(19)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(21)申請(qǐng)?zhí)?01880046655.9(22)申請(qǐng)日2018.07.12(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(85)PCT國(guó)際申請(qǐng)進(jìn)入國(guó)家階段日(86)PCT國(guó)際申請(qǐng)的申請(qǐng)數(shù)據(jù)(87)PCT國(guó)際申請(qǐng)的公布數(shù)據(jù)(74)專利代理機(jī)構(gòu)中原信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11219(71)申請(qǐng)人生物醫(yī)學(xué)股份有限公司地址美國(guó)加利福尼亞州(72)發(fā)明人馬克西姆·米哈耶夫高第豐(54)發(fā)明名稱在酵母中生產(chǎn)大麻素(57)摘要本公開涉及在酵母中生產(chǎn)大麻素。在一個(gè)方多種GPP產(chǎn)生基因和任選地一種或多種GPP途徑基因；兩種或更多種橄欖酸產(chǎn)生基因；一種或多種大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因；一種或多種己酰輔酶A人聚酮合酶橄欖醇聚酮合酶~己?；宜醿?nèi)酯欖酸己酰基三乙酸內(nèi)酯芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶大麻萜酚酸△°-四氫大麻酚酸大麻二酚酸熱轉(zhuǎn)化熱轉(zhuǎn)化大麻色烯酸大麻色烯2(a)一種或多種GPP產(chǎn)生基因和任選地一種或多種GPP途徑基因；(b)兩種或更多種橄欖酸產(chǎn)生基因；(c)一種或多種大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因；(d)一種或多種己酰輔酶A產(chǎn)生基因，和(e)至少5%干重的脂肪酸或脂肪。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母，其中所述一種或多種GPP產(chǎn)生基因包含以下中的至少一a)突變的法呢基二磷酸合酶；b)包含K197E取代的突變的釀酒酵母(S.cerevisiae)ERG20;d)包含K189E取代的突變的解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)ERG20;f)編碼與SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；g)與SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或h)(a)-(g)的任何組合。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母，其中所述一種或多種GPP產(chǎn)生基因選自GPP途徑基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母，其中所述GPP途徑基因選自：b)截短的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(tHMGR);c)編碼與SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；d)與SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或e)(a)-(d)的任何組合。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述兩種或更多種橄欖酸產(chǎn)生基因包含：(a)-(d)中的至少一者和(e)-(h)中的至少一者；a)橄欖醇合酶(OLS);b)編碼與SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；c)與SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或d)(a)-(c)的任何組合；并且其中(e)-(h)包含：e)橄欖酸環(huán)化酶(OAC);f)編碼與SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、395%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；g)與SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或h)(e)-(g)的任何組合。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述一種或多種大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因包含以下中的至少一者：a)可溶性芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶；b)大麻萜酚酸合酶(CBGAS);c)編碼與SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；d)與SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或e)(a)-(e)的任何組合；其單獨(dú)地或與以下中的至少一者組合：f)四氫大麻酚酸合酶(THCAS);g)大麻二酚酸合酶(CBDAS);h)大麻色烯酸合酶(CBCAS);i)編碼與SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；j)與SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或k)(f)-(j)的任何組合。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的酵母，其中所述可溶性芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶是來自鏈霉屬菌種(Streptomycessp.)CL190菌株的NphB。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述一種或多種己酰輔酶A產(chǎn)生基因包含以下中的至少一者：a)己酰輔酶A合酶；d)突變的FAS1和突變的FAS2;e)編碼與SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和編碼與SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；f)與SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和與SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；g)編碼與SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、495%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和編碼與SEQIDNO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；h)與SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和與SEQIDNO:19具有至少70%、i)編碼與SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和編碼與SEQIDNO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；j)與SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和與SEQIDNO:21具有至少70%、k)(a)-(j)的任何組合。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酵母，其中所述突變的FAS1和FAS2基因包含選自以下的遺傳10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述酵母包含至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述酵母被遺傳修飾成生產(chǎn)至少5%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的酵母，其中所述酵母還包含提高脂肪酸或脂肪的生產(chǎn)的遺傳修飾。a)根據(jù)權(quán)利要求12所述的酵母，其中所述提高脂肪酸或脂肪的生產(chǎn)的遺傳修飾包含以b)編碼與SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；c)與SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；d)乙酰輔酶A羧化酶(ACC1);e)編碼與SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；5f)與SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；g)二?；视王ヵ；D(zhuǎn)移酶(DGA1);h)編碼與SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；i)與SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或j)(a)-(j)的任何組合。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述酵母是產(chǎn)油的。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的酵母，其中所述酵母選自紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、假絲酵母屬(Candida)、油脂酵母屬(Lipomyces)和絲孢酵母屬(Trichosporon)。15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomycestoruloides)、粘紅酵母(Rhodotorulafermentans)或彎曲隱球酵母(Cryptococcusglutinis)、發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporoncurvatus)。16.一種生產(chǎn)至少一種大麻素或大麻素前體的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的酵母與碳水化合物源在培養(yǎng)條件下接觸足以生產(chǎn)所述至少一種大麻素或大麻素前體的時(shí)間。17.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述至少一種大麻素或大麻素前體包括CBGA、18.一種大麻素前體、大麻素或其組合，所述大麻素前體、大麻素或其組合是使用根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法生產(chǎn)的。6[0002]本申請(qǐng)要求于2017年7月12日提交的題為“在酵母中生產(chǎn)包含大麻素的萜烯第62531827號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用整體并入本文。技術(shù)領(lǐng)域[0003]本公開涉及在酵母中生產(chǎn)大麻素。背景技術(shù)[0004]大麻素是一大類的化學(xué)物質(zhì)，其作用于大麻素受體和其它靶分子，以調(diào)節(jié)寬范圍的生理行為，例如神經(jīng)遞質(zhì)釋放。大麻素在人類中天然產(chǎn)生(稱為內(nèi)源性大麻素),以及由包括大麻(Cannabissativa)在內(nèi)的幾種植物物種產(chǎn)生(稱為植物性大麻素)。大麻素已顯示出具有若干有益的醫(yī)學(xué)/治療作用，因此，大麻素是制藥工業(yè)研究的活躍領(lǐng)域，可用作各種不同疾病的藥物產(chǎn)品。[0005]當(dāng)前，用于藥物或其它用途的大麻素的生產(chǎn)是通過化學(xué)合成或通過從生產(chǎn)這些大麻素的植物例如大麻(C.sativa)中提取大麻素來進(jìn)行的。當(dāng)前的大麻素生產(chǎn)方法有若干缺點(diǎn)。與從天然存在的植物中提取大麻素相比，各種大麻素的化學(xué)合成是一個(gè)昂貴的過程。大麻素的化學(xué)合成還涉及使用不環(huán)保的化學(xué)物質(zhì)，這可以被認(rèn)為是額外的生產(chǎn)成本。此外，各種大麻素的合成化學(xué)生產(chǎn)已被分類為藥理活性不如從植物如大麻中提取的那些大麻素。盡管化學(xué)合成的大麻素存在缺點(diǎn)，但這種生產(chǎn)方法的益處在于最終產(chǎn)品是高純度的單一大麻素。該純度水平對(duì)于藥物用途來說是優(yōu)選的。制藥工業(yè)所需的純度水平反映在以下事實(shí)：尚未有基于植物提取物的大麻素生產(chǎn)獲得FDA批準(zhǔn)，只有合成化合物獲得批準(zhǔn)。[0006]與大麻素的合成化學(xué)生產(chǎn)相反，目前用于生產(chǎn)大麻素的另一種方法是在天然產(chǎn)生這些化學(xué)物質(zhì)的植物中產(chǎn)生大麻素；對(duì)此來說最常用的植物是大麻。在這種方法中，栽培植物大麻，并且該植物在開花周期中天然產(chǎn)生各種大麻素?？梢允斋@該植物并且可以各種不同的方法直接從植物本身中攝取大麻素以用于藥物目的，或者可以從該植物中提取大麻素。存在多種從植物大麻中提取大麻素的方法。所有這些方法通常都涉及將含有大麻素的植物大麻置于化學(xué)溶液中，該化學(xué)溶液選擇性地將大麻素溶解到該溶液中。存在各種不同有所有不同的大麻素的這種化學(xué)溶液，留下多余的植物材料。然后可以進(jìn)一步處理含有大麻素的溶液以供使用。[0007]在植物如大麻中天然生產(chǎn)和提取大麻素存在若干缺點(diǎn)。由于大麻產(chǎn)生的大麻素種類繁多，因此通常難以利用提取工藝在植物中重現(xiàn)相同的大麻素譜。此外，植物生長(zhǎng)的變化將導(dǎo)致植物本身中大麻素的含量不同，從而難以進(jìn)行可重現(xiàn)提取。不同的大麻素譜將具有藥物產(chǎn)品所不希望的不同藥物作用。此外，從大麻提取物中提取大麻素會(huì)產(chǎn)生大麻素的混合物，而不是高純度的單一藥物化合物。由于許多大麻素的結(jié)構(gòu)相似，因此難以將這些混合7物純化到高水平，從而導(dǎo)致最終產(chǎn)品的大麻素污染。[0008]因此，需要提供一種改進(jìn)的大麻素生產(chǎn)方法。發(fā)明內(nèi)容[0009]提供本發(fā)明內(nèi)容是為了以簡(jiǎn)化形式介紹一些概念，這些概念將在下面的具體實(shí)施方式中進(jìn)一步描述。本發(fā)明內(nèi)容既不旨在鑒定所要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵或必要特征，也不旨在用于限制所要求保護(hù)的主題的范圍。根據(jù)以下書面的具體實(shí)施方式，包括在附圖中示出以及在所附權(quán)利要求中限定的那些方面，所要求保護(hù)的主題的其它特征、細(xì)節(jié)、效用和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。[0010]根據(jù)本公開的第一方面，提供了一種遺傳修飾的酵母，其包含：[0011](a)一種或多種GPP產(chǎn)生基因和任選地一種或多種GPP途徑基因；[0012](b)兩種或更多種橄欖酸產(chǎn)生基因；[0013](c)一種或多種大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因；[0014](d)一種或多種己酰輔酶A產(chǎn)生基因，和[0015](e)至少5%干重的脂肪酸或脂肪。[0016]在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種GPP產(chǎn)生基因包含以下中的至少一者：[0017]a)突變的法呢基二磷酸合酶；[0018]b)包含K197E取代的突變的釀酒酵母(S.cerevisiae)ERG20;[0020]d)包含K189E取代的突變的解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)ERG20;[0022]f)編碼與SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0023]g)與SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0024]h)(a)-(g)的任何[0025]在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種GPP產(chǎn)生基因選自GPP途徑基因。在某些實(shí)施[0026]a)羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR);[0027]b)截短的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(tHMGR);[0028]c)編碼與SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0029]d)與SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0030]e)(a)-(d)的任何組合。[0031]在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種橄欖酸產(chǎn)生基因包含：(a)-(d)中的至少一者和(e)-(h)中的至少一者；其中(a)-(d)包含：[0032]a)橄欖醇合酶(OLS);[0033]b)編碼與SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、894%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0034]c)與SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0035]d)(a)-(c)的任何組合；[0036]并且其中(e)-(h)包含：[0037]e)橄欖酸環(huán)化酶(0AC);[0038]f)編碼與SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0039]g)與SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0040]h)(e)-(g)的任何組合。[0041]在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因包含以下中的至少一者：[0042]a)可溶性芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶；[0043]b)大麻萜酚酸合酶(CBGAS);[0044]c)編碼與SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷[0045]d)與SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0046]e)(a)-(e)的任何組合；[0047]其單獨(dú)地或與以下中的至少一者組合：[0048]f)四氫大麻酚酸合酶(THCAS);[0049]g)大麻二酚酸合酶(CBDAS);[0050]h)大麻色烯酸合酶(CBCAS);[0051]i)編碼與SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷[0052]j)與SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0053]k)(f)-(j)的任何組合。[0054]在某些實(shí)施方式中，所述可溶性芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶是來自鏈霉屬菌種(Streptomycessp.)CL190菌株的NphB。[0055]在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種己酰輔酶A產(chǎn)生基因包含以下中的至少一者：[0056]a)己酰輔酶A合酶；[0057]b)HexA和HexB;[0060]e)編碼與SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、994%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和編碼與SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0061]f)與SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和與SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同[0062]g)編碼與SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和編碼與SEQIDNO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0063]h)與SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和與SEQIDNO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同[0064]i)編碼與SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和編碼與SEQIDNO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0065]j)與SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和與SEQIDNO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。[0072]b)編碼與SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0073]c)與SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、995%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；[0075]e)編碼與SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0076]f)與SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；[0077]g)二?；视王ヵ；D(zhuǎn)移酶(DGA1);[0078]h)編碼與SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0079]i)與SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0080]j)(a)-(i)的任何組合。[0081]在某些實(shí)施方式中，所述酵母是產(chǎn)油的。在某些實(shí)施方式中，所述酵母選自紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、假絲酵母屬(Candida)、油脂酵母屬(Lipomyces)和絲孢酵母屬(Trichosporon)。根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母、紅酵母(Rhodotorulaglutinis)、發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans)或彎曲隱[0082]根據(jù)本公開的第二方面，提供了一種生產(chǎn)至少一種大麻素或大麻素前體的方法，該方法包括在培養(yǎng)條件下使本公開的酵母與碳水化合物源接觸足以生產(chǎn)所述至少一種大麻素或大麻素前體的時(shí)間。[0084]根據(jù)本公開的第二方面，提供了一種大麻素前體、大麻素或其組合，所述大麻素前體、大麻素或其組合是使用根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法生產(chǎn)的。附圖說明[0085]將參考附圖討論本公開的實(shí)施方式，其中：[0086]圖1是大麻素合成途徑的圖；[0087]圖2是包括非酶促步驟的大麻素合成途徑的圖；[0088]圖3是酵母細(xì)胞組織的高級(jí)圖解；和[0089]圖4修飾前后解脂耶氏酵母的油含量。淺色的圓形區(qū)域表示圖片上的油(參見箭頭)。ad9突變體(右圖)與野生型解脂耶氏酵母(左圖)相比積累更多的油。具體實(shí)施方式[0091]對(duì)于在以下書面描述中使用的特定術(shù)語提供以下定義。[0092]除非上下文另外明確指出，否則如說明書和權(quán)利要求書中所用的不帶具體數(shù)量的11[0093]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“包含”旨在表示組合物和方法包括所列舉的要素，但不排除其它要素?！盎旧嫌伞M成”應(yīng)意味著排除對(duì)該組合具有任何實(shí)質(zhì)意義的其它要素。因此，基本上由所生產(chǎn)的大麻素組成的組合物不會(huì)排除來自分離和純化方法的痕量污染物以及藥學(xué)上可接受的載體例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等。對(duì)于所生產(chǎn)的大麻素來說，“由……組成”應(yīng)意味著排除超過痕量的其它成分的元素和實(shí)質(zhì)性方法步驟。由這些過渡術(shù)語中的每一個(gè)所定義的實(shí)施方式均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。[0094]術(shù)語“約”或“大約”是指在如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的特定值的可接受范圍給定值的至多20%、優(yōu)選至多10%、更優(yōu)選至多5%并且還更優(yōu)選地至多1%的范圍?？商娲?，特別是對(duì)于生物系統(tǒng)或過程來說，該術(shù)語可以指在數(shù)值的一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)，優(yōu)選在5倍以如±1-20%,優(yōu)選±1-10%并且更優(yōu)選±1-5%。[0095]在提供值的范圍的情況下，應(yīng)理解，在該范圍的上限和下限與所述范圍內(nèi)的任何其它所述值或中間值之間的每個(gè)中間值都被包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以被獨(dú)立地包括在較小范圍中，并且也被包括在本發(fā)明內(nèi)，但要遵守所述范圍內(nèi)的任何明確排除的限制。在所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)極限的情況下，排除那些包括的兩個(gè)極限中的任一個(gè)的范圍也被包括在本發(fā)明中。核苷酸的聚合形式。多核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行任何已知或未知的功能。術(shù)語“多核苷酸”包括例如列的分離的RNA,核酸探針和引物。核酸分子還可包含修飾的核酸分子(例如，包含修飾堿[0097]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“肽”是指兩種或更多種亞基氨基酸、氨基酸類似物或擬[0098]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體，以及氨基酸類似物和擬肽。如果肽鏈短，則三個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽通常稱為寡肽。如果肽鏈長(zhǎng)(例如，大于約10個(gè)氨基酸),則該肽通常稱為多肽或蛋白質(zhì)。剪接。編碼序列的適當(dāng)并置來控制的多核苷酸序列的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄或翻譯)。在一個(gè)方面，當(dāng)表[0101]當(dāng)在本文中使用時(shí)，“編碼序列”是當(dāng)置于適當(dāng)表達(dá)控制序列的控制下時(shí)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限于原核序列，來自真核mRNA的cDNA,來自真核終止序列通常位于編碼序列的3'端。[0102]當(dāng)在本文中使用時(shí)，如果兩個(gè)編碼序列或其互補(bǔ)序列編碼相同的氨基酸序列，則肽與細(xì)胞通信以將與其連接(例如，經(jīng)由化學(xué)鍵連接)的多肽引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡室，進(jìn)入外生/內(nèi)生細(xì)胞器，被遞送至細(xì)胞囊泡室、細(xì)胞表面或分泌多肽。在有時(shí)會(huì)被細(xì)胞切斷?？梢园l(fā)現(xiàn)信號(hào)序列與原核生物和真核生物的多種天然蛋白質(zhì)相關(guān)。[0104]當(dāng)在本文中使用時(shí)，“雜交”是指一種或多種多核苷酸反應(yīng)形成經(jīng)由核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵鍵合而穩(wěn)定化的復(fù)合物的反應(yīng)。氫鍵鍵合可以通過Watson-Crick堿基配對(duì)、Hoogstein結(jié)合或以任何其它序列特異性方式發(fā)生。所述復(fù)合物可以包括形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成多鏈復(fù)合物的三條或更多條鏈，一條自雜交鏈或這些的任何組合。雜交反應(yīng)可以構(gòu)成更廣泛過程中的一個(gè)步驟，例如PCR反應(yīng)的啟動(dòng)，或核糖酶對(duì)多核苷酸的酶促切[0105]當(dāng)在本文中使用時(shí)，多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或者多肽或多肽區(qū)域)與另一序列具有特定百分比(例如，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%)的“序列同一性”是指，當(dāng)使用本領(lǐng)域中的常規(guī)軟件程序最大程度對(duì)齊時(shí)，所述百分比的堿基(或氨基酸)在兩個(gè)序列的比較中是相同的。[0106]當(dāng)至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、優(yōu)選至少約80%并且最優(yōu)選至少約90%或95%的核苷酸在DNA序列的限定長(zhǎng)度上匹配時(shí)，兩個(gè)序列是“基本上同源約75%、優(yōu)選至少約80%并且最優(yōu)選至少約90%或95%的多肽的氨基酸殘基在多肽序列的列數(shù)據(jù)庫(kù)中可用的標(biāo)準(zhǔn)軟件比較序列來鑒定基本上同源的序列?；旧贤吹暮怂嵝蛄幸部梢栽赟outhern雜交實(shí)驗(yàn)中在例如針對(duì)該特定系統(tǒng)所限定的嚴(yán)格條件下鑒定。限定適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。例如，嚴(yán)格條件可以是：在42℃下在5xSSC和50%甲酰胺下雜交，以及在60℃下在0.1xSSC和0.1%十二烷基硫酸鈉下洗滌。嚴(yán)格雜交條件的其它實(shí)例包括：溫育溫度為約25℃至約37℃;雜交緩沖液濃度為約6xSSC至約10XSSC;甲酰胺濃度為約0%至約25%;以及洗滌溶液為約6xSSC。中等雜交條件的實(shí)例包括：溫育溫度為約40℃至約50℃;緩沖液濃度為約9xSSC至約2xSSC;甲酰胺濃度為約30%至約50%;以及洗滌溶液為約sxSSC至約2xSSC。高嚴(yán)格條件的實(shí)例包括：溫育溫度為約55℃至約68℃;緩沖液濃度為約1xSSC至約0.1xSSC;甲酰胺濃度為約55%至約75%;以及洗滌溶液為約1xSSC、0.1xSSC或去離子水。通常，雜交溫育時(shí)間為5分鐘至24小時(shí)，其中具有1、使用其它緩沖系統(tǒng)的SSC的等效物。可以通過測(cè)序來驗(yàn)證相似性，但是優(yōu)選地，也可以或替代地使用適合于所討論的特定結(jié)構(gòu)域的測(cè)定法，通過功能(例如，運(yùn)輸?shù)絻?nèi)體區(qū)室的能力等)來驗(yàn)證相似性。[0107]術(shù)語“序列相似性百分比(%)”、“序列同一性百分比(%)”等通常是指核酸分子的不同核苷酸序列或多肽的氨基酸序列之間的同一性或?qū)?yīng)程度，所述序列可能有或可能沒有共同的進(jìn)化起源(參見Reeck等，同上)。序列同一性可以使用許多公開可用的序列比較算[0108]為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸分子之間的同一性百分比，將序列對(duì)齊以達(dá)到最佳的比較目的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是所述序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，同一性百分比=相同位置數(shù)/位置總數(shù)(例如，重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方式中，兩個(gè)序列的長(zhǎng)度相同或大約相同?？梢允褂门c以下描述的技術(shù)類似的技術(shù)來確定兩個(gè)序列之間的同一性百分比，允許或不允許存在空位。在計(jì)算序列同一性百分比時(shí)，通常對(duì)精確匹配進(jìn)行計(jì)數(shù)。[0109]可以使用數(shù)學(xué)算法來確定兩個(gè)序列之間的同一性百分比。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1990,87:2264的算法，其按Karlin和Altschul,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877以用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，得分=100,字長(zhǎng)=12,以獲得與本發(fā)明序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=50,字長(zhǎng)=3,以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，可以如Altschul萬維網(wǎng)(WorldWideWeb)上的/BLAST/。[0110]用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是Myers和Miller,CABIOS罰分12和空位罰分4。[0111]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.1970,48:444-453)的算法確定兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分比，該算法已被并入到GCG軟件包(Accelrys,Burlington,MA;可在萬維網(wǎng)上的獲得)的GAP程序中，該程序使用度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。一組特別優(yōu)選的參數(shù)(以及當(dāng)專業(yè)人員不來確定分子是本發(fā)明的序列同一性還是同源性限制時(shí)可以使用的參數(shù))是使用Blossum62評(píng)分矩陣，其中空位開放罰分為12,空位延伸罰分為4并且移碼空位罰分為5。[0112]可以如何確定同一性百分比的另一個(gè)非限制性實(shí)例是通過使用軟件程序，例如在《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsInMolecularBiology)(F.M.Aus等編，1987)增刊30,第7.7.18節(jié)，表7.7.1中所述的軟件程序。優(yōu)選地，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比以下默認(rèn)參數(shù)：遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾器=無；鏈=兩個(gè)；截止值=60;期望值=10;矩陣=GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)可見于以下[0113]可以通過標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，例如t檢驗(yàn)、ANOVA或卡方檢驗(yàn)來進(jìn)行本文所述性質(zhì)的統(tǒng)計(jì)分析。通常，統(tǒng)計(jì)顯著性將被測(cè)得為以下水平：p=0.05(5%[0114]也可以提供結(jié)構(gòu)域序列的“保守修飾的變體”。關(guān)于特定的核酸序列，保守修飾的變體是指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列或者其中核酸不編碼氨基酸序列的那些核酸，指基本上相同的序列。具體而言，簡(jiǎn)并的密碼子取代可通過產(chǎn)生如下序列來實(shí)現(xiàn)，其中一種或多種選定(或全部)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer衍生物”具有與野生型蛋白的生物學(xué)活性至少基本上相等(例如，與其無顯著差異)的生物學(xué)活性，如使用適合于檢測(cè)所述活性的測(cè)定法所測(cè)量的?？贵w或其片段通常天然相關(guān)的細(xì)胞成分和其它成分分離(或基本上不含所述細(xì)胞成分和其或其片段不需要“分離”即可將其與天然存在的對(duì)應(yīng)物區(qū)分開?；旧喜缓蚧旧霞兓侵钢辽?0%的群體，優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%并且甚至更優(yōu)選至少90%的群體不含與它們天然相關(guān)的組分?？梢耘c構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA整合(共價(jià)連接),或者可以不整合(共價(jià)連接)。例如，多核苷酸可以維持在游離元件例如質(zhì)粒上，或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是其中多核苷酸已經(jīng)整合到染色體中以致它能通過染色體復(fù)制被子代細(xì)胞遺傳的細(xì)胞。該穩(wěn)定性通過所述細(xì)胞建立由包含轉(zhuǎn)化的多核苷酸的子代細(xì)胞群體組成的細(xì)胞系或克隆的能力來證實(shí)?！翱寺　笔峭ㄟ^有絲分裂從單個(gè)細(xì)胞或共同祖先衍生的細(xì)胞群體?！凹?xì)胞系”是能夠在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代(例如至少約10代)的原代細(xì)胞的克隆。[0118]“載體”包括質(zhì)粒和病毒以及可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)否自我復(fù)制。[0119]當(dāng)在本文中使用時(shí)，“遺傳修飾”是指對(duì)細(xì)胞的正常核苷酸的任何添加、缺失或破壞，和/或酵母中附加異源序列。可以實(shí)現(xiàn)遺傳修飾的任何方法都在本發(fā)明的精神和范圍[0120]除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)踐采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微和Sambrook,《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(1982);《DNA克?。簩?shí)用方法》(DNACloning:APracticalApproach),第I和《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(TranscriptionandTranslation)(B.D《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(AnimalCellCulture)(R.I.Freshney編，1986);《固定化細(xì)胞和酶》 PracticalGuidetoMolecularCloning)(1984)。[0121]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。為了描述和公開可與本文描述的發(fā)明結(jié)合使用的裝置、制劑和方法的目的，本文提及的所有出版物均通過引用并入本文。[0122]遺傳修飾的酵母菌株[0123]本文公開了包含一種或多種導(dǎo)致產(chǎn)生至少一種大麻素或大麻素前體的遺傳修飾的遺傳修飾酵母及其產(chǎn)生方法。所公開的酵母可以從簡(jiǎn)單的糖源產(chǎn)生各種大麻素，例如在的遺傳工程涉及在酵母中插入產(chǎn)生適當(dāng)酶的各種基因和/或改變天然代謝途徑，以實(shí)現(xiàn)所需化合物的生產(chǎn)。通過酵母的遺傳工程，可以將這些代謝途徑引入這些酵母中，并且酵母可以產(chǎn)生與植物大麻中產(chǎn)生的相同的代謝產(chǎn)物。這種方法的益處是，一旦對(duì)酵母進(jìn)行了工程改造，大麻素的生產(chǎn)就會(huì)成本低廉且可靠，并且取決于生物體和基因操作，僅產(chǎn)生特定的大麻素或產(chǎn)生其子集。大麻素的純化非常簡(jiǎn)單，因?yàn)榻湍钢袃H存在單一大麻素或選定的少數(shù)[0124]圖1示出了生產(chǎn)大麻素的高水平生物合成路線。該途徑始于通過聚酮合酶(OLS)和橄欖酸環(huán)化酶(OAC)的作用將己酰輔酶A轉(zhuǎn)化為橄欖酸(OA),一種聚酮化合物。然后，通過芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶用單萜烯香葉基二磷酸(GPP)將OA異戊二烯化為大麻萜酚酸(CBGA)。氫大麻酚酸合酶(THCAS)從CBGA產(chǎn)生四氫大麻酚酸(THCA),或者通過大麻色烯酸合酶(CBCAS)從CBGA產(chǎn)生大麻色烯酸(CBCA)。[0125]圖2顯示了非酶促修飾的生產(chǎn)途徑。[0126]過去，曾多次嘗試在酵母中生產(chǎn)大麻素。目前，由于產(chǎn)率極低，沒有人能夠達(dá)到合理的生產(chǎn)價(jià)格。我們已經(jīng)確定了可以如何提高產(chǎn)率。[0127]我們已經(jīng)建立了酵母中的油產(chǎn)量與理論最大大麻素產(chǎn)量之間的聯(lián)系?；谶@個(gè)出乎意料的聯(lián)系：(1)我們建議使用具有至少5%干重的脂肪酸或脂肪的酵母，例如油性酵母，例如解脂耶氏酵母，而不是在傳統(tǒng)酵母中生產(chǎn)大麻素；(2)我們還建議進(jìn)行其它遺傳修飾，以提高工程改造酵母的產(chǎn)油水平；(3)將來自大麻素生產(chǎn)途徑的其它基因與來自生產(chǎn)大麻素中間體的替代途徑的基因例如NphB組合添加；(4)通過例如遺傳突變ERG20和/或通過使用來自替代途徑的等同基因來增加GPP的產(chǎn)量；(5)增加用于大麻素生產(chǎn)途徑的來自脂肪酸[0128]大麻素在水溶液中的溶解度有限。但是，它們?cè)谑杷砸后w如脂質(zhì)、油或脂肪中具酶幾乎不能將CBGA轉(zhuǎn)化為THCA。在同一篇論文中，作者證實(shí)了未純化的酵母裂解物可明顯中，作者進(jìn)一步改善了無細(xì)胞過程。他們使用了有機(jī)疏水相和水相的兩相反應(yīng)。作者證實(shí)從此，我們可以得出結(jié)論，疏水相是成功合成所必需的，并且大麻素主要存在于有機(jī)相中。[0129]酵母細(xì)胞的高級(jí)圖解如圖3所示。傳統(tǒng)酵母如釀酒酵母、K.phaffii、馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)中的主要脂質(zhì)物質(zhì)沉積在脂質(zhì)膜中。這些類型的酵母幾乎沒有油性體。在這種情況下，產(chǎn)生的任何大麻素都會(huì)溶解在該膜中。太多的大麻素會(huì)破壞膜的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。據(jù)報(bào)道，在糖含量高且沒有氮供應(yīng)的最佳條件下，這些酵母可具有最高2-3%干重的油(即脂肪和脂肪酸)。[0130]存在若干種非傳統(tǒng)的酵母，如解脂耶氏酵母。解脂耶氏酵母的天然形式可以具有高達(dá)17%干重的油。油的主要物質(zhì)位于油性體中。溶解在此類油性體內(nèi)的大麻素不會(huì)引起膜不穩(wěn)定。因此，解脂耶氏酵母可以具有高得多的大麻素生產(chǎn)水平。多項(xiàng)工作已證實(shí)對(duì)解脂耶氏酵母的修飾可以使脂質(zhì)含量超過干重的80%(Qiao等，2015)。圖4取自Qiao等，2015,并證實(shí)了修飾型和野生型解脂耶氏酵母中油含量的差異。使用一組最少3個(gè)遺傳修飾。[0131]因此，我們建議大麻素生產(chǎn)可以達(dá)到酵母中油含量的一定百分比。這給出了相關(guān)性：更多的油意味著更多的大麻素生產(chǎn)。[0132]一篇綜述文章(?ngela等，2017)分析了作為大麻素的潛在生產(chǎn)者的不同類型的酵母。表1改編自?ngela等，2017的匯總表，其中作者在不同參數(shù)下比較了4種酵母類型。但是，他們完全忽略了油含量、理論最大生產(chǎn)極限和最小生產(chǎn)商品成本。最右邊的兩列顯示最大油量(以干重的百分比表示),以及在油中僅存在1%的大麻素時(shí)的生產(chǎn)成本。底行顯示了本公開的修飾的解脂耶氏酵母的一個(gè)實(shí)施方式。最后，?ngela等，2017的作者認(rèn)為，乙酰輔酶A庫(kù)工程改造具有優(yōu)化潛力；+。然而，我們發(fā)現(xiàn)在未修飾下YL具有高濃度的乙酰輔酶A。2017;Poulos和Farnia[0135]大麻素的途徑在多個(gè)出版物中都有描述。我們可以使用來自最近論文(2017;Poulos和Farnia[0135]大麻素的途徑在多個(gè)出版物中都有描述。我們可以使用來自最近論文(Zirpel等，2016;2016;Angela等，2017)以及其它論文的所有建議的修飾。我們可以二植物蛋白質(zhì)大腸桿菌(E.coli)十-++巴斯德畢赤酵母(P.++馬克斯克魯維酵母+十++母十+++,在未修飾下YL具*最大油%是指在最佳培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生多少油。%計(jì)算自干表1改編自Carvalho,Angela等，“設(shè)計(jì)用于大麻素的異源生物合成的微生物(Designingmicroorganismsforheterologousbiosynthesisofcannabinoids).”FEMSyeastresearch17.4(2017).1.+++,許多出版物可用，充分確定；++,有出版物可用，優(yōu)化可能；+,第一出版物可用，尚未確定/無法使用；-,不可能；‘空’,尚未描述。[0136]如關(guān)于大麻素和萜烯生產(chǎn)的多篇論文中所描述的，我大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因；(d)一種或多種己酰輔酶A產(chǎn)生基因，以及(e)至少5%干重[0139]所公開的基因可以是內(nèi)源的或異源的，并且包括保留所公開基因的功能的同源少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的多60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%的功效保留將CBGA環(huán)化以產(chǎn)生白在將CBGA環(huán)化以生產(chǎn)CBDA中具有大于110%、120%、130%、140%或和150%的改進(jìn)的活任何合適的終止子。短的合成終止子特別合適并且容易獲得，參見例如MacPherson等，某些實(shí)施方式中，基因的過表達(dá)可以使酵母中的基因產(chǎn)物的活性增加約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約105%、約110%、約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、約150%、約155%、約160%、約165%、約170%、約175%、約180%、約185%、約190%、約95%或約200%。少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%干重的脂肪酸或脂肪。酵母也可以被遺傳修飾成積累或生產(chǎn)更多的脂肪酸少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%干重基焦磷酸(GPP),然后將兩個(gè)GPP分子縮合以提供氧戊基焦磷酸(feranylpyrophosphate,突變是F96W和N127W的雙取代。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，由于來自釀酒酵母的包含：突變的法呢基二磷酸合酶；包含K197E取代的突變具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%SEQIDNO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在某些實(shí)施方式中，釀酒酵母ERG20(F96W和N127W)包含編碼與SEQIDNO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。等同的解脂耶氏酵母氨基酸序列以SEQIDNO:3和4所示。在某些實(shí)施方式中，解脂耶氏酵母ERG20(K189E)包含編碼與SEQIDNO:3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，解脂耶氏酵母ERG20(K189E)包含與SEQIDNO:3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，解脂耶氏酵母ERG20(F88W和N119W)包含與SEQIDN0:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。GPP蛋白質(zhì)的變體例如ERG20以與原始序列相比至少約80%、至少約90%或至少約100%的功效保留將異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAP)縮合為香葉基焦磷酸(GPP)的能力，而與其來源的序列相比，將GPP縮合為FPP的能力降低了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(無效突變)。MASEKEIRRERFLNVFPKLVEELNASLLAYGMPKEACDWYAHSLNYNTPGGKLNILSNKTVEQLGQEEYEKVAILGWCIELLQAYFLVADDMMDKSITRRGQPCWYKAFMLEAAIYKLLKSHFRNEKYYIDITELFHEVTFQTELGQLMDLITAPEDKVDLSKF[0147]IVTFETAYYSFYLPVALAMYVAGITDEKDLKQARDVLIPLGEYFQIQDDYLDTDIQDNKCSWVINKALELASAEQRKTLDENYGKKDSVAEAKCKKIFNDLKIEQLDI.KAKTSOVDESRGFKADVI.TAFI.NKVAFMLEAAIYKLLKSHFRNEKYYIDITELFHEVTFQTELGQLMDLITAPEDKVDLSKFIVTFKTAYYSFYLPVALAMYVAGITDEKDLKQARDVLIPLGEYFQIQDDYLDCFTDIQDNKCSWVINKALELASAEQRKTLDENYGKKDSVAEAKCKKIFNDLKIEQLDLKAKISQVDESRGFKADVLTAFLNKVMSKAKFESVFPRISEELVQLLRDEGLPQDAVQWFSDSLQYNCVGGKLNRGLSVVDTELDDEEYYRLALLGWLIELLQAFFLVSDDIMDESKTRRGQPCWYLKPKVGMIAIYILLKKHFRQEKYYIDLVELFHDISFKTELGQLVDLLTAPEDEVDLNRFSLDKHSFYSFYLPVVLAMYVAGITNPKDLQQAMDVLIPLGEYFQVQDDYLDNFGDPEFIGKIGTSWLVNKALQKATPEQRQILEDNYGVKDKSKELVIKKLYDDMKIEQDVDESRGFKKEVLNAFLAKIYKASKAKFESVFPRISEELVQLLRDEGLPQDAVQWFSDSLQYNCVGGKLNRGLSVVDTYQELDDEEYYRLALLGWLIELLQAFWLVSDDIMDESKTRRGQPCWYLKPKVGMIAYILLKKHFRQEKYYIDLVELFHDISFKTELGQLVDLLTAPEDEVDLNRFSLDKHSFIYSFYLPVVLAMYVAGITNPKDLQQAMDVLIPLGEYFQVQDDYLDNFGDPEFIGKIGTSWLVNKALQKATPEQRQILEDNYGVKDKSKELVIKKLYDDMKIEQDVDESRGFKKEVLNAFLAKIYK同一YALIOE05753P[解脂耶氏酵母CLIB122]假定蛋白[斯達(dá)氏油脂酵母NRRLY-11557]法呢基焦磷酸合酶[白地霉(galactomycescandidus)]法呢基焦磷酸合酶[復(fù)雜賽氏菌(Saitoellacomplicata)假定蛋白[TetrapisisporablattaeCBS6284]假定蛋白[德爾布有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)]未命名蛋白產(chǎn)物[小麥葉枯菌(Zymoseptoriatritici)ST99CH1E4]ERG20法呢基二磷酸合酶[小麥葉枯菌IPO323]LAFE0G04434g11[發(fā)酵性拉茜斯酵母(Lachanceafermentati)]ERG20樣蛋白[庫(kù)德里亞夫酵母(Saccharomyceskudriavze假定蛋白[堅(jiān)粘孢單頂孢(Dactylellinahaptotyla)CBS200.50]可能的法呢基焦磷酸合酶[柱隔孢葉斑病菌(Ramularia法呢基焦磷酸合酶[馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042]含聚異戊二烯基合成結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[芭蕉亞球殼(Sp[0156]高水平的GPP生產(chǎn)取決于足夠的甲羥戊酸酯生產(chǎn)。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶編碼與SEQIDNO:5具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，HMGR包含與SEQIDNO:5具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在某些實(shí)施方式中，tHmgR包含編碼與SEQIDNO:6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，tHmgR包含與SEQIDNO:6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。CN110892075A說明書17/36頁(yè)終止子(Curran等，2015)來表達(dá)GPP產(chǎn)生和GPP途徑基因?？梢酝ㄟ^過表達(dá)編碼芳樟醇合酶1mg/L的芳樟醇濃度來指示。MLQAAIGKIVGFAVNRPIHTVVLTSIVASTAYLAILDIAIPGFEGTQPISYYHPAASKSSQLAPMVQVITKIASKALFEYSLEVAALFAGAYTGVPRLSQFCIFMVLGFLGLNLINLTAIPHLGKAAAAAQSVTPITLSPELLHAIPASVPVVVTFIVIEKPSEKEEDTSSEDSIELTVGKQPKPVTETRSLDDLEAIMKAGKTKLLEDHSMPSIEVGTIGGGTILEPQGAMLEMLGVRGPHIETPGANAQQLARTQSVKVVEKHVPIVIEKPSEKEEDTSSEDSIELTVGKQPKPVTETRSLDDLEMSNVDGNLLISVSMPSIEVGTIGGGTI同一YALIOE04807P[解脂耶氏酵母CLIB122]假定蛋白[紅棕拿遜酵母伸長(zhǎng)變體DSM6958]假定蛋白[白地霉]假定蛋白[斯達(dá)氏油脂酵母NRRLY-11557]假定蛋自[季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)ATCC6260]HMG1[木質(zhì)棲息蘇吉雅瑪菌(Sugiyamaellalignohabitans)]假定蛋白[季也蒙畢赤酵母ATCC6260]假定蛋白[肌酸巴氏桿菌(Babjeviellainositovora)NRRLY-12698]DEHA2D09372P[漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)CBS767]3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1[光滑[假絲酵母]]假定蛋白[多孢范德瓦爾托茲菌(Vanderwaltozymapolyspora)DSM70294]LAFE_0A01552g1_1[發(fā)酵性拉茜斯酵母]假定蛋白[法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)]未表征蛋白[KuraishiacapsulataCBS1993]未表征蛋白[光滑假絲酵母][0166]橄欖酸(OA)的生產(chǎn)需要底物己酰輔酶A和3個(gè)丙二酰輔酶A分子，其中丙二酰輔酶A分子在酵母中由ACC1從乙酰輔酶A天然產(chǎn)生。橄欖酸的生產(chǎn)需要兩種酶來縮合和隨后環(huán)化丙二酰輔酶A與己酰輔酶A。該過程需要四酮合酶即橄欖酸合酶(OS)和聚酮環(huán)化酶即橄欖酸環(huán)化酶(OAC)。在某些實(shí)施方式中，兩種或更多種橄欖酸產(chǎn)生基因包含橄欖醇合酶(LS)和橄欖酸環(huán)化酶(OAC)。此處顯示了大麻基因的序列，但是技術(shù)人員應(yīng)理解，同源基因也可能85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，OLS包含與SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在某些實(shí)施方式中，OAC包含編碼與SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，OAC包含與SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。[0167]OA蛋白的變體例如0AC保留了例如催化作為底物的線性戊基四-β-酮輔酶A進(jìn)行C2-C7醛醇環(huán)化以生成OA的能力。例如，OA蛋白的變體例如0AC必須以與原始序列相比至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%的功效保留催化作為底物的線性戊基四-β-酮輔酶A進(jìn)行C2-C7醛醇環(huán)化以生成OA的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，OA蛋白的變體例如OAC與其來源的序列相比具有改進(jìn)的活性，因?yàn)樗龈倪M(jìn)的變體普通大麻素蛋白與所述改進(jìn)的變體所來源的序列相比，在催化作為底物的線性戊基四-β-酮輔酶A進(jìn)行C2-C7醛醇環(huán)化以生成OA中具有大于110%、120%、130%、140%或和150%的改進(jìn)的活性。[0168]OA產(chǎn)生基因OLS和OAC可以使用例如組成型TEF內(nèi)含子啟動(dòng)子或天然啟動(dòng)子(Wong等，2017)和合成的短終止子(Curran等，2015)來表達(dá)?？梢允褂酶咝б合嗌V(HPLC)或液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)來確定0A的產(chǎn)量增加。由于酵母不內(nèi)源性生產(chǎn)OA,因此0A的存在表明OLS和OAS起作用。LPNSEGTIGGHIREAGLIFDLHKDVPMLISNNIEKCLIEAFTPIGISDWN大麻素前體或大麻素產(chǎn)生基因大麻素四氫大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻色烯酸(CBCA)的生產(chǎn)涉及通過芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶用GPP將OA異戊二烯化為CBGA,然后分別通過CBDAS、THCAS或[0175]酵母不天然生產(chǎn)CBGA,因此CBGA可以通過異源表達(dá)來自大麻的CBGA合酶如膜結(jié)合85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。CBGA也可以通過可溶性芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)來形可溶性芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶是NphB,其包含Q161A取代的突變。NphB(Q161A)與野生型80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，NphB包含與SEQIDNO:12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性[0177]大麻素前體或大麻素產(chǎn)生蛋白的變體例如NphB(Q161A)保留了將香葉基基團(tuán)連接如NphB(Q161A