn)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<[0041]圖12顯示，于干燥應(yīng)激研究中，通過(guò)CCK-8測(cè)量不同培養(yǎng)基制劑及ADSC-CM的0-1kDa部分對(duì)于HCEC存活率的效果。數(shù)值呈現(xiàn)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值±SEM。*P<0.05,**P<[0042]圖13A至13C顯示，使用不同ADSC-CM部分治療圈養(yǎng)于CEC室中的小鼠的淚液體積。顯示了每組的淚液體積均值。*與非干燥對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#與干燥對(duì)照組比較，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。均值±SE誘導(dǎo)的干眼模型中，BALB/c小鼠的角膜上皮及角膜上皮緊密連接屏障完整性的共焦顯微鏡[0044]圖17A至17E顯示，不同組的CEC誘導(dǎo)的干眼中，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的PAS染色結(jié)果。圖17A:非干燥對(duì)照組。圖17B至17E:來(lái)自作為干燥對(duì)照組的CEC中的小鼠(圖17B),以及使用[0045]圖17F顯示，不同組的CEC誘導(dǎo)的干眼之間，結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。#與[0046]圖18A至18G顯示，不同組的CEC誘導(dǎo)的干眼中，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的PAS染色結(jié)果。圖18A:非干燥對(duì)照組。圖18B至18G:來(lái)自作為干燥對(duì)照組的CEC中的小鼠(圖18B),以及使用ADSC-CM(圖18C)、ADSC-CM>10kDa(圖18D)、ADSC-CMK10kDa(圖18E)、ADSC-CM>3kDa(圖18F)[0047]圖18H顯示，不同組的CEC誘導(dǎo)的干眼之間，結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。*與非干燥對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#與干燥對(duì)照組比較，#p<0.05,##p<[0048]圖19A至19F顯示，不同組的CEC誘導(dǎo)的干眼中，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的PAS染色結(jié)果。圖19A:非干燥對(duì)照組。圖19B至19F:來(lái)自作為干燥對(duì)照組的CEC中的小鼠(圖19B),以及使用[0049]圖19G顯示，不同組的CEC誘導(dǎo)的干眼之間，結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。*與非干燥對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#與干燥對(duì)照組比較，#p<0.05,##p<[0050]圖20A至20E顯示，小鼠結(jié)膜上皮中MUC16表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。圖20A:非滴眼液治療者及干燥對(duì)照組相比，經(jīng)ADSC-CM及ADSC-CM的0-30kDa部分治療者中的結(jié)膜MUC16表達(dá)更高。箭頭指示結(jié)膜上皮表面上的MUC16表達(dá)；[0051]圖21A至21G顯示，小鼠結(jié)膜上皮中MUC16表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。圖21A:非8示，與使用IMDM治療者及干燥對(duì)照組相比，經(jīng)ADSC-CM以及ADSC-CM的0-3kDa部分及ADSC-CM[0056]圖25A至25E顯示，來(lái)自使用不同滴眼液治療的圈養(yǎng)于CEC中的BALB/c小鼠的角膜的掃描電子顯微鏡檢查結(jié)果。圖25A:非干燥對(duì)照組；圖25B:干燥對(duì)照組；[0057]圖26A至26G顯示，來(lái)自使用不同滴眼液治療的圈養(yǎng)于CEC中的BALB/c小鼠的角膜[0058]圖27A至27F顯示，來(lái)自使用不同滴眼液治療的圈養(yǎng)于CEC中的BALB/c小鼠的角膜具體實(shí)施方式[0059]下列實(shí)施例用以例示本公開(kāi)?；诒竟_(kāi)的說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可構(gòu)思本公開(kāi)的其他方面。本公開(kāi)也可如不同實(shí)施例中所揭示般予以實(shí)施或應(yīng)用。對(duì)于不同方面及應(yīng)用，可修飾及/或變更實(shí)施例以完成本公開(kāi)而不抵觸其范疇。[0060]應(yīng)進(jìn)一步注意到，如本說(shuō)明書(shū)中所用，除非明確指出并毋庸置疑地限制為一個(gè)參[0061]本公開(kāi)提供一種治療有此需要的個(gè)體的干眼綜合征的方法，包括向所述個(gè)體投予治療有效量的生物活性制劑，該生物活性制劑包含通過(guò)下述制備的組合物：獲得脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(ADSC);于第一培養(yǎng)基中維持該脂肪來(lái)源的干細(xì)胞；于第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)該脂肪來(lái)源的干細(xì)胞；采集該第二培養(yǎng)基；從所采集的第二培養(yǎng)基中獲得小于30kDa的部分。9[0062]對(duì)于維持及培養(yǎng)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞，可使用不同類(lèi)型的培養(yǎng)基并由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。于至少一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基選自由α最小必需培養(yǎng)基(alphaminimumessentialmedium,MEM)、杜爾貝科氏改進(jìn)伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagle’科夫氏改良杜爾貝科氏培養(yǎng)基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium,IMDM)及AIM-V培養(yǎng)基組成的組。細(xì)胞可于包含胎牛血清或其他生長(zhǎng)因子的多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)以進(jìn)行擴(kuò)張。于至少一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至實(shí)質(zhì)上缺乏血清的培養(yǎng)基中，并且可通過(guò)各種手段執(zhí)行投予前的條件培養(yǎng)基制備；例如，可將條件培養(yǎng)基于一定條件下無(wú)菌過(guò)濾或濃縮。于某些實(shí)施方案中，條件培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟以獲得含有不同分子的不同部分，該不同部分的分子具有下列范圍的大?。捍笥?00kDa、大于30kDa、大于3kDa、大于1kDa、小于于1kDa、介于大于0kDa與100kDa之間、介于大于0kDa與30kDa之間、介于大于0kDa與3kDa之[0063]于某些實(shí)施方案中，條件培養(yǎng)基用于制造藥物制劑的活性成分。于至少一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可作為治療劑單獨(dú)投予。于某些實(shí)施方案中，投予可包括已知藥物制劑的方式，包括用于口服投予的片劑、膠囊劑或劑，用于直腸投予的栓劑，用于腸胃外或肌肉內(nèi)投予的無(wú)菌溶液，脂質(zhì)體或膠囊化制劑。于該等制劑劑中，治療劑單獨(dú)使用或偶聯(lián)至如遞送劑或媒介物等。應(yīng)知悉，本公開(kāi)的治療性實(shí)體將與被并入制劑中的合適載體、賦形劑及/或其他劑一起投予，以提供改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性含有媒介物(諸如Lipofectin)的脂質(zhì)(陽(yáng)離子性或陰離子性)、DNA偶聯(lián)物、無(wú)水吸收糊、水包油乳液及油包水乳液、乳液卡波蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠、以及含有卡波蠟的半固體混合物。前述混合物的任一者均可適用于根據(jù)本公開(kāi)的處理及治療，前提條件為制劑中的活性成分不被制劑滅活并且制劑與其投予途徑為生理上相容且可耐受。[0064]于一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)制備的組合物通過(guò)外用制劑投予。外用制劑可用于治粉末，并且可含有賦形劑諸如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如，脂肪酸、脂酸)、以及親水性聚合物(例如，聚卡波非及聚乙烯基吡咯烷酮)。于學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體或透皮增強(qiáng)劑。本公開(kāi)的外用制劑可包括皮膚學(xué)上可接受的載劑，例如，能夠?qū)⒅苿┑钠渌M分遞送至皮膚的物質(zhì)，那些組分可被皮膚可接受地施用或吸收。典型載體包括溶劑以溶解或分散治療劑，以及任選的一種或多種賦形劑或其他媒介物用制劑通過(guò)將本公開(kāi)的組合物與外用載體根據(jù)本領(lǐng)域周知的方法混合，例如，標(biāo)準(zhǔn)參考文開(kāi)的外用制劑中。本公開(kāi)的外用制劑可設(shè)計(jì)為留在皮膚上，并且于施用之后不會(huì)于短期內(nèi)被洗除?；蛘撸庥弥苿┛稍O(shè)計(jì)為使用之后于特定時(shí)間內(nèi)沖洗掉。[0065]本公開(kāi)提供一種制備脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM)的方法，包括從個(gè)體單離脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(ADSC);將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞維持于間質(zhì)干細(xì)胞維持培養(yǎng)基中；收集傳代2至5次的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞；將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞于以1mM至5mM谷氨酰氨、5%至科氏培養(yǎng)基(IMDM)中培養(yǎng)36小時(shí)至132小時(shí)，以獲得脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-L-半胱氨酸(NAC)及0.1mM至0.5mML-抗壞血酸-2-磷酸酯(AsA2P);采集該脂肪來(lái)源干細(xì)胞[0067]于本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案中，MCA包含約5ng/mL至15ng/mL纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2氨酸及約0.2mML-抗壞血酸-2-磷酸酯(AsA2P)。[0068]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括在過(guò)濾后冷凍的步驟。[0069]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是哺乳動(dòng)物。于某些實(shí)施方案中，該個(gè)體是[0070]于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于30kDa的活性成分。[0071]于本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0072]于本公開(kāi)的又一實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0073]本公開(kāi)也提供用于預(yù)防或治療干眼的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM)。于本公開(kāi)的至少一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。于本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0074]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“干眼”是指淚膜由于淚液不足或過(guò)度蒸發(fā)所導(dǎo)致的病變，其造成眼瞼間眼表面的損害并且與眼部不適的綜合征相關(guān)(37)。[0075]本公開(kāi)也提供用于治療或預(yù)防干眼的方法，包括將以前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基施用至個(gè)體眼部。于一實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。于本公開(kāi)的又一實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培11養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。本公開(kāi)還提供醫(yī)藥組合物，其包含從前述方法獲得的脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。于至少一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于3kDa的活性成分。于本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0076]下面是進(jìn)一步證明本公開(kāi)功效的實(shí)施方案，但并不試圖限制本公開(kāi)的范疇。[0078]制備例1:脂肪來(lái)源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM)的分離及維持[0079]本研究由佛教濟(jì)慈醫(yī)院內(nèi)部審查委員會(huì)批準(zhǔn)(IRB102-130),從所有研究個(gè)體獲得了知情同意書(shū)。分別于23、28及30歲的三位女性的美容抽脂時(shí)從腹部皮下脂肪獲得人類(lèi)脂肪組織。使用與Griesche及同仁所提供者(9)類(lèi)似的方法分離基質(zhì)-血管部分細(xì)胞。添加I型膠原酶(Sigma)至最終濃度為0.4mg/mL,以于雜交箱中進(jìn)行酶切割反應(yīng)，該反應(yīng)在37℃、30°角及15rpm的條件下執(zhí)行45分鐘。經(jīng)切割的脂肪組織以400×g離心10分鐘，產(chǎn)生基質(zhì)血管部分(SVF)顆粒以進(jìn)行后續(xù)的ADSC培養(yǎng)。為了維持及擴(kuò)張ADSC群體，將細(xì)胞于含有伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養(yǎng)基(IMDM,Gibco)、10%胎牛血清(FBS,Gibco)以及10ng/mLFGF-2(R&DSystems)的間質(zhì)干細(xì)胞維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如先前所述(10,11)。實(shí)驗(yàn)使用傳代2至5次的[0081]將ADSC以每燒瓶1×10?個(gè)細(xì)胞接種至150cm2組織培養(yǎng)燒瓶(BDFalcon,355001,Durham,NC)中，使用以2mM谷氨酰氨(Gibco)、10%生長(zhǎng)因子2(FGF-2,R&DSystems)、2mMN-乙?；?L-半胱氨酸(NAC,Sigma)及0.2mML-抗壞血酸-2-磷酸酯(AsA2P,Sigma)的間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)佐劑(MCA)補(bǔ)充的無(wú)酚紅伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養(yǎng)基(IMDM)(Gibco)培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集ADSC條件培養(yǎng)基(ADSC-CM),以300×g離心5分鐘，透過(guò)0.22μm注射器式過(guò)濾器過(guò)濾。收集來(lái)自P2至P5ADSC的ADSC-CM并混合，然后等量分裝并冷凍以用于進(jìn)一步的用途。[0083]使用MilliporeAmiconUltra-15離心管或SpectrumLabs中空纖維過(guò)濾器制備用Amicon離心濃縮器(分子量截止值(MWCO)=30kDa、3kDa或1kDa)濃縮至最終濃度為1mg/mL,收集穿透流過(guò)的流體并濃縮至最終濃度為1.5mg/mL。將樣品快速冷凍，并于-20℃儲(chǔ)存[0084]經(jīng)濃縮的條件培養(yǎng)基以IMDM稀釋?zhuān)尤爰?xì)胞中以通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8對(duì)有存活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。[0085]對(duì)于經(jīng)冷凍干燥的條件培養(yǎng)基測(cè)試，于5mL冷凍干燥管中制備經(jīng)滲析的樣本的等量分裝(1mL),之后在可編程的凍干儀中冷凍干燥。[0086]對(duì)于熱穩(wěn)定測(cè)試，將條件培養(yǎng)基于56℃溫育30分鐘或于100℃溫育3分鐘。[0087]對(duì)于脂質(zhì)提取，通過(guò)己烷以1:1比率將條件培養(yǎng)基處理3分鐘，并收集下層水相。[0088]對(duì)于帶電測(cè)試，首先將條件培養(yǎng)基滲析至20mMTris(pH8.0)。滲析后，將樣品施加至SP-Sepharose陽(yáng)離子交換柱。用20mMTris、1MNaCl(pH8.0)以6倍柱體積洗脫該柱。Westport,Ireland),NY,USA)計(jì)數(shù)細(xì)胞，或分解于放射免疫沉淀測(cè)定(radio-immunoprecipitationassay,[0093]對(duì)于免疫印跡分析，細(xì)胞以冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次，并使用含有Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液(Pierce,ThermoFisherScientific,Rockford,IL,℃以13,200rpm離心10分鐘，并收集上清液用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)濃度使用Bradford氏方法蛋白質(zhì)檢定試劑盒(Amresco,Ohio,USA)通過(guò)Bradford氏方法以已知濃度偏二氟乙烯(PVDF)膜(Sigma)上。以含有0.1%Tween-20(PBS-T)和5%脫脂奶的PBS于室溫封閉該膜1小時(shí)，然后于4℃使用適宜的一抗溫育過(guò)夜，該一抗為兔單克隆抗Erk1/2酶/c-JunNH2-末端激酶)抗體、用Seppro去除緩沖液(Sigma)以1:1000稀釋的兔單克隆抗1:5000稀釋的兔單克隆抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶)抗體(CellSignaling磷酸化的P38(P-P38)的表達(dá)及經(jīng)磷酸化的Erk1/2(P-Erk1/2)的表達(dá)。[0096]實(shí)施例2:使用ADSC-CM進(jìn)行的活[0097]1.鼠干眼模型的建立：[0098]所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均得到慈濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理及使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。如先前所述，在人工氣候室(CEC)中誘導(dǎo)BALB/c小鼠的干眼相關(guān)的眼表面征候(15)。簡(jiǎn)而言之，將13周齡的BALB/c小鼠暴露于相對(duì)濕度為10±3%且溫度為21-25℃的CEC中，并且監(jiān)控并維持10-15L/min的氣流。將小鼠分為五組。每一實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均由5只小鼠組成。將四組保留在CEC中作為干眼組，將一組保留在濕度為75±3%的室中作為正常非干燥對(duì)照組。于四個(gè)CEC干眼組中，作為干眼對(duì)照組的一組不接受任何滴眼液，而其他三組分別接受下列滴眼液：R、IMMCA(用作尚未經(jīng)ADSC條件化的對(duì)照培養(yǎng)基)及ADSC-CM培養(yǎng)基，每天兩次，共計(jì)28[0099]于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(即，于終點(diǎn)的第28天),通過(guò)熒光素染色及孟加拉玫瑰紅染色評(píng)估眼表面，并通過(guò)光學(xué)同調(diào)斷層掃描估算角膜厚度。然后犧牲小鼠，保存眼球以進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究及電子顯微鏡檢查。[0100]此外，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表示為均值±均值的標(biāo)及雙樣品t測(cè)試用以比較CCK-8測(cè)定、熒光素及孟加拉玫瑰紅染色、以及結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度。p<0.05視為統(tǒng)計(jì)上顯著。[0101]2.淚液分泌檢定[0102]通過(guò)Zone-Quick酚紅棉線(日本昭和藥品化工株式會(huì)社)的淚液吸收變色區(qū)域的長(zhǎng)度估算淚液分泌。簡(jiǎn)而言，以4秒的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間移除過(guò)量淚液，然后用小鑷子夾持Zone-Quick酚紅棉線并將其在側(cè)穹隆內(nèi)放置30秒。首先量測(cè)左眼，然后量測(cè)右眼。計(jì)算兩個(gè)眼睛的平均值進(jìn)行分析。本研究中，每一實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組由10只眼睛(n=5只小鼠/組)組成。[0103]如圖3中所示，與淚液分泌檢定中的其他組相比，ADSC-CM組小鼠分泌的淚液體積顯著不同。于治療的第一周及第二周，ADSC-CM組的小鼠具有與非干燥對(duì)照組小鼠相當(dāng)?shù)臏I液體積，代表ADSC-CM能夠維持與非干燥對(duì)照組相同的淚液體積水平。于第三周及第四周，ADSC-CM組小鼠分泌的淚液體積仍具有顯著高于干燥對(duì)照組及以IMMCA治療的小鼠的淚液體積。[0104]3.熒光素染色及孟加拉玫瑰紅染色檢定[0105]將一滴1μL的1%熒光素施用至結(jié)膜囊內(nèi)90秒后，使用下列熒光素染色評(píng)分系統(tǒng)獨(dú)立地評(píng)估角膜：0=無(wú)染色；1=輕微的點(diǎn)狀染色(<30點(diǎn));2=點(diǎn)狀染色(>30點(diǎn))但無(wú)彌散；3=嚴(yán)重的彌散染色，但無(wú)陽(yáng)性斑塊；以及，4=陽(yáng)性熒光素斑塊(16)。Bijsterveld系統(tǒng)對(duì)角膜的孟加拉玫瑰紅染色進(jìn)行評(píng)分：1=少量分離的點(diǎn)；2=眾多分離的點(diǎn)；以及，3=融合的點(diǎn)(最大得分為9分)(17)。的程度。[0108]4.免疫熒光雙重染色[0109]將眼睛固定于10%甲醛中。進(jìn)行石蠟包埋后，將3μm切片于二甲苯中脫蠟，于一系列乙醇溶液中再水合，并用蒸餾水洗滌兩次。于90至95℃,使用pH=9的DAKO靶標(biāo)修復(fù)溶液連蛋白的表達(dá)受到抑制。盡管外部施用R或IMMCA減輕了對(duì)表達(dá)的抑制，但ADSC-CM顯示了最佳的補(bǔ)救。于另一實(shí)驗(yàn)中，圖5B顯示，CEC中的BALB/c小鼠的Z0-1及角蛋白12(K12)表達(dá)也受[0111]5.組織學(xué)分析及免疫組織化學(xué)(IHC)檢定[0112]對(duì)于組織學(xué)檢定，將眼睛固定于10%甲醛中并包埋在石蠟中。用蘇木精-曙紅或希夫氏過(guò)碘酸(PAS)對(duì)3μm厚度的中心垂直面切片進(jìn)行染色。測(cè)量角膜上皮形態(tài)及位于中心角膜處的上皮及基質(zhì)的厚度，并通過(guò)ImageJ檢定來(lái)計(jì)算平均結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度。的平均結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度，并且與非干燥對(duì)照組相當(dāng)。[0114]對(duì)于MUC16免疫組織化學(xué)，將眼睛固定于10%甲醛中。進(jìn)行石蠟包埋后，將8μm厚度的切片于二甲苯中脫蠟，于一系列乙醇溶液中再水合，并用蒸餾水洗滌兩次。于90至95℃,用pH=9的DAKO靶標(biāo)修復(fù)溶液(DAKO,Glostrup,Denmark)執(zhí)行抗原修復(fù)15分鐘。使用Histofine小鼠染色試劑盒(Nichirei,Tokyo,Japan)于8μm厚的切片上執(zhí)行MUC16染色。以抗MUC16(1:50;SantaCruz,SantaCruz,CA,USA)將切片于4℃溫育越夜，并最終使用Histofine簡(jiǎn)單染色最大PO染色10分鐘。使用3,3'-二氨基聯(lián)苯氨四鹽酸鹽及鈷(D-0426,Sigma,SaintLouise,Missouri,USA)將辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)顯影。也進(jìn)行陰性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)，但不使用一抗。于分級(jí)的乙醇及二甲苯中脫水后，將切片封固于Histokit(HechtAssistent,Sondheim,Germany)中并分析。[0115]如圖7所示，MUC16的免疫組織化學(xué)分析顯示，非干燥組的結(jié)膜的MUC16表達(dá)是連續(xù)ADSC-CM組中的箭頭指示結(jié)膜上皮細(xì)胞。[0116]6.透射電子顯微鏡(TEM)分析[0117]首先，將新鮮角膜樣品于2%多聚甲醛中固定24小時(shí)，然后在0.2M二甲胂酸鹽緩沖液中的2.5%戊二醛溶液中固定，然后加上1%單寧酸于pH7.0-7.3固定24小時(shí)，并且在處于0.2M二甲胂酸鹽緩沖液中的1%四氧化鋨溶液中后固定1小時(shí)。于進(jìn)一步固定后，用0.2%醋酸氧鈾對(duì)樣品進(jìn)行2小時(shí)的整塊染色，然后通過(guò)乙醇/丙酮脫水，并于室溫下于純Spurr樹(shù)脂中包埋8小時(shí)。最終，將樣品于62℃聚合48小時(shí)，然后于透射電子顯微鏡(HitachiH-7500,HitachiLtd.,Japan)下拍攝照片。[0118]如圖8A至8E所示，TEM研究表明，CEC誘導(dǎo)干眼小鼠中，角膜上皮細(xì)胞之間的緊密連接及指狀交叉(interdigitation)降低。使用ADSC-CM進(jìn)行的治療增加了相鄰角膜上皮細(xì)胞之間的指狀交叉及緊密連接形成。[0119]7.掃描電子顯微鏡(SEM)分析[0120]首先，將新鮮角膜于2%多聚甲醛中固定24小時(shí)，然后在0.2M二甲胂酸鹽緩沖液中的2.5%戊二醛溶液以及1%單寧酸中于pH7.0至7.3固定24小時(shí)，并且使用處于0.2M二甲胂酸鹽緩沖液中的1%四氧化鋨溶液后固定1小時(shí)。然后，樣品通過(guò)臨界點(diǎn)干燥器(Hitachi子顯微鏡(HitachiLtd.,Japan)觀察樣品并拍攝照片。效果最佳。[0122]實(shí)施例3:使用ADSC-CM不同分子量大小部分進(jìn)行的體外人角膜上皮細(xì)胞(HCEC)干燥應(yīng)激研究[0123]如上文制備例3中所述，制備不同ADSC-CM分子量大小的部分。獲得了含有>ADSC-CM部分，并進(jìn)行干燥應(yīng)激及高滲透壓應(yīng)激，然進(jìn)行的干燥應(yīng)激研究如上文實(shí)施例2中所述。對(duì)于高滲透壓應(yīng)激研究，令HCEC生長(zhǎng)至大約60%融合度，然后用新鮮培養(yǎng)基(311毫滲透克分子(mOsM))或含有90mMNaCl(480mOsM)的培養(yǎng)基處理24小時(shí)。于高滲透壓處理后，將細(xì)胞于不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于溫育2小時(shí)后，以[0124]結(jié)果顯示于圖10A至10D中。顯示，含有0至750kDa、0至300kDa、0至100kDa及0至激或高滲透壓應(yīng)激破壞。[0125]制備其他分子大小的ADSC-CM部分以分析ADSC-CM中活性成分的分子大小。獲得含所述的干燥應(yīng)激研究，并通過(guò)CCK-8測(cè)定評(píng)估。結(jié)果顯示的保護(hù)細(xì)胞不被干燥應(yīng)激破壞的效果而言，含有0至30kDa、0至10kDa及0至3kDa的ADSC-CM部分具有優(yōu)于含有>30kDa、>10kDa及>3kDa的ADSC-CM部分的效果。[0126]使用含有0-1kDa的ADSC-CM部分估，結(jié)果顯示于圖12中。含有0-1kDa的ADSC-CM部分于保護(hù)細(xì)胞不被干燥應(yīng)激破壞中仍有效，所保持的細(xì)胞的百分比類(lèi)似于那些經(jīng)ADSC-CM處理者。[0127]實(shí)施例4:使用ADSC-CM不同分子量大小部分進(jìn)行的干眼的動(dòng)物活體研究[0128]使用動(dòng)物活體研究進(jìn)一步評(píng)估上文所制備的ADSC-CM部分的治療干眼的效果。如上文所述，進(jìn)行淚液分泌檢定、免疫熒光雙重染色、組織學(xué)分析、免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定、透射電子顯微鏡(TEM)分析及掃描電子顯微鏡(SEM)分析。其分泌如非干燥對(duì)照組一樣多或甚至更多的分泌淚液體積。眼液對(duì)于角膜上皮特異性蛋白K12的表達(dá)，以及對(duì)于緊密連接屏障的完整性的效果。自結(jié)果可知，使用不同滴眼液治療，角膜上皮特異性蛋白質(zhì)K12的表達(dá)并未改變，而于干燥處理小鼠中觀察到小鼠角膜上皮中緊密連接相關(guān)蛋白Z0-1及緊連蛋白的表達(dá)量降低，但可通過(guò)ADSC-CM以及具有0至30kDa、<10kDa、<3kDa、0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分成功地予以阻止。[0131]如上文所述進(jìn)行組織學(xué)分析，以比較不同分子大小的ADSC-CM部分對(duì)于角膜上皮形態(tài)、中心角膜處的上皮及基質(zhì)的厚度、以及平均結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度的效果。如圖17A至圖杯狀細(xì)胞減少，而具有30至100kDa的ADSC-CM部分未顯示相同效果。圖19G中，具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分逆轉(zhuǎn)了于CEC誘導(dǎo)干眼中觀察到的結(jié)膜杯[0133]此外，實(shí)施IHC測(cè)CEC誘導(dǎo)干眼中觀察到被抑制的MUC16表達(dá)，而具有30至100kDa的ADSC-CM部分(圖20E)未顯示相同效果。圖20E中的箭頭指示結(jié)膜上皮細(xì)胞。[0134]圖21A至圖21G顯示圈養(yǎng)于CEC中以ADSC-CM及不同ADSC-CM部分治療的小鼠的療的小鼠的MUC16表達(dá)結(jié)果。以ADSC-CM(圖22C)、具有0至3kDa的ADSC-CM部分(圖22D)及具有0至1kDa的ADSC-CM部分(圖22E)治療的干眼具有與非干燥對(duì)照組及以ADSC-CM治療者類(lèi)[0136]相同地，也檢查圈養(yǎng)于CEC中以不同ADSC-CM部分治療的動(dòng)物的MUC4表達(dá)量。圖23A結(jié)果。其顯示，具有0至30kDa、<10kDa及<3kDa的ADSC-CM部分顯示與非干燥對(duì)照組及以療者類(lèi)似的MUC4表達(dá)量，而以IMDM治療的小鼠顯示類(lèi)似于干燥對(duì)照組中所見(jiàn)的減少的MUC4表達(dá)量。<30kDa的ADSC-CM部分的外部施用(圖25E)保持了角膜上皮的微絨毛，并且具有與施用ADSC-CM者(圖25C)及非干燥對(duì)照組類(lèi)似的效果。然而，30至100kDa的ADSC-CM部分(圖25D)并未顯示相同的效果。[0139]同樣地，圖26A至圖26G顯示使用具有>10kDa、<10kDa、>3kDa及<3kDa的ADSC-CM部部施用保持了角膜上皮的微絨毛，并且具有與施用ADSC-CM者(圖26C)及非干燥對(duì)照組(圖26A)類(lèi)似的效果。然而，經(jīng)具有>10kDa的ADSC-CM部分(圖26D)及具有>3kDa的ADSC-CM部分(圖26F)治療的干眼不能保持干眼中誘導(dǎo)的角膜上皮的微絨毛。[0140]再者，圖27A至圖27F顯示經(jīng)具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分治療的干眼的均顯示與非干燥對(duì)照組(圖27A)及以ADSC-CM治療者(圖27C)中觀察到類(lèi)似的角膜上皮細(xì)胞微絨毛的保持，而經(jīng)IMDM治療的小鼠(圖27F)顯示類(lèi)似于干燥對(duì)照組(圖27B)中所見(jiàn)的角膜上皮微絨毛損失及退化。[0141]上述實(shí)施例1至4清楚地顯示，包含分子量小于30kDa、小于3kDa及小于1kDa的活性[0142]于體外HCEC干燥應(yīng)激研究中，進(jìn)行十分鐘的干燥造成HCEC存活率下降，這并不能小于1kDa的活性成分的ADSC-CM部分得以顯著彌補(bǔ)該存活率下降。同時(shí)進(jìn)行的免疫印跡分析也表明，于ADSC-CM中培養(yǎng)的HCEC的P38或p-Erk1/2表達(dá)增加。[0143]干燥CEC中的小鼠具有更多的蒸發(fā)，并因此具有更多的角膜熒光素染色及孟加拉具有顯著降低的Z0-1及緊連蛋白表達(dá)量，而Z0-1及緊連蛋白是緊密連接的標(biāo)志物。通過(guò)施用ADSC-CM及其具有小于30kDa、小于3kDa及小于1kDa的部分，干燥損傷所致的Z0-1及緊連蛋白表達(dá)量下降幾乎被逆轉(zhuǎn)或甚至更佳。ADSC-CM組的角膜上皮也顯示最佳的K12表達(dá)，意味著保持角膜上皮的特征。ADSC-CM及其部分對(duì)于角膜的緊密連接的有益效果不僅通過(guò)共助角膜上皮的管家功能，該功能為建立與外部環(huán)境的邊界，為液體流失、毒素刺激以及病原體進(jìn)入提供障礙。[0144]ADSC-CM及其部分不僅保護(hù)角膜上皮細(xì)胞的緊密連接，而且也保護(hù)結(jié)膜杯狀細(xì)胞及膜相關(guān)粘蛋白MUC16表達(dá)。CEC小鼠的結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度顯著下降，這一現(xiàn)象通過(guò)至高于非干燥小鼠的密度。于非干燥對(duì)照組中的MUC16表達(dá)是連續(xù)的，而于干燥對(duì)照組中的[0145]干燥損傷造成角膜上皮微絨毛的損失。盡管通過(guò)Refresh或IMMCA的潤(rùn)滑減輕干燥應(yīng)激所致的微絨毛損傷，但ADSC-CM及其部分將微絨毛保持得最好。[0146]總之，本公開(kāi)證明了ADSC-CM對(duì)于干燥誘導(dǎo)的眼表面損傷的效果，可能是通過(guò)Erk1/2及P38的活化而達(dá)成。[0147]業(yè)經(jīng)使用示例性實(shí)施方案描述本公開(kāi)。但應(yīng)理解，本公開(kāi)的范疇并不限于所公開(kāi)的實(shí)施方案。反之，其旨在包含各種修改及類(lèi)似的重新安排。因此，權(quán)利要求書(shū)的范疇?wèi)?yīng)給予最廣泛的解釋?zhuān)院w所有此類(lèi)修改及類(lèi)似安排。[0148]參考文獻(xiàn)DefinitionandClassifiWorkShop(2007).Ocul.Surf.2007;5(2):75-92.Syndromedryeyewithanti-inflamm8:1447-58.[0151]3.PanQ,AngelinaA,MarroneM,Starkdropsfordryeye.CochraneDatabaseSyst.Rev.2017[0152]4.ChenL,TredgetEE,WuPY,Wucellsrecruitmacrophageshealing.PLoSOne.2008;3(4):e1886.mediafrommesenchymalstemcellsenhancenhancedwoundhealing.J.Surg.Res.2015;194(1):8-17.[0155]7.BeyazyildizE,PinarliFA,BeyazyildizMN,etal.Efficacyoftopicalmesenchymalstemcellofexperimentaldryeyesyndromemodel.StemCellsInt.2014;2014:250230.[0156]8.PawitanJA.Prospectofstemcellmedicine.Biomed.Res.Int.2014;2014:965849.[0157]9.GriescheN,LuttmannW,simplemodificationoftheseparationmethodreducesheterogeneityofadipose-derivedstemcells.CellsTissuesOrgans.2010;192(2):106-15.electromagneticfieldontheproliferationanddifferentiationhumanbonemarrowmesenchymalstemcells.Bioofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsonbiodegradablemicrocarriersenhancesinvitrodifferentiationpotential.CellPdrying.TheBritishJournalofOphthalmology.2001;85(5):610-2.cornealepitheliuminvitroandinvivo.Mol.Vis.2011;17:2400-6.surfacelubricantsagainstdehydration.Cornea.2013;32(9):1260-4.controlled-environmentchamber:anewmousemodelofdryeye.InvestigativeOphthalmology&VisualScience.2005;46(8):2766-71.[0164]16.PaulyA,Brignole-BaudouinF,LabbeC.Newtoolsfortheevaluationoftoxirat.InvestigativeOphthalmology&VisualScience.2007;48(12ofOphthalmology.1969;82(1):10-4.[0166]18.SchaumbsyndromeamongUSwomen.AmericanJournalofOphthalmology.2003;136(2):318-26.eraofantiagingophthalmologycomesotreatment.OphthalmicRes.2010;44(3):146-54.[0168]20.TsubotaK,KawashimaM,Inabaal.TheantiagingapproachforSuppl.1:S3-8.chemistry.J.Gerontol.1956;11(3):298-300.contributionofparacrineeffectversusdirectdifferentiationonadipose-derivedstemcelltransplantate59020.[0171]23.BurlacuA,Grigorescusecretedbymesenchymalcomplementaryeffectsonangiogenesisinvitro.StemCderivedfromhumanbonemarrowmesenchymalstemcelaratmyocardialinfarctionmodel.J.Mol.Med.(Berl).2014;92(4):387-97.[01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