血清甘油三酯、總膽固醇的酶法測定

（附VitC的干擾試驗）

目前幾乎所有的臨床實驗室都用酶法檢測血清TG水平，雖然方法各異，但一般都包括3個基本步驟：用最合適的LPL水解TG生成甘油和FFA；接著是轉(zhuǎn)化，該步驟一般只用一種酶，例如甘油激酶，將甘油磷酸化以進(jìn)行下一步反應(yīng)，或者生成中間待測物；最后是有色染料（常為醌亞胺等）或者紫外吸收物質(zhì)的形成，再通過分光光度法計算相應(yīng)的TG濃度。

酶法比化學(xué)法具有更多的優(yōu)越性，適用于自動化儀器，也可手工操作，即可終點法測定，也可作連續(xù)檢測，所以酶法取代化學(xué)法已是必然趨勢。

【目的要求】1、掌握酶法測定血清TG的實驗原理，了解血清TG測定的臨床意義。2、掌握酶法測定血清TC的實驗原理，了解血清TC測定的臨床意義。3、掌握干擾試驗的設(shè)計方法，并通過干擾試驗加深對此測定方法的理解。【實驗原理】

血清中甘油三酯經(jīng)脂蛋白脂肪酶（LPL）作用，可水解為甘油和脂肪酸，甘油在ATP和甘油激酶（GK）的作用下，生成3—磷酸甘油和ADP，再經(jīng)磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化生成磷酸二羥丙酮和過氧化氫。過氧化氫與4—氨基氨替比林及4—氯酚在過氧化物酶（POD）作用下，生成紅色醌類化合物，其顯色程度與TG的濃度呈正比。原理

TG+3H2OLPLGlycerol+3RCOOHGlycerol+ATPGK+Mg2+G-3-P+ADPG-3-P+O2

GPO

磷酸二羥丙酮+H2O2

2

H2O2+Phenol+4-AminoantipyrinePOD

Chromogen+4H2O干擾試驗試驗的目的:

用來檢測候選方法的恒定系統(tǒng)誤差。干擾物濃度不同，誤差大小也不同干擾:

干擾試驗是用于測定某物質(zhì)加入樣品中所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差（干擾物濃度一定時產(chǎn)生的是恒定系統(tǒng)誤差），用以評價分析方法的準(zhǔn)確性。本實驗采用VitC作干擾物，觀察其對酶法測定血清TG的干擾。

試驗的方法:

基本與回收試驗一樣，但在病人標(biāo)本中加人的是疑有干擾或非特異性反應(yīng)的物質(zhì)。將可能引起干擾的物質(zhì)配成一定濃度的溶液，加到病人標(biāo)本中成為干擾分析樣本；原病人標(biāo)本加人相同量的無干擾物質(zhì)的溶劑作為基礎(chǔ)樣本；然后用候選方法對此兩種樣本同時測定，兩者之差即表示該干擾物質(zhì)產(chǎn)生的干擾所引起的誤差，即干擾值干擾值=干擾標(biāo)本測得濃度-基礎(chǔ)標(biāo)本測得濃度計算:設(shè)計干擾試驗應(yīng)把握的幾項原則：（1）可以干擾物的選擇：根據(jù)分析法的反應(yīng)原理，參考有關(guān)文獻(xiàn)，可初步提出哪些物質(zhì)會產(chǎn)生非特異性反應(yīng)或干擾作用。一般應(yīng)考慮的干擾物血紅蛋白、膽紅素、脂質(zhì)、防腐劑、抗凝劑和藥物等。（2）可疑干擾物的濃度：加入的可疑干擾物的濃度應(yīng)明顯高于通常所見濃度上限，又可能應(yīng)達(dá)到病理標(biāo)本的最高值，以便能夠確定使分析結(jié)果影響臨床應(yīng)用價值的最低可疑物濃度值。（3）干擾物的體積：在試樣中應(yīng)占最小比例（通常應(yīng)<10%）（4）

吸量要準(zhǔn)確。（5）本試驗檢測的誤差包括方法特異度不高和干擾物作用引起的誤差。誤差結(jié)果分析：干擾實驗中，在加入一定濃度干擾物的條件下，形成的是恒定系統(tǒng)誤差，即干擾樣品測定值與基礎(chǔ)樣品測定值之差，此差值如〈允許誤差（EA）的臨界值，表明由干擾物引起的偏差對臨床診斷的和治療不產(chǎn)生不良影響，是可以被接受的。消除干擾常用方法空白對照：試劑空白：常見標(biāo)本空白：內(nèi)空白法和外空白法物理、化學(xué)方法分離干擾物雙波長或多波長法檢測排除干擾誤差較大又無法消除，則改進(jìn)或更換方法?！緦嶒灢僮鳌颗R用前將適量的緩沖液（試劑Ⅱ）加入至試劑Ⅰ（酶劑）中配成工作液，穩(wěn)定10分鐘后可使用。1、樣品制備基礎(chǔ)樣品：0.9ml血清+0.1ml蒸餾水干擾樣品Ⅰ：0.9ml血清+0.1mlVitC標(biāo)準(zhǔn)液（50mg/dl）干擾樣品Ⅱ：0.9ml血清+0.1mlVitC標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/dl）準(zhǔn)備6支試管按下表操作：加入物(ul)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管基礎(chǔ)樣品管干擾樣品管Ⅰ干擾樣品管Ⅱ蒸餾水20—————TG標(biāo)準(zhǔn)液—20————血清——20———基礎(chǔ)樣品———20——干擾樣品Ⅰ————20—干擾樣品Ⅱ—————20酶工作液（ml）2.02.0

2.0

2.0

2.0

2.0

即刻混勻，置37℃保溫5分鐘，取出，混勻，用分光光度計比色，波長505nm，光徑1cm,，空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。計算1、計算樣品TG濃度：TG濃度（mmol/L）=A測/A標(biāo)×2.26mmol/L2、計算干擾物濃度干擾物濃度（mg/dL

）=VitC標(biāo)準(zhǔn)液濃度×干擾物加入液量/（血清加入液量+干擾物加入液量）3、計算干擾值干擾值（mmol/L）=干擾樣品測定值—基礎(chǔ)樣品測定值血清甘油三酯一般隨年齡增加而升高，體重超過標(biāo)準(zhǔn)者往往偏高。

合適范圍：≤1.70mmol/L(150mg/dl)，升高：＞1.70mmol/L(150mg/dl)。

【參考值】【注意事項】1、血清TG易受飲食影響，在進(jìn)食脂肪后血清中TG明顯增高，抽血前應(yīng)禁食12h以上，并要求72h內(nèi)不飲酒。2、血清中游離甘油對測定結(jié)果有一定影響，化學(xué)法中因運用了抽提和吸附技術(shù)，這種影響較小，全酶法測定中這種影響較大，有人主張常規(guī)工作中可講所得結(jié)果減去0.11mmol/L而作粗略校正。3、評價本方法測定血清TG屬于一步終點法，操作簡單，既可手工操作，也適合自動化分析。但其主要缺點是所測TG值包括了血清中游離的甘油（FG）。本法線性范圍在11.4mmol/L以內(nèi)，精密度為：批內(nèi)CV≤3%、批間CV≤5%。加入不同濃度TG，平均回收率98.6%。脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法（GPO-PAP法）等。此法具有簡便快速、微量、精密度高的優(yōu)點，且特異性強，易于達(dá)到終點，線性范圍寬。用一步法測定的是血清總甘油酯（定義為TG和FG及少量甘油二酯、甘油一酯之和，習(xí)慣統(tǒng)稱為TG）。為了消除FG的干擾，中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會曾推薦GPO-PAP法的兩步酶法作為血清TG常規(guī)測定方法。血清FG對TG測定結(jié)果的影響一直是臨床十分關(guān)注的問題。國外資料顯示，正常人體血清FG含量為0.06～0.22mmol/L，約占總TG的6%～14%。國內(nèi)的研究結(jié)果與此相近，我國正常人血清FG水平平均約為0.08mmol/L（0.02～0.33mmol/L），約占總TG7.19%（0.81%～21.64%）。雖然臨床標(biāo)本中FG顯著升高者很少見，但有些異常或病理情況下如應(yīng)激反應(yīng)（腎上腺素激活LPL促進(jìn)體內(nèi)脂肪水解），劇烈運動，服用含甘油的藥物如硝酸甘油，靜脈輸入含甘油的營養(yǎng)液，肝素治療，某些嚴(yán)重的糖尿病、肝病與腎病，取血器材或試管塞上帶有甘油等時，可見血清FG顯著升高，并給臨床決策帶來誤導(dǎo)。因此，可采取測定“真”TG的方法減少其影響：一種是同時測定總甘油和FG，兩個結(jié)果的差值反應(yīng)了真TG濃度（外空白法），另一種是用兩步酶法直接測定TG（內(nèi)空白法）。前者國內(nèi)外應(yīng)用較少，后者國外（如日本）使用較多，國內(nèi)目前已有許多臨床實驗室開展。

目前國內(nèi)臨床生化檢驗使用的生化試劑絕大多數(shù)都是單一試劑，在甘油三脂測定中測得甘油三脂的含量實際上是標(biāo)本中甘油三脂與游離甘油的總含量，盡管臨床上可以通過減去標(biāo)本中平均游離甘油的含量和修改正常范圍加以彌補，但是，由于臨床標(biāo)本的個體差異，使得血標(biāo)本中游離甘油的含量不可能都一樣。而液體雙試劑可先讓標(biāo)本與試劑I反應(yīng)（試劑I中包括甘油激酶、抗壞血酸氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、過氧化物酶），從而徹底消耗標(biāo)本中游離甘油，排除抗壞血酸的干擾，然后再用試劑Ⅱ含有LP和發(fā)色團(tuán)啟動反應(yīng)，使得測得的結(jié)果真正反映標(biāo)本中甘油三脂的含量。去除FG干擾可用下列方法：1、外空白法：同時用不含LPL的酶試劑測定FG作空白。2、內(nèi)空白法：又稱兩步法或雙試劑法—將LPL和4-AAP組成試劑2，其余部分為試劑1。此法目前為中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會推薦方法?！九R床意義】血清TG有隨年齡而上升的趨勢，體重超過標(biāo)準(zhǔn)者甘油三酯往往偏高。病理性增高常見于動脈粥樣硬化，家族性脂類代謝紊亂，腎病綜合征，糖尿病，甲狀腺功能減退，急性胰腺炎，膽道梗阻，原發(fā)性甘油三酯增高癥。血清TG降低較少見，甲狀腺功能亢進(jìn)，營養(yǎng)不良和消化不良綜合征等可引起血清TG的降低。(二)TC的酶法測定特點：

常規(guī)測定中現(xiàn)已廣泛應(yīng)用酶法，酶法具有特異性好，精密度和靈敏度都能很好地滿足臨床實驗室的要求，既可以手工操作，也適合自動分析，但酶法測定中出現(xiàn)了不同程度的基質(zhì)效應(yīng)。

采用酶反應(yīng)原理的干化學(xué)法頗為實用，其缺點是價格高，精密度差。膽固醇的酶測定法始于70年代。由于操作簡便，試劑無腐蝕性，特別適用于自動生化分析，目前已成為測定膽固醇的主要方法?！驹怼垦逯锌偰懝檀?totalcholesterol，TC)包括游離膽固醇(freecholesterol，F(xiàn)C)和膽固醇酯(cholesterolester，CE)兩部分。血清中膽固醇酯可被膽固醇酯酶水解為游離膽固醇和游離脂肪酸(FFA)，膽固醇在膽固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-膽甾烯酮和過氧化氫，H2O2在4-氨基安替比林和酚存在時，經(jīng)過氧化物酶催化，反應(yīng)生成苯醌亞胺非那腙的紅色醌類化合物，其顏色深淺與標(biāo)本中TC含量成正比。CEH-COD-PAP法原理：

CE＋H2OFC＋FFAFC＋O2△4-膽甾烯酮＋H2O2H2O2＋4-AAP＋酚醌亞胺＋H2O

膽固醇酶測定法的試劑中，除了上述三種酶、酚和4-氨基安替比林外，還有維持pH恒定的緩沖液、膽酸鈉、表面活性劑以及穩(wěn)定劑等。膽酸鈉是為了提高膽固醇酯酶的活性，表面活性劑的作用是促進(jìn)膽固醇從脂蛋白中釋放出來【參考范圍】血清參考值：3.0～5.20mmol/L；危險閾值：5.20～6.20mmol/L；高膽固醇血癥：≥6.20mmol/L?！九R床意義】①年齡與性別；②長期的高膽固醇、高飽和脂肪酸和高熱量飲食可使TC增高；③遺傳因素；④其它：如缺少運動、腦力勞動、精神緊張等可能使TC升高。1．TC增高常見于動脈粥樣硬化、原發(fā)性高脂血癥(如家族性高膽固醇血癥、家族性ApoB缺陷癥、多源性高膽固醇血癥、混合性高脂蛋白血癥等)、糖尿病、腎病綜合征、總膽管阻塞、甲狀腺功能減退、肥大性骨關(guān)節(jié)炎、老年性白內(nèi)障和牛皮癬。2．TC降低常見于低脂蛋白血癥、貧血、敗血癥、甲狀腺功能亢進(jìn)、肝臟疾病、嚴(yán)重感染、營養(yǎng)不良、腸道吸收不良和藥物治療過程中的溶血性黃疸及慢性消耗性疾病，如癌癥晚期等。全酶法測Chol始于1974年，在此以前用化學(xué)反應(yīng)測Chol時，除了一些已知的干擾因素外尚未提及基質(zhì)效應(yīng)問題。1979年才由Cooper指出Chol酶法中校準(zhǔn)液與病人血清的反應(yīng)性不同，可使Chol測定值偏低5%～7%。

1994年CAP調(diào)查570實驗室時用了參考方法定值的新鮮冰凍血清為調(diào)查材料，15個同方法測定chol組中仍有11個組出現(xiàn)基質(zhì)偏差，同時用制備物的4個組中，3個有基質(zhì)偏差。

有的報告指出TG、HDL-C常規(guī)方法與CDC的參考方法比較，有明顯偏差，甚至>10%。McNamura等發(fā)現(xiàn)血清冰凍可在免疫法（用apoAI與E抗體分離LDL）直接測定LDL-C時出現(xiàn)明顯基質(zhì)效應(yīng)，血清冰凍保存2～26周后，LDL-C測定值平均偏低10%左右。

由于新鮮血清與凍干血清的apoAI測定值一致，顯示凍干對apoAI測定不產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，故apoAI參考血清以凍干形式提供。但凍干對apoB有極明顯的影響，在不同原理的免疫法中，基質(zhì)偏差高達(dá)-26%～+4%，但這種變化也包括apoB分子本身的結(jié)構(gòu)變化在內(nèi)。所以apoB參考血清是液態(tài)冰凍保存的。減少基質(zhì)效應(yīng)的方法

Naito等（1993年）提出過減少基質(zhì)效應(yīng)的研究方向，至今仍有參考價值：改進(jìn)室間質(zhì)評樣品，使其作用更像新鮮人血清。

改進(jìn)儀器設(shè)計及試劑組成。