ICS65.020DB43DB43/T1966—2020大型溞繁殖毒性試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程GuidelineforReproductionTestofDaphniamagnaStraus2020-12-29發(fā)布2021-03-29實(shí)施湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB43/T1966—2020前言 Ⅲ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4環(huán)境條件 5儀器設(shè)備和器材 26培養(yǎng)基 7試驗(yàn)溶液 28受試生物 29試驗(yàn)方法 4附錄A（資料性）ElendtM4培養(yǎng)液和M7培養(yǎng)基的制備 5DB43/T1966—2020本文件按照GB/T1.1—2020給出的規(guī)則起草。本文件某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：湖南省植物保護(hù)研究所,長(zhǎng)沙艾格里生物科技有限公司。本文件主要起草人：陳昂、劉勇、張德詠、張戰(zhàn)泓、羅杰、蔣桂芳、陳武瑛、熊浩、羅香文。DB43/T1966—20201大型溞繁殖毒性試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了大型溞繁殖試驗(yàn)的環(huán)境條件、儀器和設(shè)備、培養(yǎng)基、試驗(yàn)方法、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處理等。本文件適用于湖南省實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大型溞繁殖毒性試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB14942食品容器、包裝材料用聚碳酸酯成型衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T31270化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則NY/T1667農(nóng)藥登記管理術(shù)語3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1親溞ParentAnimals試驗(yàn)開始時(shí)用于繁殖的雌溞。3.2幼溞Offspring試驗(yàn)期間親溞所產(chǎn)的溞。3.3死亡Mortality溞體不能游動(dòng)，或輕晃試驗(yàn)容器，15s內(nèi)溞的附肢或后腹部也未見活動(dòng)。4環(huán)境條件4.1光照每天光照16h，光照強(qiáng)度不超過1500lx。4.2溫度試驗(yàn)的溫度在18～22℃范圍內(nèi)。對(duì)于同一個(gè)試驗(yàn)，溫度變化不得超過2℃。2DB43/T1966—20204.3溶解氧試驗(yàn)開始與試驗(yàn)期間，溶解氧濃度應(yīng)大于3mg/L。4.4pHpH在6～9的范圍內(nèi)。正常情況下，任何一個(gè)試驗(yàn)中pH值的變化不應(yīng)大于1.5個(gè)單位。4.5硬度硬度（以CaCO3計(jì)）應(yīng)大于140mg/L。5儀器設(shè)備和器材試驗(yàn)容器和其它試驗(yàn)溶液接觸的器皿應(yīng)為全玻璃制品，或由其它化學(xué)惰性材料制成。試驗(yàn)容器通常為玻璃燒杯。需要的主要儀器為：a）溶解氧測(cè)定儀；b）適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂圃O(shè)備；d）水質(zhì)硬度測(cè)定儀；e）測(cè)定水中總有機(jī)碳（TOC）或化學(xué)需氧量（COD）的設(shè)備；f）光照控制設(shè)備以及光度計(jì)等。g）色譜分析儀、質(zhì)樸分析儀等6培養(yǎng)基6.1推薦ElendtM4和M7培養(yǎng)基（見附錄A）。6.2ElendtM4和M7培養(yǎng)基不能用于含有金屬受試物的測(cè)試，對(duì)于含有金屬的供試品，可選擇替代培養(yǎng)基，如不含有EDTA的ASTM重組水。7試驗(yàn)溶液7.1不同濃度的試驗(yàn)溶液一般由儲(chǔ)備液稀釋而成。儲(chǔ)備液最好是將供試品加入到試驗(yàn)用水中配制而成。7.2若使用溶劑或分散劑助溶，其在培養(yǎng)基中的最終濃度應(yīng)≤0.1mg/L。8受試生物8.1受試生物為大型溞（DaphniamagnaStraus保持良好的培養(yǎng)條件，使大型溞的繁殖處于孤雌生殖狀態(tài)，且試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每只存活親溞所產(chǎn)存活幼溞的平均值≥60只。8.2試驗(yàn)開始時(shí)，試驗(yàn)用溞應(yīng)是出生小于24h的非頭胎溞。試驗(yàn)用溞應(yīng)來源于同一個(gè)健康的保種培養(yǎng)，即未表現(xiàn)任何受脅迫現(xiàn)象（如死亡率高，出現(xiàn)雄溞和冬卵，頭胎延遲，體色異常等）。日常培養(yǎng)條件（光照、溫度、培養(yǎng)液、喂食單位體積的動(dòng)物數(shù)量）應(yīng)當(dāng)和試驗(yàn)條件一致，如果試驗(yàn)時(shí)溞類培養(yǎng)基與日常使用的培養(yǎng)基不同，試驗(yàn)前最好設(shè)置馴養(yǎng)期，一般試驗(yàn)用溞應(yīng)在試驗(yàn)條件下馴養(yǎng)3周（即一代）以避免新培養(yǎng)基對(duì)親溞產(chǎn)生脅迫作用。DB43/T1966—20209試驗(yàn)方法9.1暴露條件9.1.1試驗(yàn)周期9.1.2試驗(yàn)負(fù)載9.1.2.1每個(gè)容器一只親溞，容器中培養(yǎng)液體積為50～100mL。9.1.2.2盡管允許合并各平行的溶液進(jìn)行化學(xué)分析，有時(shí)為了分析測(cè)定供試品濃度的需要，需要增加溶液的體積。若所用體積大于100mL，需要增加溞的喂食量以確保有足夠的食物。對(duì)于流水式試驗(yàn)，可分成4個(gè)平行，每組10只溞放在一個(gè)較大的試驗(yàn)容器中，應(yīng)記錄對(duì)于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的任何變化。9.1.3曝氣試驗(yàn)期間不能曝氣。9.2試驗(yàn)生物及喂食9.2.1半靜態(tài)試驗(yàn)每個(gè)供試物濃度處理組及對(duì)照組至少10只溞并分開培養(yǎng)，最好每天喂食，至少也應(yīng)每周3次（即9.2.2流水式試驗(yàn)要求每一濃度40只溞，分成4個(gè)平行，每組10只。也可減少試驗(yàn)用溞，但至少20只，且應(yīng)該以相同數(shù)量分成兩個(gè)或多個(gè)平行。若有親溞死亡，就不能計(jì)算試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每只存活親溞的繁殖量。在這種情況下繁殖量應(yīng)該以試驗(yàn)開始時(shí)存在的每只親溞所產(chǎn)存活幼溞總數(shù)表示。9.2.3如果使用替代測(cè)定的方法，如藻細(xì)胞數(shù)量法或光吸收法來計(jì)算喂食量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)單獨(dú)建立碳含量和替代測(cè)定方法的指標(biāo)之間的線形圖。線形圖至少每年校準(zhǔn)一次。9.2.4推薦食物：小球藻（Chlorellasp.）、羊角月牙藻（Pseudokirchneriellasubcapitata）和柵藻（Desmodesmussubspicatus）。喂食量以提供每只親溞的有機(jī)碳數(shù)量為基礎(chǔ)，應(yīng)在0.1～0.2mgC/（溞?d）范圍內(nèi)。喂食量在試驗(yàn)期間可保持不變，也可以在初期稍低，隨親溞的生長(zhǎng)而逐漸增加，但始終應(yīng)在推薦的范圍內(nèi)。應(yīng)給大型溞喂食濃縮了的藻液，盡量避免過多的藻培養(yǎng)液浸入試驗(yàn)容器。濃縮藻液可通過離心獲得，然后用蒸餾水、去離子水或溞培養(yǎng)液使其重新懸浮。9.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)9.3.1預(yù)實(shí)驗(yàn)按正式試驗(yàn)的條件，設(shè)置較大范圍濃度系列的試驗(yàn)藥液，每個(gè)試驗(yàn)濃度組設(shè)2個(gè)平行，對(duì)照組不設(shè)平行，以得到正式試驗(yàn)的濃度范圍。9.3.2正實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的濃度范圍內(nèi)按一定比例間距（極差應(yīng)控制在3.2倍以內(nèi)）設(shè)置至少5個(gè)濃度組，并DB43/T1966—20204設(shè)立空白對(duì)照組，如使用溶劑助溶還應(yīng)設(shè)溶劑對(duì)照組。9.3.3限度試驗(yàn)設(shè)置上限濃度10mg/L，濃度組和對(duì)照組均設(shè)10個(gè)平行。若供試物溶解度小于10mg/L，則采用最大溶解度作為上限濃度。9.3.4參比物質(zhì)實(shí)驗(yàn)應(yīng)定期（至少每年一次）進(jìn)行參比物質(zhì)試驗(yàn)，參比物質(zhì)為重鉻酸鉀。9.4培養(yǎng)基更換頻率半靜態(tài)試驗(yàn)中，每周至少更換3次溶液，若供試品不穩(wěn)定，應(yīng)考慮增加更換頻率，或使用流水式系統(tǒng)。轉(zhuǎn)移親溞時(shí)，原有溶液體積應(yīng)盡可能最少。9.5幼溞從頭胎開始，應(yīng)每天從試驗(yàn)容器中移出幼溞，以避免食物的消耗影響親溞。對(duì)存活的幼溞、死亡的幼溞和死胎進(jìn)行計(jì)數(shù)，并記錄雄溞和冬卵出現(xiàn)的情況。9.6死亡率每天記錄親溞的死亡數(shù)。9.7分析、測(cè)定頻率9.7.1每周測(cè)定一次對(duì)照組和供試物最高濃度處理組的新、舊溶液的溶解氧濃度、溫度、硬度和pH。9.7.2試驗(yàn)期間應(yīng)每周測(cè)定溶液中的供試物濃度。9.7.3半靜態(tài)試驗(yàn)的供試物濃度應(yīng)保持在配制濃度或初始濃度的±20％范圍內(nèi)，那么在更換溶液時(shí)，每周測(cè)定一次最高和最低濃度組的新、舊溶液的濃度。不在此范圍內(nèi)，則必須分析所有新、舊試驗(yàn)溶液。9.7.4流水式試驗(yàn)無需測(cè)定待更新試驗(yàn)溶液，應(yīng)每天檢查試驗(yàn)用水及貯備液的流速。9.8數(shù)據(jù)處理9.8.1在試驗(yàn)期間，若供試物濃度保持在配制濃度或初始濃度的±20％范圍內(nèi)，應(yīng)以配制濃度或初始濃度計(jì)算結(jié)果。若偏離此范圍，則以實(shí)測(cè)濃度計(jì)算結(jié)果。9.8.2通過對(duì)供試物處理組繁殖的幼溞總數(shù)量進(jìn)行與空白對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以此來評(píng)估供試物對(duì)大型溞繁殖試驗(yàn)的影響。選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法或相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算ECχ及其95％置信限。10質(zhì)量控制10.1試驗(yàn)開始時(shí)所用幼雌溞溞齡不能超過24h，且為非頭胎溞。10.2為確保試驗(yàn)的有效性，對(duì)照組應(yīng)符合以下要求：a）試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，親溞的死亡率不能超過20%;b）試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞的平均值≥60只。DB43/T1966—2020ElendtM4培養(yǎng)液和M7培養(yǎng)基的制備A.1ElendtM4培養(yǎng)液和M7培養(yǎng)基的制備使用去離子水、蒸餾水或反向滲透水分別制備各微量元素的貯備液Ⅰ,用貯備液Ⅰ制備貯備液Ⅱ,它含有的所有微量元素（混合液見表A.1。表A.1微量