實驗七

血清總蛋白的測定

及其劑量反應曲線的制作

1凱氏定氮法仍然是建立各個具體方法時采用的參考標準方法。這是一個用于測定生物物質中總氮含量的方法，其準確度高、精密度好，成為測定蛋白質的最經典的標準方法，但由于其測定手續(xù)繁瑣，除用作血清蛋白質標準品定值及參考性測定工作外，現(xiàn)已很少在血清總蛋白測定中使用.2雙縮脲比色法是目前首先推薦的蛋白質定量方法。方法操作簡便，雖然雙縮脲試劑有大同不異。其中酒石酸鉀納可以穩(wěn)定在堿性溶液中的銅離子，含有碘化物作為抗氧化劑。雙縮脲反應生成的復合物其吸收峰為540nm。可采用公認的標準牛血清白蛋白作為標準品，經精確稱量，必要時用凱氏定氮法標定。各地質控中心提供的混合標準血清可作為第二參考，血清用量100μl，在10-140g/L濃度范圍內呈良好線性關系，批內CV值<2%，此反應的優(yōu)點適對白、球蛋白產生的顏色反應相近，干擾物質小，且不受溫度影響，唯一的缺點是靈敏度較低，比酚試劑法低約100倍。但本法的檢出限為0.2～1.7g/L，這相當于70g/L的血清3～24μl，已能滿足臨床生化檢驗的需要。

3基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法

由于各種蛋白質分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同，特別是白蛋白含色氨酸為0.2%，而γ-球蛋白中含量達2%-3%，導致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu2+，集中原法和雙縮脲反應兩者的作用，使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴于Cu2+。反應產物最佳吸收峰在650-750nm，方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利于檢測較微量的蛋白質,但試劑反應仍易受多種化合物的干擾。靈敏度較高，可用于測定腦脊液和尿液中的微量蛋白質，但由于該法是先測定出酪氨酸的量，再根據(jù)酪氨酸在蛋白質中含量而得出蛋白質的含量，因而準確度較差.4采用280nm和215/225紫外吸收值，計算蛋白質含量280nm是由于蛋白質分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和準確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區(qū)200-225nm是肽健的強吸收峰。在此區(qū)域其吸收值為280nm的10-30倍，將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質的影響。5采用沉淀反應進行散射比濁法用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚為簡便，不需特殊儀器，技術關鍵在于：①選擇最佳試劑濃度及溫度；②混勻技術；③選用的標準；④待測標本中的蛋白濃度。6染料結合法蛋白質可與某些染料特異結合，如氨基黑（aminoblack）與考馬斯亮藍（comassivebrilliantblue）。這一性質除了可以用于電泳后的蛋白質區(qū)帶染色，亦可用于總蛋白質的定量。缺點是多種蛋白質與染料的結合力不一致。考馬亮藍在與蛋白質結合后的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質可用分光光度法來定量檢測?！灸康囊蟆?.雙縮脲法測定蛋白質含量的實驗原理、關鍵技術和特點意義。2.熟悉雙縮脲法測定蛋白質的劑量反應曲線的制作方法與原則*3.熟悉721分光光度計的使用和常規(guī)維護【實驗原理】兩分子尿素加熱脫氨縮合成的雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子內含有兩個鄰接的肽鍵，在堿性溶液中可與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色絡合物。蛋白質分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣能在堿性條件下與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應，生成的紫紅色絡合物，且在540nm處的吸光度與蛋白質的含量在10~120g/L范圍內有良好的線性關系。

1.加液

取10CC干凈試管若干支，按下表所示，標明管號，進行雙管/三管平行操作。2.比色

混勻上表各管，置37°C水浴20min，之后用722分光光度計比色，波長540nm，光徑1cm，以空白調零，記錄各平行管的吸光度，算出各總管的平均吸光度一并填入下列比色記錄表中（見本實驗報告）3.作圖

以蛋白質濃度為橫坐標，平均吸光度為縱坐標，選擇適當?shù)目v橫坐標分度值，在座標紙上便可繪出一條過原點而成45°的蛋白質雙縮脲劑量反應曲線。4.求算標本血清中的蛋白質濃度⑴查圖：利用測定管的平均吸光度AU1在所繪的劑量反應曲線上查出總蛋白濃度X1和X2，最后算出標本的平均總蛋白濃度（X）。⑵計算：按下列公式計算將代入AU，將任一標準管，如S3的吸光度代入AS，再乘S3的蛋白質濃度,即可算出樣品平行測定管的蛋白質濃度（X1、X2）和平均總蛋白濃度（X）。【臨床意義】1.血清總蛋白參考值：60~80g/L2.血清總蛋白濃度異常⑴降低多見，主要見于蛋白質合成障礙，蛋白質丟失增加，營養(yǎng)不良或消耗增加，血漿稀釋。⑵增高相對少見，臨床常見于急性脫水等引起的血漿濃縮，也見于因多發(fā)性骨髓瘤患者異常球蛋白合成增加而致血清總蛋白濃度增高【注意事項】1.劑量反應曲線的制作與使用劑量反應曲線是待測物質與試劑作用的表觀實驗指標（如吸光度）與該物質量濃度（已知濃度系列）間的關系曲線，常用于評價測試方法的線性關系和線性范圍。也用于待測物質濃度測定中。為提高評價線性關系、線性范圍和定量測定的準確性，劑量反應曲線的制作與使用應該：⑴在最佳常規(guī)實驗條件下進行劑量反應曲線的制作，⑵標準溶液和樣品溶液的蛋白質濃度均不宜超過每ml10mg，⑶使標準管系列成為精確的濃度等差系列，⑷同一濃度應采用三管平行操作，且三只平行管的吸光度彼此相差不應超過0.005，若有超過，應去掉其中的異常數(shù)后再算平均值，⑸應確定好縱、橫坐標軸的分度值，使曲線呈過原點的45°直線，⑹制成的劑量反應曲線的分析范圍的濃度上限應能滿足95%的臨床標本不經稀釋便可進行測定，⑺應對作好的劑量反應曲線進行線性關系和線性范圍的統(tǒng)計學分析和認證，⑻曲線使用過程中應定期以定值質控血清驗證其準確性，⑼更換主要試劑、儀器或檢修比色計后應重新制備劑量反應曲線，⑽曲線作好、認證后應標明圖線名稱，縱橫坐標軸及刻度值，制作的實驗條件和統(tǒng)計評價數(shù)據(jù)，以及制作、認證的時間和責任人。【方法評價】雙縮脲測定蛋白質的方法具有特異性、重復性和精確度較高，在較大濃度（10~140g/L）范圍內有良好的直線關系，操作簡便，反應快速，95%的臨床血漿標本無須稀釋即可測定，是當前血漿總蛋白手工測定和自動化分析的首選方法，已被推薦為血漿總蛋白測定的參考方法?？捎糜邴}析和分段鹽析產品中的蛋白質定量測定。但宜用作蛋白質含量甚微的其他體液樣品和實驗樣品中的總蛋白定量。2.干擾因素與排除⑴黃疸血清、嚴重溶血、葡萄糖、酚酞及溴磺酞鈉對本法有明顯干擾，可設標本空白管來消除。具體操作和結果計算如下:

為消除黃疸等因素干擾雙縮脲法測定血清總蛋白而設標本空白管(RB)的實驗操作表管別BRB**SU加入(ml)(標本空白)

(試劑空白)

(標準)

(測定)

1.血清標本（1∶10）0.50--0.50

2.標準（1∶10）-0.50--

3.0.9%NaCl溶液-0.50--

4.雙縮脲空白試劑*4.0---

5.雙縮脲試劑

-4.04.04.0*雙縮脲空白試劑除不含硫酸銅外，其余成分與雙縮脲試劑相同

**但如標本空白管吸光度太高，可影響測定的準確度?；靹蚋鞴埽?5℃30min或37℃水浴10min，之后用721分光光度計比色，波長540nm，光徑1cm，以0.9%NaCl溶液調零，測定各管吸光度。再按下列公式計算標本中的總蛋白⑵高脂血癥血清會干擾比色?？刹捎帽恋沓龅鞍踪|或用乙醚抽提脫脂后再作測定。⑶屬技術性溶血標本應重新采血，屬病理、生理性溶血標本只能通過設置標本空白管來消除溶血的干擾。⑷一些氨基酸和肽類緩沖液，如Tris緩沖液，可產生陽性顯色反應，不宜采用。

1、為什么要在雙縮脲試劑中加入酒石酸鉀鈉和KI？2、雙縮脲試劑法測定蛋白質技術特點和意義3、重復性試驗的目的及意義

實驗八溴甲酚綠法測定血清白蛋白及時間進程曲線

【目的要求】

1.溴甲酚綠法測定血清白蛋白含量的實驗原理、關鍵技術和特點意義。

2.熟悉穩(wěn)定性試驗的基本操作及意義【實驗原理】血清白蛋白在PH4.2的緩沖液中帶正電荷，在有非離子型表面活性劑存在時，可與帶負電荷的染料溴甲酚綠（BCG）結合形成藍綠色復合物，在波長630納米處有光吸收峰，其顏色的深淺與白蛋白濃度成正比，與同樣處理的白蛋白標準比較，可求得血清白蛋白含量?！緦嶒灢僮鳌?．生化自動分析儀分析法各參數(shù)見有關儀器操作說明書2．手工操作法（1）手工操作參數(shù)：波長630、光徑1、溫度：室溫；模式：終點法；反應時間：30S；樣品量：0.02ml，試劑量：4ml。（2）操作：取試管7支，按表操作。（3）穩(wěn)定性試驗：按測定管加入樣本及BCG試劑后分別在1、5、10、20、30分鐘時測定各管吸光度值，以A為縱座標，時間T為橫座標繪制時間進和曲線。加入物空白管標準管測定管血清------0.02標準液---0.02---蒸餾水0.02------BCG試劑4.04.04.0在波長630處用空白調零，用定時加液器加BCG試劑，與測定管血清混合后，立即在30±3S內，讀取吸光度。3．計算：血清白蛋白（g/L）＝測定管吸光度/標準管吸光度*白蛋白標準液濃度如同時用雙縮脲法測定血清標本中總蛋白濃度，減去血清白蛋白濃度即為球蛋白濃度，并可求得血清白蛋白、球蛋白比值。【臨床意義】1．血清白蛋白濃度增高，常見于嚴重脫水所致的血漿濃縮2．血清白蛋白濃度降低在臨床上比較重要和常見，通常與總蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要見于大出血和嚴重的燒傷；慢性降低見于腎病蛋白尿，肝功能損傷，腸道腫瘤及結核病伴慢性出血，營養(yǎng)不良和惡性腫瘤等。血清白蛋白低于20g/L。臨床上出現(xiàn)水腫。3．A/G

某些病人可同時出現(xiàn)白蛋白減少和球蛋白升高的現(xiàn)象，嚴重者比值可＜1。這種情況稱為A/G比值倒置。4．文獻報道還有極少見的因白蛋白合成障礙，血清中幾乎沒有白蛋白的先天性白蛋白缺乏癥?！咀⒁馐马棥?．BCG是一種PH指示劑，變色域為PH3.8（顯黃色）～5.4（顯藍綠色），因此控制反應液的PH是本法測定的關鍵。2．配制BCG試劑也可用其他緩沖液如枸椽酸鹽或乳酸鹽緩沖液。但以琥珀酸緩沖液的校正曲線通過原點，線性好，靈敏度高，成為首選推薦配方。3．試劑中的Brij-35也可用其他表面活性劑代替，如吐溫20或吐溫80，終濃度為2ml，靈敏度和線性范圍不變。4．當白蛋白標準與BCG結合后，溶液光徑1，在630處測定的吸光度應為0.811±0.035，如達不到此值，表示靈敏度較差。5．蛋白質標準液是一個復雜的問題，實驗證明，BCG不但與白蛋白呈色，而且與血清中多種蛋白質成分呈色，其中以球蛋白、運鐵蛋白、結合珠蛋白更為顯著，其反應速度較白蛋白稍慢。由于30S內呈色對白蛋白特異，故BCG與血清混合后，在30S內讀取吸光度，可明顯減少