2025年環(huán)境DNA技術(shù)原理培訓(xùn)試題附答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共40分）1.環(huán)境DNA（eDNA）技術(shù)中，“環(huán)境”通常指生物個(gè)體外的哪類(lèi)介質(zhì)？A.僅水體B.水體、土壤、空氣、沉積物等C.僅動(dòng)植物體表分泌物D.人工合成培養(yǎng)基2.以下哪項(xiàng)不是eDNA的主要來(lái)源？A.生物脫落的表皮細(xì)胞B.糞便中的腸道微生物DNAC.死亡個(gè)體的組織分解產(chǎn)物D.實(shí)驗(yàn)室人為添加的標(biāo)準(zhǔn)品DNA3.用于eDNA捕獲的玻璃纖維濾膜（GF/F）孔徑通常為？A.0.22μmB.0.45μmC.0.7μmD.1.2μm4.eDNA樣本保存時(shí)，若使用無(wú)水乙醇固定，樣本與乙醇的體積比建議為？A.1:1B.1:2C.1:3D.1:55.抑制eDNAPCR擴(kuò)增的常見(jiàn)物質(zhì)不包括？A.腐殖酸B.金屬離子（如Fe3?）C.牛血清白蛋白（BSA）D.多糖類(lèi)物質(zhì)6.針對(duì)魚(yú)類(lèi)多樣性監(jiān)測(cè)，常用的標(biāo)記基因是？A.16SrRNAB.18SrRNAC.12SrRNAD.COI（細(xì)胞色素c氧化酶亞基I）7.eDNA降解的主要影響因素不包括？A.紫外線輻射B.溫度升高C.核酸酶活性D.樣本運(yùn)輸時(shí)間（<24小時(shí)）8.以下哪種方法屬于eDNA的“主動(dòng)捕獲”技術(shù)？A.靜置水樣自然沉淀后取上清B.使用真空泵驅(qū)動(dòng)濾膜過(guò)濾水樣C.采集表層沉積物后直接提取D.收集空氣顆粒物后洗脫DNA9.生物信息學(xué)分析中，“OTU聚類(lèi)”的主要目的是？A.去除測(cè)序錯(cuò)誤產(chǎn)生的低豐度序列B.將相似性≥97%的序列歸為同一操作分類(lèi)單元C.比對(duì)參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋D.統(tǒng)計(jì)各物種的相對(duì)豐度10.評(píng)估eDNA技術(shù)靈敏度時(shí)，關(guān)鍵指標(biāo)是？A.檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）B.樣本體積C.測(cè)序讀長(zhǎng)D.引物退火溫度11.針對(duì)底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)，優(yōu)先選擇的樣本類(lèi)型是？A.表層水樣（0-50cm）B.底層沉積物（0-10cm）C.大氣降塵D.植物葉片表面附著水12.eDNA技術(shù)在入侵物種監(jiān)測(cè)中的優(yōu)勢(shì)是？A.可直接觀察到活體個(gè)體B.對(duì)微小或隱蔽物種的檢測(cè)效率更高C.無(wú)需考慮樣本保存條件D.能準(zhǔn)確測(cè)定物種年齡結(jié)構(gòu)13.以下哪項(xiàng)是eDNA提取時(shí)“內(nèi)參基因”的主要作用？A.驗(yàn)證PCR擴(kuò)增效率B.標(biāo)記目標(biāo)物種的特異性序列C.評(píng)估樣本中抑制物的干擾程度D.區(qū)分環(huán)境DNA與實(shí)驗(yàn)室污染14.若需同時(shí)監(jiān)測(cè)魚(yú)類(lèi)和浮游植物，應(yīng)選擇的引物組合是？A.魚(yú)類(lèi)12S引物+浮游植物18S引物B.魚(yú)類(lèi)COI引物+浮游植物ITS引物C.魚(yú)類(lèi)16S引物+浮游植物12S引物D.魚(yú)類(lèi)Cytb引物+浮游植物COI引物15.環(huán)境樣本中eDNA的濃度與生物量的關(guān)系通常表現(xiàn)為？A.嚴(yán)格線性正相關(guān)B.指數(shù)正相關(guān)C.弱相關(guān)或受其他因素干擾的正相關(guān)D.負(fù)相關(guān)16.以下哪種方法可有效減少eDNA樣本的交叉污染？A.在同一實(shí)驗(yàn)室同時(shí)處理陽(yáng)性和陰性樣本B.使用一次性濾膜和無(wú)DNA酶的槍頭C.增加PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（如40個(gè)循環(huán)）D.樣本提取后長(zhǎng)期（>6個(gè)月）保存于-20℃17.針對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的eDNA監(jiān)測(cè)，需特別關(guān)注的抑制物是？A.重金屬離子B.藻毒素C.高濃度腐殖酸D.抗生素殘留18.宏條形碼（metabarcoding）技術(shù)與傳統(tǒng)PCR的主要區(qū)別是？A.前者使用通用引物擴(kuò)增多個(gè)物種，后者使用特異性引物B.前者僅檢測(cè)單一物種，后者檢測(cè)多個(gè)物種C.前者無(wú)需測(cè)序，后者需測(cè)序D.前者對(duì)樣本質(zhì)量要求更低19.eDNA技術(shù)用于古生態(tài)研究時(shí)，關(guān)鍵挑戰(zhàn)是？A.樣本中eDNA含量極低且高度降解B.缺乏古生物的參考基因數(shù)據(jù)庫(kù)C.現(xiàn)代生物eDNA的污染風(fēng)險(xiǎn)高D.以上都是20.2025年新型eDNA捕獲材料“納米纖維膜”的優(yōu)勢(shì)是？A.孔徑均一性差，易堵塞B.對(duì)微生物DNA的吸附能力弱C.可重復(fù)使用且耐化學(xué)腐蝕D.僅適用于空氣樣本二、填空題（每空1分，共20分）1.環(huán)境DNA技術(shù)的核心假設(shè)是：生物在生存環(huán)境中會(huì)持續(xù)向周?chē)橘|(zhì)釋放_(tái)_______，其存在可反映該生物的________。2.eDNA捕獲的主要方法包括________（如濾膜過(guò)濾）和________（如離心沉淀）。3.常用的eDNA保存液除無(wú)水乙醇外，還有________（需添加EDTA抑制核酸酶）和________（用于長(zhǎng)期低溫保存）。4.PCR擴(kuò)增時(shí)，引物設(shè)計(jì)需滿足________（避免引物二聚體）和________（與目標(biāo)區(qū)域特異性結(jié)合）要求。5.生物信息學(xué)分析中，原始測(cè)序數(shù)據(jù)需經(jīng)過(guò)________（去除低質(zhì)量讀長(zhǎng)）、________（合并雙端測(cè)序結(jié)果）和________（去除嵌合體）等步驟預(yù)處理。6.eDNA質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括________（驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)外源污染）、________（評(píng)估目標(biāo)基因擴(kuò)增效率）和________（確認(rèn)測(cè)序結(jié)果的生物學(xué)意義）。7.2025年新發(fā)布的eDNA技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中，要求每個(gè)樣本至少設(shè)置________個(gè)技術(shù)重復(fù)，陰性對(duì)照的eDNA濃度需低于________（單位）。8.針對(duì)沉積物eDNA提取，需先通過(guò)________（如PBS緩沖液）洗脫表面吸附的DNA，再結(jié)合________（如CTAB法）或柱式提取法純化。三、簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）1.簡(jiǎn)述eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)生物調(diào)查方法（如網(wǎng)捕、樣方計(jì)數(shù)）的主要差異。2.說(shuō)明濾膜孔徑選擇對(duì)eDNA捕獲效率的影響，并舉例兩種不同孔徑濾膜的適用場(chǎng)景。3.分析腐殖酸抑制PCR擴(kuò)增的機(jī)制，提出3種減少其干擾的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)措施。4.解釋“假陰性”和“假陽(yáng)性”結(jié)果在eDNA監(jiān)測(cè)中的可能原因，并分別給出驗(yàn)證方法。5.2025年某團(tuán)隊(duì)計(jì)劃用eDNA技術(shù)監(jiān)測(cè)長(zhǎng)江上游某支流的魚(yú)類(lèi)多樣性，需設(shè)計(jì)哪些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟？請(qǐng)列出并簡(jiǎn)述各步驟目的。四、案例分析題（每題10分，共20分）案例1：某實(shí)驗(yàn)室對(duì)城市湖泊進(jìn)行eDNA監(jiān)測(cè)，測(cè)序結(jié)果顯示“中華絨螯蟹（大閘蟹）”的eDNA陽(yáng)性，但實(shí)地調(diào)查未發(fā)現(xiàn)該物種。（1）可能的原因有哪些？（5分）（2）提出3種驗(yàn)證方法以確認(rèn)結(jié)果的可靠性。（5分）案例2：某團(tuán)隊(duì)使用玻璃纖維濾膜（0.7μm）過(guò)濾5L河水樣本，提取eDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示目標(biāo)基因未擴(kuò)增成功。（1）分析可能的失敗原因（至少4點(diǎn)）。（5分）（2）針對(duì)每點(diǎn)原因提出改進(jìn)措施。（5分）答案一、單項(xiàng)選擇題1.B2.D3.C4.A5.C6.C7.D8.B9.B10.A11.B12.B13.C14.A15.C16.B17.C18.A19.D20.C二、填空題1.DNA片段；存在或分布2.主動(dòng)捕獲；被動(dòng)捕獲3.RNAlater；TE緩沖液（或Tris-EDTA緩沖液）4.引物特異性；引物退火溫度匹配（或引物GC含量適宜）5.質(zhì)量過(guò)濾；雙端合并（或拼接）；嵌合體檢測(cè)6.陰性對(duì)照；陽(yáng)性對(duì)照；生物信息學(xué)質(zhì)控（或數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)驗(yàn)證）7.3；1拷貝/μL（或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)具體數(shù)值，如0.5拷貝/μL）8.洗脫緩沖液；裂解液（或蛋白酶K消化）三、簡(jiǎn)答題1.差異：①非損傷性：eDNA無(wú)需直接接觸或捕獲生物；②檢測(cè)范圍廣：可同時(shí)檢測(cè)微小、隱蔽或稀有物種；③時(shí)間整合性：反映一定時(shí)間內(nèi)的生物活動(dòng)痕跡；④局限性：無(wú)法直接獲取個(gè)體形態(tài)、年齡等信息，依賴(lài)基因數(shù)據(jù)庫(kù)完整性。2.影響：孔徑過(guò)小（如0.22μm）易堵塞且可能截留過(guò)多非目標(biāo)顆粒（如細(xì)菌），增加抑制物干擾；孔徑過(guò)大（如1.2μm）可能漏過(guò)小型生物的eDNA片段（如浮游動(dòng)物）。適用場(chǎng)景：0.45μm濾膜用于淡水魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)（兼顧魚(yú)類(lèi)細(xì)胞和微生物截留）；0.7μmGF/F濾膜用于海洋大型生物監(jiān)測(cè)（減少堵塞并保留較大DNA片段）。3.機(jī)制：腐殖酸通過(guò)與DNA結(jié)合抑制Taq酶活性，或通過(guò)吸附作用減少可用DNA模板量。改進(jìn)措施：①增加樣本稀釋倍數(shù)（降低腐殖酸濃度）；②使用活性炭柱或磁珠純化（特異性吸附腐殖酸）；③優(yōu)化PCR反應(yīng)體系（添加BSA或聚乙二醇，中和抑制物）。4.假陰性原因：目標(biāo)物種eDNA濃度低于檢測(cè)限、引物與目標(biāo)基因不匹配、抑制物干擾。驗(yàn)證方法：增加樣本體積、更換通用引物、添加內(nèi)參基因評(píng)估抑制程度。假陽(yáng)性原因：實(shí)驗(yàn)室交叉污染、參考數(shù)據(jù)庫(kù)錯(cuò)誤注釋、環(huán)境中存在同源物種。驗(yàn)證方法：設(shè)置嚴(yán)格陰性對(duì)照、Sanger測(cè)序驗(yàn)證目標(biāo)片段、擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)范圍。5.關(guān)鍵步驟：①樣點(diǎn)布設(shè)：根據(jù)支流生境（如深潭、淺灘）設(shè)置5-8個(gè)采樣點(diǎn)，覆蓋不同微生境（目的：確保代表性）；②樣本采集：采集表層（0-30cm）和底層（離底20cm）水樣各2L，共4L/點(diǎn)（目的：減少垂直分布差異）；③現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾：使用0.45μm聚碳酸酯濾膜，每樣本分2次過(guò)濾（1L/次）（目的：降低堵塞風(fēng)險(xiǎn)）；④保存：濾膜立即浸入95%乙醇（1:1體積比），-20℃運(yùn)輸（目的：抑制DNA降解）；⑤提?。翰捎弥教崛≡噭┖校ê乘崛コ襟E），每批樣本設(shè)1個(gè)陰性提取對(duì)照（目的：監(jiān)控污染）；⑥擴(kuò)增：使用魚(yú)類(lèi)通用12S引物（如MiFish-U），每個(gè)樣本3個(gè)技術(shù)重復(fù)（目的：提高檢測(cè)可靠性）；⑦測(cè)序：IlluminaMiSeq平臺(tái)（2×300bp），數(shù)據(jù)量≥50萬(wàn)讀長(zhǎng)/樣本（目的：覆蓋低豐度物種）；⑧分析：基于BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)蕹S度<0.1%的序列（目的：減少測(cè)序誤差）。四、案例分析題案例1（1）可能原因：①外源輸入（如周邊市場(chǎng)丟棄的蟹殼污染）；②參考數(shù)據(jù)庫(kù)中存在近緣物種的序列誤判；③實(shí)驗(yàn)過(guò)程中交叉污染（如陽(yáng)性樣本與陰性樣本未分開(kāi)處理）；④該物種曾短暫出現(xiàn)但已消失（eDNA殘留）。（2）驗(yàn)證方法：①擴(kuò)大采樣范圍（如上游、下游），確認(rèn)eDNA分布是否集中；②對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger測(cè)序，與模式物種的12S/COI基因比對(duì)；③增加環(huán)境因子調(diào)查（如周邊是否有水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)）；④重復(fù)采樣（間隔2周），觀察eDNA是否持續(xù)存在。案例2（1）可能原因：①濾膜孔徑過(guò)大（0.7μm）導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)eDNA（通常附著在0.2-0.5μm顆粒）未被有效截留；②水樣中抑