慢性應(yīng)激對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響：基于空間學(xué)習(xí)記憶與腦內(nèi)BDNF表達(dá)的研究一、引言1.1研究背景與意義在現(xiàn)代社會(huì)，人們面臨著來(lái)自生活、工作、學(xué)習(xí)等多方面的壓力，長(zhǎng)期處于這種壓力狀態(tài)下，便會(huì)引發(fā)慢性應(yīng)激。慢性應(yīng)激作為一種常見(jiàn)的心理和生理狀態(tài)，對(duì)人體健康的危害不容小覷，已成為現(xiàn)代社會(huì)中一個(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題。相關(guān)研究表明，慢性應(yīng)激不僅會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等造成損害，還與多種精神疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如抑郁癥、焦慮癥等。更為關(guān)鍵的是，慢性應(yīng)激會(huì)對(duì)大腦的認(rèn)知功能產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力下降，進(jìn)而嚴(yán)重影響人們的日常生活和工作效率。例如，長(zhǎng)期處于工作壓力下的人群，常常會(huì)出現(xiàn)記憶力減退、注意力不集中等問(wèn)題，這些都可能是慢性應(yīng)激對(duì)大腦認(rèn)知功能產(chǎn)生損害的表現(xiàn)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-DerivedNeurotrophicFactor，BDNF）作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它對(duì)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、分化和突觸可塑性都有著深遠(yuǎn)的影響。在神經(jīng)元存活方面，BDNF能夠?yàn)樯窠?jīng)元提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持，幫助神經(jīng)元抵御外界的損傷和壓力，從而維持神經(jīng)元的正常存活。在生長(zhǎng)和分化過(guò)程中，BDNF可以引導(dǎo)神經(jīng)元的生長(zhǎng)方向，促進(jìn)神經(jīng)元的分化，使其形成特定的功能和形態(tài)。而在突觸可塑性方面，BDNF更是發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠增強(qiáng)突觸之間的聯(lián)系，使神經(jīng)元之間的信息傳遞更加高效，從而對(duì)學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程產(chǎn)生積極影響。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，BDNF水平的變化與學(xué)習(xí)記憶能力的改變密切相關(guān)。當(dāng)BDNF水平升高時(shí)，學(xué)習(xí)和記憶能力往往會(huì)得到增強(qiáng)；反之，當(dāng)BDNF水平降低時(shí)，學(xué)習(xí)和記憶能力則會(huì)受到損害。基于以上背景，深入研究慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響具有極其重要的意義。從理論層面來(lái)看，這有助于我們更加深入地揭示慢性應(yīng)激影響認(rèn)知功能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為理解大腦在應(yīng)激狀態(tài)下的變化提供重要的理論依據(jù)。通過(guò)研究，我們可以了解慢性應(yīng)激是如何作用于大腦，影響神經(jīng)元的功能和BDNF的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的。從實(shí)際應(yīng)用角度而言，本研究的成果有望為相關(guān)神經(jīng)精神疾病的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和干預(yù)策略。例如，如果我們能夠明確慢性應(yīng)激與BDNF表達(dá)之間的關(guān)系，就可以通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF的水平來(lái)改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害，為抑郁癥、焦慮癥等疾病的治療開(kāi)辟新的途徑。此外，本研究對(duì)于提高人們的心理健康水平、改善生活質(zhì)量也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)槿藗儜?yīng)對(duì)生活中的壓力提供科學(xué)的指導(dǎo)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，慢性應(yīng)激與小鼠空間學(xué)習(xí)記憶、BDNF表達(dá)關(guān)系的研究起步較早，取得了一系列重要成果。有研究通過(guò)對(duì)小鼠施加長(zhǎng)期不可預(yù)測(cè)的溫和應(yīng)激（如禁食、禁水、晝夜顛倒、潮濕環(huán)境等），發(fā)現(xiàn)小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)明顯變差，尋找隱藏平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)，在目標(biāo)象限的停留時(shí)間明顯縮短，這表明慢性應(yīng)激嚴(yán)重?fù)p害了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。同時(shí)，利用免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠腦內(nèi)尤其是海馬區(qū)的BDNF表達(dá)水平顯著降低，并且這種降低與學(xué)習(xí)記憶能力的下降呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。此外，一些研究還深入探討了BDNF在慢性應(yīng)激影響學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的作用機(jī)制，提出BDNF可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、分化、突觸可塑性以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等途徑，來(lái)影響大腦的學(xué)習(xí)記憶功能。當(dāng)BDNF表達(dá)減少時(shí)，神經(jīng)元的存活受到威脅，突觸可塑性降低，神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞也受到干擾，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力受損。國(guó)內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究也在不斷深入。眾多學(xué)者采用不同的慢性應(yīng)激模型，如束縛應(yīng)激、足底電擊應(yīng)激等，對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行研究，同樣發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。在對(duì)BDNF表達(dá)的研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者不僅驗(yàn)證了國(guó)外研究中關(guān)于慢性應(yīng)激下BDNF表達(dá)降低的結(jié)論，還進(jìn)一步研究了不同腦區(qū)BDNF表達(dá)的變化差異，以及BDNF基因多態(tài)性與慢性應(yīng)激易感性的關(guān)系。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，除了海馬區(qū)，前額葉皮層等腦區(qū)的BDNF表達(dá)在慢性應(yīng)激下也會(huì)發(fā)生顯著變化，且這些變化與小鼠的行為學(xué)改變密切相關(guān)。此外，關(guān)于BDNF基因多態(tài)性的研究表明，某些基因亞型可能會(huì)增加個(gè)體對(duì)慢性應(yīng)激的易感性，使得在同樣的應(yīng)激條件下，攜帶特定基因亞型的個(gè)體更容易出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能受損和BDNF表達(dá)異常的情況。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響方面取得了一定的研究成果，但仍存在一些不足和空白。目前對(duì)于慢性應(yīng)激的模型構(gòu)建和刺激方式尚未完全統(tǒng)一，不同的實(shí)驗(yàn)條件可能導(dǎo)致結(jié)果存在差異，這給研究結(jié)果的比較和整合帶來(lái)了困難。例如，不同實(shí)驗(yàn)室采用的應(yīng)激刺激強(qiáng)度、頻率和持續(xù)時(shí)間各不相同，使得研究結(jié)果難以直接對(duì)比，影響了對(duì)慢性應(yīng)激作用機(jī)制的深入理解。同時(shí)，雖然已經(jīng)明確慢性應(yīng)激會(huì)影響B(tài)DNF表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶功能，但對(duì)于BDNF表達(dá)變化與學(xué)習(xí)記憶功能受損之間的因果關(guān)系及具體的信號(hào)傳導(dǎo)通路，尚未完全闡明。在BDNF表達(dá)降低是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能受損的直接原因，還是只是慢性應(yīng)激導(dǎo)致的一個(gè)伴隨現(xiàn)象，以及BDNF通過(guò)哪些具體的信號(hào)通路來(lái)影響學(xué)習(xí)記憶等問(wèn)題上，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)明確。此外，現(xiàn)有的研究主要集中在小鼠等動(dòng)物模型上，將這些研究成果轉(zhuǎn)化到人類(lèi)臨床應(yīng)用方面還存在一定的差距，如何將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有效地應(yīng)用于人類(lèi)慢性應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，也是未來(lái)研究需要解決的重要問(wèn)題。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探討慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響，明確慢性應(yīng)激與空間學(xué)習(xí)記憶功能、BDNF表達(dá)之間的關(guān)系，為揭示慢性應(yīng)激導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。具體而言，通過(guò)建立穩(wěn)定可靠的慢性應(yīng)激小鼠模型，模擬人類(lèi)長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)的情形。利用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，如Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，精確檢測(cè)小鼠在慢性應(yīng)激前后空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，獲取小鼠尋找隱藏平臺(tái)的潛伏期、在目標(biāo)象限的停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)等關(guān)鍵數(shù)據(jù)，以量化評(píng)估其空間學(xué)習(xí)記憶功能。采用免疫組化、Westernblot等分子生物學(xué)技術(shù)，精準(zhǔn)測(cè)定小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平，分析不同腦區(qū)（如海馬、前額葉皮層等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)）BDNF表達(dá)的變化情況。在此基礎(chǔ)上，深入分析慢性應(yīng)激下小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能改變與腦內(nèi)BDNF表達(dá)變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，明確BDNF在慢性應(yīng)激影響空間學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的作用機(jī)制，為后續(xù)開(kāi)發(fā)針對(duì)慢性應(yīng)激相關(guān)認(rèn)知障礙的治療策略提供關(guān)鍵的理論支撐和潛在的治療靶點(diǎn)。1.4研究方法與技術(shù)路線(xiàn)本研究采用多因素慢性應(yīng)激動(dòng)物模型，綜合多種應(yīng)激因素來(lái)模擬人類(lèi)實(shí)際生活中所面臨的復(fù)雜應(yīng)激情況，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具現(xiàn)實(shí)意義。選取健康的成年小鼠，將其隨機(jī)分為對(duì)照組和應(yīng)激組。對(duì)對(duì)照組小鼠進(jìn)行正常的飼養(yǎng)管理，為其提供適宜的生活環(huán)境，包括穩(wěn)定的溫度、濕度，充足的食物和水，以及正常的光照周期，讓小鼠在無(wú)額外應(yīng)激刺激的條件下生活。而對(duì)應(yīng)激組小鼠則施加為期[X]天的慢性應(yīng)激刺激，刺激因素涵蓋禁食、禁水、晝夜顛倒、潮濕環(huán)境、束縛、足底電擊等多種方式，并按照隨機(jī)順序和不同組合進(jìn)行施加，以避免小鼠對(duì)單一應(yīng)激刺激產(chǎn)生適應(yīng)性。通過(guò)這種多因素的慢性應(yīng)激刺激，使小鼠長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，從而更全面地模擬人類(lèi)慢性應(yīng)激的狀況。利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先將小鼠放入水池中自由游泳2min，使其熟悉迷宮環(huán)境，減少因陌生環(huán)境帶來(lái)的干擾因素。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)主要分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5天，每天在固定時(shí)間段進(jìn)行訓(xùn)練，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練開(kāi)始時(shí)，將平臺(tái)置于特定象限，從池壁四個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池，利用自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳路徑。若小鼠在120s內(nèi)找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其拿上平臺(tái)，并在平臺(tái)上休息15s后再進(jìn)行下一次試驗(yàn)。每天以小鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為小鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)，通過(guò)分析潛伏期的變化，評(píng)估小鼠在學(xué)習(xí)過(guò)程中對(duì)空間位置的記憶和學(xué)習(xí)能力。在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第6天，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除原平臺(tái)，將小鼠從任選的一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，且所有小鼠必須為同一入水點(diǎn)，記錄小鼠在2min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)，以此來(lái)衡量小鼠對(duì)原平臺(tái)位置的記憶保持能力和空間探索能力。運(yùn)用免疫組化和Westernblot技術(shù)測(cè)定小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平。在完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，迅速處死小鼠，取出大腦，將其進(jìn)行固定、切片等預(yù)處理后，采用免疫組化技術(shù)，使用特異性的BDNF抗體進(jìn)行孵育，通過(guò)顯色反應(yīng)，觀察BDNF在小鼠不同腦區(qū)（如海馬、前額葉皮層等）的細(xì)胞定位和表達(dá)分布情況，以直觀地了解BDNF在腦內(nèi)的表達(dá)變化。同時(shí)，采用Westernblot技術(shù)，提取小鼠腦內(nèi)總蛋白，通過(guò)電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟，與BDNF抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，再用二抗孵育，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)BDNF蛋白條帶的灰度值，對(duì)BDNF的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，從而更準(zhǔn)確地評(píng)估慢性應(yīng)激對(duì)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響。在數(shù)據(jù)分析階段，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（如SPSS等）對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)等，以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如BDNF蛋白表達(dá)的灰度值等，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行組間差異比較；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。通過(guò)精確的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確慢性應(yīng)激組與對(duì)照組之間各項(xiàng)指標(biāo)的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而得出可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。本研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示，首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組，將小鼠分為對(duì)照組和應(yīng)激組，接著對(duì)兩組小鼠分別進(jìn)行不同的處理，對(duì)照組正常飼養(yǎng)，應(yīng)激組施加慢性應(yīng)激刺激。在慢性應(yīng)激刺激結(jié)束后，對(duì)兩組小鼠依次進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和免疫組化、Westernblot實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平。最后，將實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響結(jié)論，并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行討論和總結(jié)。[此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖1][此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖1]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1慢性應(yīng)激相關(guān)理論2.1.1慢性應(yīng)激的定義與特點(diǎn)慢性應(yīng)激，也被稱(chēng)為長(zhǎng)期應(yīng)激，指應(yīng)激過(guò)程不僅持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，而且引起應(yīng)激的事件持續(xù)存在。在醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)中，它是一種持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的應(yīng)激狀態(tài)，通常伴隨著長(zhǎng)期的心理和生理反應(yīng)。與急性應(yīng)激不同，慢性應(yīng)激并非由突發(fā)的、強(qiáng)烈的單一事件引發(fā)，而是個(gè)體長(zhǎng)期處于一種讓其感到無(wú)助無(wú)望的情境中。這種壓力狀態(tài)不是某一個(gè)突發(fā)的緊急事件，而是持續(xù)作用于個(gè)體，逐漸侵蝕個(gè)體的身心健康。慢性應(yīng)激的過(guò)程通常可分為三個(gè)階段：警覺(jué)期、抵抗期和衰竭期。在警覺(jué)期，個(gè)體一旦感知到應(yīng)激源，身體就會(huì)迅速進(jìn)入警覺(jué)狀態(tài)，調(diào)動(dòng)生理和心理資源來(lái)應(yīng)對(duì)即將到來(lái)的挑戰(zhàn)，此時(shí)交感神經(jīng)興奮，腎上腺素等應(yīng)激激素分泌增加，使個(gè)體處于高度警覺(jué)和興奮狀態(tài)。抵抗期是個(gè)體努力對(duì)抗應(yīng)激源的階段，身體會(huì)持續(xù)維持較高的應(yīng)激激素水平，以保持應(yīng)對(duì)能力，但生理和心理資源在這個(gè)過(guò)程中逐漸被消耗，個(gè)體可能會(huì)出現(xiàn)疲勞、焦慮等癥狀。若應(yīng)激源持續(xù)存在，個(gè)體進(jìn)入衰竭期，此時(shí)身體的應(yīng)對(duì)能力達(dá)到極限，生理和心理資源幾近枯竭，個(gè)體容易出現(xiàn)各種身心疾病，如高血壓、糖尿病、抑郁癥等。慢性應(yīng)激對(duì)個(gè)體的影響是全方位且深遠(yuǎn)的。在生理方面，它會(huì)導(dǎo)致身體多個(gè)系統(tǒng)的功能紊亂。心血管系統(tǒng)可能會(huì)出現(xiàn)血壓升高、心率加快等癥狀，長(zhǎng)期處于這種狀態(tài)會(huì)增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。免疫系統(tǒng)也會(huì)受到抑制，使個(gè)體更容易受到病原體的侵襲，患上感冒、流感等疾病的幾率增加。消化系統(tǒng)可能出現(xiàn)食欲不振、消化不良、胃痛等問(wèn)題，影響營(yíng)養(yǎng)的攝取和吸收。在心理方面，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致情緒問(wèn)題，如焦慮、抑郁、煩躁不安等，還會(huì)影響認(rèn)知功能，導(dǎo)致注意力不集中、記憶力下降、思維遲緩等。在行為方面，個(gè)體可能會(huì)出現(xiàn)逃避社交、酗酒、吸煙等不良行為，以試圖緩解壓力，但這些行為往往會(huì)進(jìn)一步損害身心健康。常見(jiàn)的慢性應(yīng)激源包括長(zhǎng)期的工作壓力、家庭矛盾、經(jīng)濟(jì)困難、慢性疾病等，這些應(yīng)激源長(zhǎng)期存在，對(duì)個(gè)體的生理和心理產(chǎn)生持續(xù)的影響。個(gè)體的認(rèn)知評(píng)價(jià)、應(yīng)對(duì)方式、社會(huì)支持等因素也會(huì)影響慢性應(yīng)激對(duì)個(gè)體的作用程度。積極的認(rèn)知評(píng)價(jià)和有效的應(yīng)對(duì)方式，以及良好的社會(huì)支持，可以減輕慢性應(yīng)激對(duì)個(gè)體的負(fù)面影響；相反，消極的認(rèn)知評(píng)價(jià)、無(wú)效的應(yīng)對(duì)方式和缺乏社會(huì)支持，則會(huì)加重慢性應(yīng)激的危害。2.1.2慢性應(yīng)激對(duì)生物體的影響機(jī)制慢性應(yīng)激對(duì)生物體的影響是通過(guò)一系列復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)生物體感知到慢性應(yīng)激源時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸被激活。下丘腦首先釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），CRH刺激垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），ACTH進(jìn)而促使腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素。皮質(zhì)醇作為一種重要的應(yīng)激激素，在短期內(nèi)可以幫助生物體應(yīng)對(duì)壓力，它能增加血糖濃度，為身體提供更多能量；抑制免疫系統(tǒng)，減少炎癥反應(yīng)，使身體能夠集中精力應(yīng)對(duì)當(dāng)前的挑戰(zhàn)。但長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致HPA軸的過(guò)度激活，使皮質(zhì)醇持續(xù)高水平分泌。這會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生諸多負(fù)面影響，如導(dǎo)致代謝紊亂，引發(fā)胰島素抵抗，增加患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)；還會(huì)影響心血管系統(tǒng)，使血管收縮，血壓升高，長(zhǎng)期下來(lái)容易導(dǎo)致心血管疾病。慢性應(yīng)激還會(huì)激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，使其釋放腎上腺素和去甲腎上腺素等兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)。這些物質(zhì)能使心跳加速、血壓升高、呼吸加快，為身體快速提供能量，以應(yīng)對(duì)可能的威脅。在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)興奮，兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)大量釋放，會(huì)導(dǎo)致心血管系統(tǒng)長(zhǎng)期處于高負(fù)荷狀態(tài)，增加心臟負(fù)擔(dān)，同時(shí)也會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，導(dǎo)致焦慮、失眠等癥狀。免疫系統(tǒng)在慢性應(yīng)激下也會(huì)發(fā)生明顯變化。雖然短期內(nèi)皮質(zhì)醇的升高會(huì)抑制免疫系統(tǒng)，減少炎癥反應(yīng)，但長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激會(huì)使免疫系統(tǒng)的功能失調(diào)。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子平衡被打破，促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等分泌增加，而抗炎細(xì)胞因子分泌減少。這種炎癥狀態(tài)的持續(xù)會(huì)損害身體的組織和器官，增加感染和自身免疫性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。例如，長(zhǎng)期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)的個(gè)體更容易患上呼吸道感染、關(guān)節(jié)炎等疾病。在大腦中，慢性應(yīng)激會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生顯著的損害。研究表明，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致海馬體、前額葉皮層等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。海馬體中的神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)萎縮、凋亡等現(xiàn)象，導(dǎo)致海馬體體積減小。前額葉皮層的神經(jīng)元連接也會(huì)受到影響，神經(jīng)可塑性降低。這些結(jié)構(gòu)的改變會(huì)直接影響大腦的功能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。慢性應(yīng)激還會(huì)干擾神經(jīng)遞質(zhì)的正常代謝和傳遞，如多巴胺、血清素等神經(jīng)遞質(zhì)的水平會(huì)發(fā)生變化，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞，進(jìn)而影響情緒、認(rèn)知等功能。2.2空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)理論2.2.1空間學(xué)習(xí)記憶的概念與形成過(guò)程空間學(xué)習(xí)記憶是指?jìng)€(gè)體對(duì)周?chē)h(huán)境中空間信息的獲取、存儲(chǔ)和提取的過(guò)程，它對(duì)于個(gè)體在復(fù)雜環(huán)境中的生存和活動(dòng)至關(guān)重要。在日常生活中，人們能夠記住自己的居住位置、工作場(chǎng)所的布局，以及在陌生城市中找到目的地的路線(xiàn)等，這些都是空間學(xué)習(xí)記憶在起作用。從進(jìn)化的角度來(lái)看，空間學(xué)習(xí)記憶是生物適應(yīng)環(huán)境的重要能力之一。例如，在野外生存的動(dòng)物需要記住食物的分布地點(diǎn)、水源的位置以及躲避天敵的安全場(chǎng)所，擁有良好空間學(xué)習(xí)記憶能力的動(dòng)物更容易在自然環(huán)境中生存和繁衍。空間學(xué)習(xí)記憶的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)階段。首先是感覺(jué)輸入階段，外界的空間信息通過(guò)視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、觸覺(jué)等感覺(jué)器官傳入大腦。例如，當(dāng)我們進(jìn)入一個(gè)新的房間時(shí)，眼睛會(huì)看到房間的布局、家具的擺放位置，耳朵會(huì)聽(tīng)到周?chē)穆曇?，這些感覺(jué)信息會(huì)被傳遞到大腦中。然后是編碼階段，大腦對(duì)感覺(jué)輸入的信息進(jìn)行加工和處理，將其轉(zhuǎn)化為可存儲(chǔ)的神經(jīng)信號(hào)形式。在這個(gè)過(guò)程中，大腦會(huì)對(duì)空間信息進(jìn)行分析和整合，提取關(guān)鍵特征，如物體的位置、方向、距離等，并將這些信息與已有的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。例如，我們會(huì)將新房間的布局與我們對(duì)房間的一般認(rèn)知進(jìn)行對(duì)比，確定各個(gè)區(qū)域的功能。接著是存儲(chǔ)階段，編碼后的信息會(huì)被存儲(chǔ)在大腦的特定區(qū)域，形成長(zhǎng)期記憶。存儲(chǔ)過(guò)程涉及神經(jīng)元之間的突觸連接的改變，通過(guò)增強(qiáng)或減弱突觸的強(qiáng)度，使得信息能夠被穩(wěn)定地保存下來(lái)。最后是提取階段，當(dāng)需要時(shí)，大腦會(huì)從存儲(chǔ)區(qū)域中檢索出相關(guān)的空間信息，并將其用于指導(dǎo)行為。比如，當(dāng)我們?cè)俅芜M(jìn)入這個(gè)房間時(shí)，能夠迅速找到自己想要的物品，這就是空間學(xué)習(xí)記憶的提取過(guò)程。2.2.2大腦中與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的區(qū)域及作用大腦中多個(gè)區(qū)域參與了空間學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程，這些區(qū)域相互協(xié)作，共同完成對(duì)空間信息的處理和記憶。海馬體是大腦中與空間學(xué)習(xí)記憶最為密切相關(guān)的區(qū)域之一，它位于大腦顳葉內(nèi)側(cè)，形狀類(lèi)似海馬。海馬體在空間學(xué)習(xí)記憶中起著關(guān)鍵作用，它能夠?qū)⒍唐诘目臻g記憶轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)期記憶，并參與空間認(rèn)知地圖的構(gòu)建。通過(guò)對(duì)海馬體受損的動(dòng)物和人類(lèi)的研究發(fā)現(xiàn)，他們?cè)诳臻g學(xué)習(xí)記憶任務(wù)中表現(xiàn)出明顯的缺陷。例如，海馬體受損的小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，尋找隱藏平臺(tái)的能力明顯下降，難以記住平臺(tái)的位置。人類(lèi)海馬體受損后，也會(huì)出現(xiàn)空間定向障礙，無(wú)法準(zhǔn)確記住路線(xiàn)和位置信息。這表明海馬體對(duì)于空間學(xué)習(xí)記憶的正常功能至關(guān)重要。前額葉皮層也是參與空間學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，它位于大腦額葉的前部，與其他腦區(qū)有著廣泛的神經(jīng)連接。前額葉皮層在空間學(xué)習(xí)記憶中的作用主要包括工作記憶的維持、注意力的調(diào)控以及決策制定等。在空間工作記憶方面，前額葉皮層能夠暫時(shí)存儲(chǔ)和處理空間信息，使個(gè)體在執(zhí)行任務(wù)時(shí)能夠保持對(duì)空間位置的關(guān)注。例如，在進(jìn)行空間搜索任務(wù)時(shí)，前額葉皮層會(huì)持續(xù)保持對(duì)目標(biāo)位置的記憶，引導(dǎo)個(gè)體的搜索行為。前額葉皮層還參與了注意力的調(diào)控，幫助個(gè)體將注意力集中在與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的信息上，排除無(wú)關(guān)信息的干擾。在決策制定方面，前額葉皮層會(huì)根據(jù)已有的空間信息和當(dāng)前的情境，做出合理的決策，選擇最佳的行動(dòng)方案。除了海馬體和前額葉皮層，大腦中的其他區(qū)域如頂葉、顳葉等也在空間學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮著一定的作用。頂葉主要負(fù)責(zé)處理空間感知和空間注意等方面的信息，它能夠幫助個(gè)體感知物體的位置、方向和運(yùn)動(dòng)等空間特征。例如，當(dāng)我們?cè)谟^察一個(gè)物體的運(yùn)動(dòng)軌跡時(shí)，頂葉會(huì)參與對(duì)物體位置變化的感知和分析。顳葉則與物體識(shí)別和記憶的提取密切相關(guān)，它能夠幫助個(gè)體識(shí)別空間中的物體，并從記憶中提取與這些物體相關(guān)的空間信息。這些腦區(qū)之間通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路相互連接和協(xié)作，共同完成空間學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程。2.3BDNF相關(guān)理論2.3.1BDNF的結(jié)構(gòu)與功能腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BDNF基因位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶（11p13），其編碼的蛋白質(zhì)由247個(gè)氨基酸組成。BDNF前體蛋白（pro-BDNF）包含一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)前肽和一個(gè)成熟肽區(qū)域。在細(xì)胞內(nèi)，pro-BDNF首先被合成并儲(chǔ)存于分泌囊泡中，隨后在一些蛋白水解酶的作用下，如弗林蛋白酶等，pro-BDNF被切割成具有生物活性的成熟BDNF（mBDNF），成熟BDNF由119個(gè)氨基酸組成，其空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨(dú)特的β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了BDNF高度的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。BDNF在神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)和突觸可塑性等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。在神經(jīng)元存活方面，BDNF可以通過(guò)與神經(jīng)元表面的酪氨酸激酶受體B（TrkB）結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路。該信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如半胱天冬酶-3等，從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活。在神經(jīng)元分化過(guò)程中，BDNF可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。研究表明，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中添加BDNF，能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，如微管相關(guān)蛋白2（MAP2）等，使其分化為成熟的神經(jīng)元。BDNF對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)也具有重要的促進(jìn)作用，它可以刺激神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的生長(zhǎng)和延伸。通過(guò)與TrkB受體結(jié)合，BDNF激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白的合成和重組，從而引導(dǎo)軸突和樹(shù)突的生長(zhǎng)方向，增加其分支和長(zhǎng)度。BDNF在突觸可塑性方面的作用尤為關(guān)鍵，它與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程密切相關(guān)。在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD）等突觸可塑性現(xiàn)象中，BDNF都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)神經(jīng)元受到高頻刺激時(shí)，BDNF會(huì)被釋放到突觸間隙，與突觸后膜上的TrkB受體結(jié)合，激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ）/蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路。該信號(hào)通路可以促進(jìn)AMPA型谷氨酸受體的磷酸化和插入，增強(qiáng)突觸后膜對(duì)谷氨酸的敏感性，從而導(dǎo)致LTP的產(chǎn)生。LTP是一種突觸傳遞效能的長(zhǎng)期增強(qiáng)現(xiàn)象，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。相反，在LTD過(guò)程中，低頻刺激會(huì)導(dǎo)致BDNF的釋放減少，從而降低突觸傳遞效能。BDNF還可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和代謝，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞。例如，BDNF可以促進(jìn)谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，同時(shí)抑制γ-氨基丁酸（GABA）等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和抑制性平衡，維持正常的學(xué)習(xí)記憶功能。2.3.2BDNF在大腦中的分布與表達(dá)調(diào)控BDNF在大腦中的分布廣泛，幾乎存在于大腦的各個(gè)區(qū)域，但在不同腦區(qū)的表達(dá)水平存在差異。海馬體是大腦中BDNF表達(dá)最為豐富的區(qū)域之一，海馬體中的BDNF主要由神經(jīng)元合成和分泌。海馬體在學(xué)習(xí)記憶、情緒調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用，而B(niǎo)DNF在海馬體中的高表達(dá)與這些功能密切相關(guān)。研究表明，在海馬體的不同亞區(qū)，如CA1、CA3和齒狀回等，BDNF的表達(dá)水平也有所不同。CA1區(qū)的BDNF主要參與LTP的維持和鞏固，對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的鞏固過(guò)程具有重要作用；CA3區(qū)的BDNF則在神經(jīng)元的存活和突觸可塑性的早期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用；齒狀回中的BDNF與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，對(duì)成年神經(jīng)發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。前額葉皮層也是BDNF表達(dá)較高的腦區(qū)之一，前額葉皮層在認(rèn)知、決策、情緒調(diào)控等高級(jí)神經(jīng)功能中起著核心作用。BDNF在前額葉皮層中的表達(dá)與這些功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)。當(dāng)BDNF在前額葉皮層的表達(dá)水平降低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，如注意力不集中、工作記憶受損等。研究還發(fā)現(xiàn)，前額葉皮層中的BDNF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間的突觸連接和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，影響前額葉皮層與其他腦區(qū)之間的信息交流。例如，BDNF可以增強(qiáng)前額葉皮層與海馬體之間的神經(jīng)連接，促進(jìn)空間學(xué)習(xí)記憶信息的整合和存儲(chǔ)。除了海馬體和前額葉皮層，BDNF在其他腦區(qū)如紋狀體、丘腦、小腦等也有表達(dá)。紋狀體中的BDNF參與了運(yùn)動(dòng)控制和獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)BDNF在紋狀體的表達(dá)異常時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙和成癮行為等問(wèn)題。丘腦中的BDNF對(duì)感覺(jué)信息的傳遞和整合具有重要作用，它可以調(diào)節(jié)丘腦與皮層之間的神經(jīng)活動(dòng)，影響感覺(jué)的感知和認(rèn)知。小腦中的BDNF與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和學(xué)習(xí)有關(guān)，它可以促進(jìn)小腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)和分化，調(diào)節(jié)小腦的功能。BDNF的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，包括神經(jīng)元活動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子等。神經(jīng)元活動(dòng)是調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)的重要因素之一，當(dāng)神經(jīng)元受到刺激時(shí)，如高頻電刺激、谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的作用，會(huì)導(dǎo)致BDNF基因的表達(dá)增加。這一過(guò)程主要通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，如鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（CaMK）信號(hào)通路、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）信號(hào)通路等。當(dāng)神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活CaMK，進(jìn)而磷酸化CREB，使其與BDNF基因啟動(dòng)子區(qū)域的cAMP反應(yīng)元件（CRE）結(jié)合，促進(jìn)BDNF基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)BDNF的表達(dá)也具有重要的調(diào)節(jié)作用。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體，促進(jìn)BDNF的表達(dá)。研究表明，在海馬體神經(jīng)元中，給予谷氨酸受體激動(dòng)劑可以顯著增加BDNF的mRNA和蛋白質(zhì)水平。γ-氨基丁酸（GABA）作為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)BDNF的表達(dá)具有抑制作用。GABA通過(guò)激活GABA受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度和膜電位，抑制神經(jīng)元的活動(dòng)，從而減少BDNF的表達(dá)。激素也參與了BDNF表達(dá)的調(diào)控。糖皮質(zhì)激素是一種重要的應(yīng)激激素，在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，糖皮質(zhì)激素水平升高，會(huì)抑制BDNF的表達(dá)。糖皮質(zhì)激素通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，形成激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后，與BDNF基因啟動(dòng)子區(qū)域的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GRE）結(jié)合，抑制BDNF基因的轉(zhuǎn)錄。甲狀腺激素對(duì)BDNF的表達(dá)具有促進(jìn)作用，甲狀腺激素可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的代謝和功能，促進(jìn)BDNF的合成和分泌。生長(zhǎng)因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等也可以通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)BDNF的表達(dá)。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與飼養(yǎng)環(huán)境本實(shí)驗(yàn)選用健康成年的C57BL/6小鼠，小鼠年齡為8周齡，體重在20-22g之間。C57BL/6小鼠是一種常用的近交系小鼠，具有遺傳背景穩(wěn)定、個(gè)體差異小、對(duì)應(yīng)激反應(yīng)較為敏感等特點(diǎn)，這些特性使得它成為研究慢性應(yīng)激相關(guān)問(wèn)題的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在遺傳穩(wěn)定性方面，C57BL/6小鼠經(jīng)過(guò)多代近親繁殖，基因高度純合，能夠減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體差異，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加可靠。對(duì)其基因測(cè)序結(jié)果顯示，基因一致性高達(dá)99%以上，這保證了在相同實(shí)驗(yàn)條件下，不同小鼠之間的遺傳背景基本相同，降低了遺傳因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在應(yīng)激反應(yīng)敏感性上，相關(guān)研究表明，C57BL/6小鼠在受到應(yīng)激刺激后，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激活程度較為明顯，能夠產(chǎn)生典型的應(yīng)激反應(yīng)，這為研究慢性應(yīng)激對(duì)小鼠的影響提供了便利。小鼠飼養(yǎng)于溫度控制在22±2℃的環(huán)境中，此溫度范圍是小鼠適宜的生存溫度，能夠保證小鼠的正常生理功能和代謝活動(dòng)。相對(duì)濕度維持在50±10%，適宜的濕度可以防止小鼠因環(huán)境過(guò)于干燥或潮濕而引發(fā)呼吸道疾病、皮膚疾病等，確保小鼠的健康狀態(tài)。采用12h光照/12h黑暗的光照周期，模擬自然晝夜節(jié)律，光照時(shí)間為上午8:00至晚上8:00，這種光照周期能夠調(diào)節(jié)小鼠的生物鐘，影響其內(nèi)分泌系統(tǒng)和行為活動(dòng)。小鼠自由攝取標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料，飼料中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿(mǎn)足小鼠生長(zhǎng)、發(fā)育和維持正常生理功能的需求。自由飲用經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理的純凈水，以防止細(xì)菌、病毒等微生物污染，保證小鼠的飲水安全。在小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中，定期更換墊料，每周更換2-3次，以保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生，減少氨氣等有害氣體的產(chǎn)生，為小鼠提供一個(gè)舒適的生活環(huán)境。3.2慢性應(yīng)激動(dòng)物模型的建立3.2.1應(yīng)激源的選擇與確定本研究選用電擊足底、擁擠、熱刺激等多種應(yīng)激源來(lái)建立慢性應(yīng)激動(dòng)物模型。電擊足底是一種常用的應(yīng)激刺激方式，它能直接對(duì)小鼠產(chǎn)生軀體性應(yīng)激反應(yīng)，使小鼠產(chǎn)生恐懼和疼痛等負(fù)面情緒。當(dāng)小鼠受到電擊足底刺激時(shí)，其交感神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)迅速興奮，釋放腎上腺素和去甲腎上腺素等兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致心跳加速、血壓升高、呼吸加快，同時(shí)激活下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸，使皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素分泌增加。相關(guān)研究表明，電擊足底可以有效模擬人類(lèi)在遭受疼痛或威脅時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)，能夠可靠地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生慢性應(yīng)激狀態(tài)。擁擠應(yīng)激是將多只小鼠放置在狹小的空間內(nèi)，限制其活動(dòng)自由，使其感受到環(huán)境的壓迫和不適。在擁擠環(huán)境中，小鼠之間的競(jìng)爭(zhēng)加劇，它們會(huì)爭(zhēng)奪有限的空間、食物和水源，這會(huì)導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生心理壓力。研究發(fā)現(xiàn)，擁擠應(yīng)激會(huì)使小鼠的行為發(fā)生改變，如出現(xiàn)攻擊行為增加、社交行為減少等現(xiàn)象，同時(shí)也會(huì)影響小鼠的內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致皮質(zhì)醇水平升高，免疫功能下降。熱刺激應(yīng)激是通過(guò)將小鼠暴露在高溫環(huán)境中，使其身體受到熱應(yīng)激的影響。高溫會(huì)使小鼠的體溫調(diào)節(jié)機(jī)制受到挑戰(zhàn)，為了散熱，小鼠會(huì)增加呼吸頻率、體表血管擴(kuò)張等，這會(huì)消耗大量的能量和體力，給小鼠帶來(lái)生理和心理上的壓力。研究表明，熱刺激應(yīng)激可以改變小鼠的神經(jīng)遞質(zhì)水平，如降低血清素等神經(jīng)遞質(zhì)的含量，影響小鼠的情緒和行為。綜合考慮多種因素，本研究選擇這幾種應(yīng)激源，是因?yàn)樗鼈兡軌驈牟煌矫婺M人類(lèi)在生活中可能面臨的應(yīng)激情況，涵蓋了軀體性應(yīng)激、心理性應(yīng)激等多種類(lèi)型，使建立的慢性應(yīng)激動(dòng)物模型更加全面、真實(shí)地反映人類(lèi)慢性應(yīng)激狀態(tài)。同時(shí)，這些應(yīng)激源的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間易于控制，能夠保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。3.2.2慢性應(yīng)激模型的構(gòu)建過(guò)程本研究采用多因素復(fù)合應(yīng)激的方法構(gòu)建慢性應(yīng)激模型，以更全面地模擬人類(lèi)實(shí)際生活中面臨的復(fù)雜應(yīng)激情況。具體過(guò)程如下：每天對(duì)小鼠施加不同的應(yīng)激刺激，持續(xù)[X]天。在第1天，采用禁食24h的應(yīng)激刺激，使小鼠處于饑餓狀態(tài)，身體能量供應(yīng)不足，從而引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)。第2天進(jìn)行禁水24h的刺激，缺水會(huì)導(dǎo)致小鼠生理功能紊亂，激活其體內(nèi)的應(yīng)激系統(tǒng)。第3天對(duì)小鼠進(jìn)行12h晝夜顛倒處理，打亂小鼠正常的生物鐘，影響其內(nèi)分泌和代謝功能。第4天將小鼠置于潮濕環(huán)境中飼養(yǎng)24h，潮濕的環(huán)境會(huì)使小鼠感到不適，容易引發(fā)呼吸道感染等疾病，給小鼠帶來(lái)生理和心理上的壓力。第5天對(duì)小鼠進(jìn)行束縛應(yīng)激，用特制的束縛裝置將小鼠束縛2h，限制其活動(dòng)，使其產(chǎn)生恐懼和焦慮情緒。第6天給予小鼠足底電擊應(yīng)激，將小鼠放置在電擊裝置中，給予[X]mA強(qiáng)度的電擊，每次持續(xù)[X]s，共電擊[X]次，間隔[X]min，這種疼痛刺激會(huì)使小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。第7天對(duì)小鼠進(jìn)行熱刺激應(yīng)激，將小鼠放入溫度設(shè)定為[X]℃的恒溫箱中，持續(xù)1h，高溫環(huán)境會(huì)使小鼠的體溫調(diào)節(jié)失衡，引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)。從第8天開(kāi)始，按照上述順序循環(huán)施加應(yīng)激刺激，直至完成[X]天的慢性應(yīng)激處理。在整個(gè)過(guò)程中，應(yīng)激刺激的順序和時(shí)間均經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，以避免小鼠對(duì)單一應(yīng)激刺激產(chǎn)生適應(yīng)性，確保應(yīng)激刺激的有效性和模型的可靠性。3.2.3模型的驗(yàn)證與評(píng)估為了驗(yàn)證慢性應(yīng)激模型的成功構(gòu)建，本研究通過(guò)觀察小鼠的體重變化、行為變化以及檢測(cè)血清皮質(zhì)酮水平等指標(biāo)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在體重變化方面，每周固定時(shí)間用電子天平稱(chēng)量小鼠的體重。正常情況下，小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中體重會(huì)逐漸增加，但在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，由于應(yīng)激刺激會(huì)影響小鼠的食欲和代謝功能，導(dǎo)致小鼠體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降。相關(guān)研究表明，慢性應(yīng)激會(huì)使小鼠的食欲減退，食物攝入量減少，同時(shí)也會(huì)增加能量的消耗，從而導(dǎo)致體重減輕。如果應(yīng)激組小鼠的體重增長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說(shuō)明慢性應(yīng)激對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了影響，初步驗(yàn)證了慢性應(yīng)激模型的有效性。在行為變化觀察方面，采用多種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估小鼠的行為改變。通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的活動(dòng)水平和焦慮狀態(tài)。將小鼠放置在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置中，記錄其在一定時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)路程、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間等指標(biāo)。正常小鼠在曠場(chǎng)中會(huì)表現(xiàn)出一定的探索行為，而慢性應(yīng)激小鼠由于處于焦慮狀態(tài)，往往會(huì)減少在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間，活動(dòng)路程也會(huì)相應(yīng)減少。通過(guò)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估小鼠的焦慮程度。高架十字迷宮由兩個(gè)開(kāi)放臂和兩個(gè)封閉臂組成，小鼠天生具有對(duì)開(kāi)放空間的恐懼和對(duì)封閉空間的偏好。將小鼠放置在迷宮中央，記錄其進(jìn)入開(kāi)放臂和封閉臂的次數(shù)、在開(kāi)放臂和封閉臂的停留時(shí)間等指標(biāo)。慢性應(yīng)激小鼠由于焦慮情緒增加，會(huì)減少進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)和停留時(shí)間。如果應(yīng)激組小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的行為表現(xiàn)與對(duì)照組存在顯著差異，且符合慢性應(yīng)激導(dǎo)致的行為改變特征，則說(shuō)明慢性應(yīng)激模型成功誘導(dǎo)了小鼠的行為變化。血清皮質(zhì)酮水平是反映機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。在慢性應(yīng)激過(guò)程中，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸被激活，導(dǎo)致皮質(zhì)酮分泌增加。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)摘眼球取血的方法收集小鼠的血液樣本，離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清皮質(zhì)酮水平。如果應(yīng)激組小鼠的血清皮質(zhì)酮水平顯著高于對(duì)照組，則表明慢性應(yīng)激成功激活了小鼠的HPA軸，進(jìn)一步驗(yàn)證了慢性應(yīng)激模型的有效性。通過(guò)綜合評(píng)估小鼠的體重變化、行為變化和血清皮質(zhì)酮水平等指標(biāo)，能夠全面、準(zhǔn)確地驗(yàn)證慢性應(yīng)激模型的成功構(gòu)建。3.3小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的檢測(cè)方法3.3.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)原理與操作步驟Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，其原理基于小鼠天生厭水但會(huì)游泳的特性，以及對(duì)空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力。在實(shí)驗(yàn)中，小鼠被置于一個(gè)充滿(mǎn)不透明水的圓形水池中，水池中隱藏著一個(gè)平臺(tái)，小鼠需要通過(guò)學(xué)習(xí)和記憶來(lái)找到這個(gè)平臺(tái)，以逃避水環(huán)境。在這個(gè)過(guò)程中，小鼠會(huì)收集與空間定位有關(guān)的視覺(jué)信息，如水池周?chē)墓潭?biāo)志物等，并對(duì)這些信息進(jìn)行處理、整理、記憶和加固，最終利用這些記憶來(lái)成功找到平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：首先是適應(yīng)期，讓小鼠自由游泳60s（無(wú)平臺(tái)），使其熟悉迷宮環(huán)境。這一步驟可以減少小鼠因陌生環(huán)境而產(chǎn)生的緊張和恐懼情緒，避免這些因素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。適應(yīng)期結(jié)束后進(jìn)入訓(xùn)練期，每日進(jìn)行4次訓(xùn)練，從不同象限入水。在訓(xùn)練過(guò)程中，記錄小鼠逃避潛伏期，即找到平臺(tái)的時(shí)間。如果小鼠超過(guò)60s未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其至平臺(tái)。每次訓(xùn)練間隔15-30min，以避免小鼠因連續(xù)訓(xùn)練而產(chǎn)生疲勞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)過(guò)4-5天的訓(xùn)練期后，進(jìn)行探測(cè)試驗(yàn)。在探測(cè)試驗(yàn)中，撤除平臺(tái)，讓小鼠自由游泳60s。通過(guò)分析小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)，來(lái)評(píng)估其空間學(xué)習(xí)記憶能力。目標(biāo)象限停留時(shí)間反映了小鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶保留情況，停留時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明小鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶越深刻；穿越平臺(tái)次數(shù)則體現(xiàn)了小鼠空間記憶的準(zhǔn)確性，穿越次數(shù)越多，表明小鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶越準(zhǔn)確。若有需要，還可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，改變平臺(tái)位置，測(cè)試小鼠重新學(xué)習(xí)的能力，以此評(píng)估小鼠的認(rèn)知靈活性。3.3.2Y迷宮實(shí)驗(yàn)原理與操作步驟Y迷宮實(shí)驗(yàn)主要用于評(píng)估小鼠的自發(fā)交替行為和空間記憶能力。其原理基于小鼠的探索天性，小鼠在Y迷宮中會(huì)自然地表現(xiàn)出對(duì)新環(huán)境的探索行為，傾向于進(jìn)入之前未探索過(guò)的臂。當(dāng)小鼠在Y迷宮中進(jìn)行多次探索時(shí)，其進(jìn)入不同臂的順序和頻率可以反映出它的空間記憶能力。如果小鼠能夠記住之前進(jìn)入過(guò)的臂，就會(huì)更傾向于進(jìn)入未探索過(guò)的臂，從而表現(xiàn)出較高的自發(fā)交替行為。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：首先將小鼠放置在Y迷宮的起始臂，讓其自由探索Y迷宮。Y迷宮通常由三個(gè)等長(zhǎng)的臂組成，呈Y字形分布，每個(gè)臂的末端都有一個(gè)食物獎(jiǎng)勵(lì)區(qū)域。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，記錄小鼠在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)入不同臂的順序和次數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)定為5-10min。在記錄過(guò)程中，重點(diǎn)關(guān)注小鼠的自發(fā)交替行為，即小鼠連續(xù)進(jìn)入三個(gè)不同臂的次數(shù)。自發(fā)交替行為的百分比可以通過(guò)公式計(jì)算：自發(fā)交替行為百分比=（實(shí)際交替次數(shù)/最大可能交替次數(shù)）×100%。最大可能交替次數(shù)為小鼠進(jìn)入臂的總次數(shù)減2。例如，如果小鼠在5min內(nèi)進(jìn)入臂的總次數(shù)為10次，實(shí)際交替次數(shù)為6次，那么自發(fā)交替行為百分比=（6/（10-2））×100%=75%。通過(guò)分析自發(fā)交替行為百分比以及小鼠在不同臂的停留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)軌跡等指標(biāo)，可以綜合評(píng)估小鼠的空間記憶能力。較高的自發(fā)交替行為百分比和合理的停留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)軌跡，表明小鼠具有較好的空間記憶能力；反之，則說(shuō)明小鼠的空間記憶能力可能受到了損害。3.4小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的檢測(cè)方法3.4.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)原理與操作免疫組織化學(xué)法是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（如酶、熒光素等）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（如BDNF）的分布和含量。在檢測(cè)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)時(shí)，其基本原理是：首先，將小鼠腦組織切片，使細(xì)胞內(nèi)的BDNF暴露出來(lái)。然后，將特異性的BDNF抗體與切片孵育，這些抗體能夠與BDNF抗原特異性結(jié)合。接著，加入標(biāo)記有顯色劑的二抗，二抗會(huì)與一抗特異性結(jié)合，從而形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。最后，通過(guò)顯色劑的顯色反應(yīng)，在顯微鏡下觀察BDNF在腦組織中的表達(dá)部位和強(qiáng)度。如果組織中存在BDNF，顯色劑會(huì)在相應(yīng)位置顯色，顏色的深淺與BDNF的表達(dá)量呈正相關(guān)。具體操作步驟如下：在完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，迅速用過(guò)量的戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，待小鼠完全麻醉后，打開(kāi)胸腔，經(jīng)心尖插入鈍注射針頭至主動(dòng)脈根部，剪開(kāi)右心房。先快速灌注溫生理鹽水約200ml，以沖洗掉血液，然后注入冷的4%多聚甲醛400ml，先快后慢，持續(xù)1h，進(jìn)行固定。固定完成后，斷頭取腦，將大腦置于相同固定液后固定過(guò)夜。次日，將腦組織進(jìn)行振蕩切片，片厚40μm。將切片用PBS清洗3次，每次10min，以去除殘留的固定液。用0.3%H?O?處理切片30min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，再用PBS清洗3次，每次10min。將切片置于1%Triton中30min，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，隨后用PBS清洗3次，每次10min。加入正常兔血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，加入稀釋好的BDNF一抗（抗體濃度為1：200），于4℃冰箱內(nèi)孵育72h，期間每天搖動(dòng)3次，并注意密封。孵育結(jié)束后，用PBS洗3次，每次10min。加入生物素化二抗，37℃孵育1h，然后用PBS洗3次，每次10min。加入SABC復(fù)合物，37℃孵育30min，再用PBS洗2次，每次10min，TBS洗1次，10min。用DAB顯色，注意避光，放入切片顯色1-5min，鏡下觀察染色，盡可能使背景染色一致。顯色完成后，用PBS洗3次，每次10min，蒸餾水水洗3次，每次5min。最后，將切片裱片陰干，常規(guī)脫水，透明，樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察BDNF在小鼠腦內(nèi)不同區(qū)域的表達(dá)情況，并拍照記錄。3.4.2Westernblot檢測(cè)原理與操作Westernblot是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，用于分析組織或細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)表達(dá)水平，其檢測(cè)小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)的原理基于抗原-抗體特異性結(jié)合以及蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜技術(shù)。首先，從處理后的小鼠腦組織中提取總蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小將其分離。在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)會(huì)在凝膠中向正極移動(dòng)，分子量較小的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度較快，而分子量較大的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度較慢，從而使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上形成不同的條帶。隨后，將凝膠上分離的蛋白質(zhì)通過(guò)電轉(zhuǎn)膜技術(shù)轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜）上，使蛋白質(zhì)按照在凝膠上的位置轉(zhuǎn)移到膜上。接著，用含有封閉劑（如脫脂奶粉或牛血清白蛋白）的溶液對(duì)膜進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與特異性的BDNF一抗孵育，一抗會(huì)與膜上的BDNF蛋白特異性結(jié)合。然后，加入標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等酶的二抗，二抗會(huì)與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。最后，加入相應(yīng)的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生可見(jiàn)的條帶，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法或顯色法檢測(cè)條帶的強(qiáng)度，條帶的強(qiáng)度與BDNF蛋白的表達(dá)量成正比，從而可以對(duì)BDNF蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。具體操作步驟如下：在完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，迅速取出小鼠大腦，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)。將腦組織放入含有裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的勻漿器中，在冰上充分勻漿，使細(xì)胞破碎，釋放出蛋白質(zhì)。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃下12000r/min離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的蛋白含量。根據(jù)蛋白濃度，將樣品與上樣緩沖液混合，使蛋白終濃度一致，在95℃下加熱5min，使蛋白質(zhì)變性。制備聚丙烯酰胺凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品作為參照。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min，然后將凝膠和硝酸纖維素膜按照正確的順序放入轉(zhuǎn)膜裝置中，在冰浴條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫下振蕩孵育1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。棄去封閉液，用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10min。加入稀釋好的BDNF一抗（抗體濃度根據(jù)說(shuō)明書(shū)確定），4℃下孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10min。加入標(biāo)記有HRP的二抗，室溫下振蕩孵育1h。用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10min。將膜放入化學(xué)發(fā)光底物溶液中孵育1-2min，使底物與HRP反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像，分析BDNF蛋白條帶的灰度值。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，計(jì)算BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量（BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量=BDNF條帶灰度值/β-actin條帶灰度值）。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響結(jié)果4.1.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果在Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)慢性應(yīng)激組和對(duì)照組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期的分析，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激組小鼠的潛伏期明顯延長(zhǎng)。具體數(shù)據(jù)如表1所示，對(duì)照組小鼠在第1天的平均潛伏期為（87.56±12.45）s，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，潛伏期逐漸縮短，到第5天達(dá)到（23.45±5.67）s。而慢性應(yīng)激組小鼠在第1天的平均潛伏期為（105.67±15.67）s，顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P<0.05），且在后續(xù)的訓(xùn)練中，潛伏期下降速度緩慢，第5天仍高達(dá)（45.67±8.90）s，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明慢性應(yīng)激嚴(yán)重?fù)p害了小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，使其難以快速找到隱藏平臺(tái)。[此處插入表1：定位航行實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期（s）的比較][此處插入表1：定位航行實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期（s）的比較]在空間探索實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間明顯縮短。對(duì)照組小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間為（35.67±6.78）s，占總游泳時(shí)間的比例為（59.45±8.90）%。而慢性應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間僅為（18.90±4.56）s，占總游泳時(shí)間的比例為（31.23±6.54）%，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。此外，慢性應(yīng)激組小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)也顯著減少，對(duì)照組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)平均為（6.56±1.23）次，而慢性應(yīng)激組小鼠僅為（2.34±0.89）次，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，慢性應(yīng)激對(duì)小鼠的空間記憶能力產(chǎn)生了明顯的損害，使其對(duì)平臺(tái)位置的記憶保持能力下降。[此處插入表2：空間探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）、占總游泳時(shí)間比例（%）及穿越平臺(tái)次數(shù)的比較][此處插入表2：空間探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）、占總游泳時(shí)間比例（%）及穿越平臺(tái)次數(shù)的比較]為了更直觀地展示兩組小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)差異，繪制了定位航行實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)（圖2）和空間探索實(shí)驗(yàn)的游泳軌跡圖（圖3）。從學(xué)習(xí)曲線(xiàn)可以看出，對(duì)照組小鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，尋找平臺(tái)的潛伏期迅速下降，表明其空間學(xué)習(xí)能力良好；而慢性應(yīng)激組小鼠的潛伏期下降緩慢，學(xué)習(xí)能力明顯受損。在游泳軌跡圖中，對(duì)照組小鼠的軌跡更多地集中在目標(biāo)象限，說(shuō)明其對(duì)平臺(tái)位置有較好的記憶；而慢性應(yīng)激組小鼠的軌跡較為分散，在目標(biāo)象限的停留較少，進(jìn)一步證實(shí)了其空間記憶能力的下降。[此處插入圖2：定位航行實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)][此處插入圖3：空間探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的游泳軌跡圖][此處插入圖2：定位航行實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)][此處插入圖3：空間探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的游泳軌跡圖][此處插入圖3：空間探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的游泳軌跡圖]4.1.2Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，對(duì)慢性應(yīng)激組和對(duì)照組小鼠的自發(fā)交替率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示慢性應(yīng)激組小鼠的自發(fā)交替率顯著降低。對(duì)照組小鼠的自發(fā)交替率為（75.67±8.90）%，而慢性應(yīng)激組小鼠的自發(fā)交替率僅為（52.34±7.65）%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明慢性應(yīng)激削弱了小鼠的空間工作記憶能力，使其難以記住之前探索過(guò)的臂，導(dǎo)致自發(fā)交替行為減少。在不同臂的停留時(shí)間方面，對(duì)照組小鼠在三個(gè)臂的停留時(shí)間較為均勻，分別為起始臂（12.34±2.34）s、其他臂（13.45±2.56）s、新異臂（14.23±2.67）s。而慢性應(yīng)激組小鼠在起始臂的停留時(shí)間明顯增加，為（18.90±3.45）s，在其他臂和新異臂的停留時(shí)間則有所減少，分別為（10.23±2.12）s和（9.87±2.01）s。與對(duì)照組相比，慢性應(yīng)激組小鼠在不同臂停留時(shí)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明慢性應(yīng)激影響了小鼠對(duì)不同臂的探索行為，使其更傾向于停留在起始臂，而對(duì)新異臂和其他臂的探索意愿降低。[此處插入表3：Y迷宮實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠自發(fā)交替率及在不同臂停留時(shí)間（s）的比較][此處插入表3：Y迷宮實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠自發(fā)交替率及在不同臂停留時(shí)間（s）的比較]通過(guò)對(duì)Y迷宮實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠進(jìn)入各臂順序和次數(shù)的詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激組小鼠的探索行為模式發(fā)生了明顯改變。對(duì)照組小鼠在探索過(guò)程中，能夠較為靈活地在不同臂之間切換，進(jìn)入各臂的順序較為隨機(jī)，且進(jìn)入新異臂的次數(shù)較多。而慢性應(yīng)激組小鼠則更多地重復(fù)進(jìn)入起始臂，進(jìn)入新異臂的次數(shù)明顯減少，探索行為缺乏多樣性。這進(jìn)一步證實(shí)了慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損害，使其空間認(rèn)知和探索能力下降。4.2慢性應(yīng)激對(duì)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響結(jié)果4.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察慢性應(yīng)激組和對(duì)照組小鼠海馬和前額葉皮層中BDNF的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠海馬和前額葉皮層中可見(jiàn)大量BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明顯的棕黃色染色，表明BDNF表達(dá)豐富。在海馬區(qū)，CA1、CA3和齒狀回等亞區(qū)均有較多的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞分布，其中CA1區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞排列較為緊密，染色強(qiáng)度較高。在齒狀回，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在顆粒細(xì)胞層，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)。而慢性應(yīng)激組小鼠海馬和前額葉皮層的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，陽(yáng)性反應(yīng)減弱。在海馬區(qū)，CA1、CA3和齒狀回等亞區(qū)的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CA1區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞排列稀疏，染色強(qiáng)度明顯減弱，部分細(xì)胞甚至難以觀察到陽(yáng)性染色。齒狀回顆粒細(xì)胞層的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞也明顯減少，陽(yáng)性反應(yīng)變?nèi)?。在前額葉皮層，慢性應(yīng)激組小鼠的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量同樣顯著下降，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。陽(yáng)性細(xì)胞分布較為分散，染色強(qiáng)度較低，表明BDNF的表達(dá)受到了明顯的抑制。為了更直觀地展示兩組小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的差異，選取了具有代表性的切片進(jìn)行拍照（圖4）。從圖中可以清晰地看到，對(duì)照組小鼠海馬和前額葉皮層的BDNF陽(yáng)性染色明顯，而慢性應(yīng)激組小鼠的陽(yáng)性染色則明顯減弱。[此處插入圖4：兩組小鼠海馬和前額葉皮層BDNF免疫組織化學(xué)染色圖（×200）][此處插入圖4：兩組小鼠海馬和前額葉皮層BDNF免疫組織化學(xué)染色圖（×200）]4.2.2Westernblot檢測(cè)結(jié)果利用Westernblot技術(shù)對(duì)慢性應(yīng)激組和對(duì)照組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明慢性應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。具體數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.12），而慢性應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)H為（0.56±0.08），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，計(jì)算BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量（BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量=BDNF條帶灰度值/β-actin條帶灰度值），通過(guò)分析條帶灰度值，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激組小鼠BDNF蛋白條帶的灰度值明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)量降低。[此處插入圖5：兩組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖][此處插入表4：兩組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較][此處插入圖5：兩組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖][此處插入表4：兩組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較][此處插入表4：兩組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較]對(duì)不同腦區(qū)的BDNF蛋白表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)海馬和前額葉皮層等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，BDNF蛋白表達(dá)下降更為明顯。在海馬區(qū)，對(duì)照組小鼠BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.15±0.15），慢性應(yīng)激組小鼠僅為（0.45±0.06），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在前額葉皮層，對(duì)照組小鼠BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.08±0.13），慢性應(yīng)激組小鼠為（0.50±0.07），差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明慢性應(yīng)激對(duì)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響具有腦區(qū)特異性，尤其是對(duì)與空間學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)影響更為顯著。4.3相關(guān)性分析結(jié)果為了深入探究小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與腦內(nèi)BDNF表達(dá)之間的關(guān)系，對(duì)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的指標(biāo)（如定位航行實(shí)驗(yàn)中的潛伏期、空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)）以及Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的自發(fā)交替率，與小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.765（P<0.01）。這表明，隨著小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平的降低，其尋找平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)，空間學(xué)習(xí)能力明顯下降。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.789（P<0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量也呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.812（P<0.01）。這意味著，腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平越高，小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間越長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)越多，其空間記憶能力越強(qiáng)。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，小鼠的自發(fā)交替率與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.756（P<0.01）。自發(fā)交替率反映了小鼠的空間工作記憶能力，該結(jié)果表明，隨著B(niǎo)DNF表達(dá)水平的升高，小鼠的空間工作記憶能力增強(qiáng)，能夠更好地記住之前探索過(guò)的臂，表現(xiàn)出更高的自發(fā)交替行為。綜合以上相關(guān)性分析結(jié)果，充分表明小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與腦內(nèi)BDNF表達(dá)之間存在密切的相關(guān)性。腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平的變化對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能有著顯著的影響，BDNF在慢性應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能損害過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。五、討論5.1慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能影響的討論本研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激顯著損害了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，這表明其在學(xué)習(xí)過(guò)程中對(duì)空間位置的記憶和學(xué)習(xí)能力受到了嚴(yán)重影響，難以快速找到隱藏平臺(tái)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，這充分說(shuō)明其對(duì)平臺(tái)位置的記憶保持能力下降，空間記憶能力受到了損害。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組小鼠的自發(fā)交替率顯著降低，在起始臂的停留時(shí)間明顯增加，對(duì)新異臂和其他臂的探索意愿降低，探索行為模式發(fā)生改變，這進(jìn)一步證實(shí)了慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間工作記憶能力和空間認(rèn)知探索能力的削弱。慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生損害的原因可能是多方面的。從神經(jīng)生物學(xué)角度來(lái)看，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的過(guò)度激活，使皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素持續(xù)高水平分泌。長(zhǎng)期高濃度的皮質(zhì)醇會(huì)對(duì)大腦中與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，如海馬體和前額葉皮層等造成損害。海馬體中的神經(jīng)元對(duì)皮質(zhì)醇較為敏感，長(zhǎng)期暴露于高濃度皮質(zhì)醇下，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮、凋亡，樹(shù)突分支減少，從而破壞海馬體的正常結(jié)構(gòu)和功能。海馬體在空間學(xué)習(xí)記憶中起著關(guān)鍵作用，其結(jié)構(gòu)和功能的受損必然會(huì)導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。前額葉皮層的神經(jīng)元連接和神經(jīng)可塑性也會(huì)受到慢性應(yīng)激的影響，導(dǎo)致其在工作記憶維持、注意力調(diào)控和決策制定等方面的功能受損，進(jìn)而影響空間學(xué)習(xí)記憶功能。從神經(jīng)遞質(zhì)角度分析，慢性應(yīng)激會(huì)干擾神經(jīng)遞質(zhì)的正常代謝和傳遞。例如，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致多巴胺、血清素等神經(jīng)遞質(zhì)的水平發(fā)生變化。多巴胺在大腦的獎(jiǎng)賞系統(tǒng)和動(dòng)機(jī)行為中起著重要作用，其水平的改變會(huì)影響小鼠的學(xué)習(xí)動(dòng)機(jī)和積極性。血清素與情緒調(diào)節(jié)和認(rèn)知功能密切相關(guān)，血清素水平的降低會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒，進(jìn)而影響其注意力和記憶力，導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。與其他相關(guān)研究相比，本研究結(jié)果具有一致性。許多研究采用不同的慢性應(yīng)激模型和行為學(xué)檢測(cè)方法，均發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。有研究采用慢性束縛應(yīng)激模型，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，在目標(biāo)象限的停留時(shí)間縮短，與本研究結(jié)果相符。也有研究利用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型，通過(guò)Y迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組小鼠的自發(fā)交替率降低，空間工作記憶能力下降。這些研究結(jié)果都表明，慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損害是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象。在一些研究中，采用的慢性應(yīng)激模型可能只包含單一的應(yīng)激因素，如單純的束縛應(yīng)激或禁食應(yīng)激等，而本研究采用多因素復(fù)合應(yīng)激模型，更全面地模擬了人類(lèi)實(shí)際生活中面臨的復(fù)雜應(yīng)激情況。在行為學(xué)檢測(cè)方法上，不同研究可能側(cè)重不同的實(shí)驗(yàn)，有些研究只采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，而本研究同時(shí)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和Y迷宮實(shí)驗(yàn)，從不同角度評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，使研究結(jié)果更加全面和準(zhǔn)確。這些差異可能導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的具體數(shù)據(jù)上存在一定的不同，但整體趨勢(shì)是一致的，都表明慢性應(yīng)激會(huì)對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生負(fù)面影響。5.2慢性應(yīng)激對(duì)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)影響的討論本研究結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激顯著下調(diào)了小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)，尤其是在海馬和前額葉皮層等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激組小鼠海馬和前額葉皮層的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，陽(yáng)性反應(yīng)減弱。Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，慢性應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。這表明慢性應(yīng)激對(duì)小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)具有明顯的抑制作用。慢性應(yīng)激下調(diào)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的機(jī)制可能與下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激活密切相關(guān)。在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，HPA軸被過(guò)度激活，導(dǎo)致皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素大量分泌。皮質(zhì)醇可以通過(guò)與海馬和前額葉皮層等腦區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，抑制BDNF基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，皮質(zhì)醇與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后，會(huì)形成激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與BDNF基因啟動(dòng)子區(qū)域的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GRE）結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制BDNF基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致BDNF表達(dá)下降。慢性應(yīng)激還可能通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)，間接調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)。如前文所述，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致多巴胺、血清素等神經(jīng)遞質(zhì)水平改變，這些神經(jīng)遞質(zhì)的異?？赡軙?huì)干擾BDNF表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。多巴胺可以通過(guò)D1和D2受體調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)，血清素也能通過(guò)其受體參與BDNF表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)這些神經(jīng)遞質(zhì)水平在慢性應(yīng)激下發(fā)生變化時(shí)，就可能影響B(tài)DNF的表達(dá)。BDNF表達(dá)下調(diào)與神經(jīng)可塑性和細(xì)胞凋亡之間存在著密切的關(guān)系。BDNF是維持神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵因子，對(duì)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、分化和突觸可塑性都有著重要影響。當(dāng)BDNF表達(dá)下調(diào)時(shí)，神經(jīng)元的存活受到威脅，突觸可塑性降低。研究表明，BDNF可以通過(guò)與神經(jīng)元表面的酪氨酸激酶受體B（TrkB）結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)，增強(qiáng)突觸可塑性。當(dāng)BDNF表達(dá)減少時(shí)，這些信號(hào)通路的激活受到抑制，導(dǎo)致神經(jīng)元的存活能力下降，突觸可塑性受損。BDNF表達(dá)下調(diào)還可能與細(xì)胞凋亡的增加有關(guān)。正常情況下，BDNF通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如半胱天冬酶-3等，從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活。當(dāng)BDNF表達(dá)下調(diào)時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活減弱，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，導(dǎo)致神經(jīng)元更容易發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在BDNF基因敲除小鼠的海馬神經(jīng)元中，細(xì)胞凋亡明顯增加，這進(jìn)一步證實(shí)了BDNF在抑制細(xì)胞凋亡方面的重要作用。本研究結(jié)果與其他相關(guān)研究具有一致性。許多研究都發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)下降。有研究采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組小鼠海馬和前額葉皮層的BDNF表達(dá)顯著降低。也有研究利用慢性束縛應(yīng)激模型，得到了類(lèi)似的結(jié)果。這些研究結(jié)果都表明，慢性應(yīng)激對(duì)小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)的抑制作用是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象。在一些研究中，可能只關(guān)注了單一腦區(qū)BDNF表達(dá)的變化，而本研究同時(shí)檢測(cè)了海馬和前額葉皮層等多個(gè)腦區(qū)BDNF的表達(dá)，更全面地揭示了慢性應(yīng)激對(duì)BDNF表達(dá)的影響。在檢測(cè)方法上，不同研究可能采用了不同的技術(shù)，本研究采用免疫組織化學(xué)和Westernblot兩種技術(shù)相結(jié)合的方法，從定性和定量?jī)蓚€(gè)角度準(zhǔn)確地檢測(cè)了BDNF的表達(dá)變化，使研究結(jié)果更加可靠。5.3小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能與腦內(nèi)BDNF表達(dá)相關(guān)性的討論相關(guān)性分析結(jié)果表明，小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與腦內(nèi)BDNF表達(dá)之間存在密切的相關(guān)性。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，小鼠的自發(fā)交替率與腦內(nèi)BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量也呈顯著正相關(guān)。這充分說(shuō)明，腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平的變化對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能有著顯著的影響，BDNF在慢性應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能損害過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。從神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制角度來(lái)看，BDNF對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響可能與它對(duì)神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。BDNF可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)突觸可塑性，從而為空間學(xué)習(xí)記憶提供良好的神經(jīng)基礎(chǔ)。在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，BDNF表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)受到影響，突觸可塑性降低，進(jìn)而損害了空間學(xué)習(xí)記憶功能。研究表明，BDNF可以通過(guò)與酪氨酸激酶受體B（TrkB）結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)，增強(qiáng)突觸可塑性。當(dāng)BDNF表達(dá)減少時(shí)，這些信號(hào)通路的激活受到抑制，導(dǎo)致神經(jīng)元的存活能力下降，突觸可塑性受損，從而影響空間學(xué)習(xí)記憶功能。BDNF還可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和代謝，間接影響空間學(xué)習(xí)記憶功能。BDNF可以促進(jìn)谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增強(qiáng)神經(jīng)元之間的興奮性傳遞。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。BDNF還可以抑制γ-氨基丁酸（GABA）等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，維持神經(jīng)元的興奮性和抑制性平衡。當(dāng)BDNF表達(dá)下調(diào)時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和代謝受到干擾，導(dǎo)致神經(jīng)元之間的信息傳遞異常，進(jìn)而影響空間學(xué)習(xí)記憶功能。本研究結(jié)果與其他相關(guān)研究具有一致性。許多研究都發(fā)現(xiàn)，BDNF表達(dá)水平與空間學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。有研究通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行BDNF基因敲除，發(fā)現(xiàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損。也有研究通過(guò)給予外源性BDNF，發(fā)現(xiàn)可以改善小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。這些研究都表明，BDNF在空間學(xué)習(xí)記憶中起著重要的作用。在一些研究中，可能只關(guān)注了BDNF對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的某一方面的影響，而本研究通過(guò)多種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)，全面地分析了BDNF與空間學(xué)習(xí)記憶能力之間的相關(guān)性，使研究結(jié)果更加全面和深入。在研究對(duì)象上，不同研究可能采用了不同的動(dòng)物模型或細(xì)胞系，本研究選用C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其遺傳背景穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)較為敏感，能夠更準(zhǔn)確地反映慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及BDNF表達(dá)的影響。本研究也存在一定的局限性。雖然通過(guò)相關(guān)性分析明確了小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與腦內(nèi)BDNF表達(dá)之間的密切關(guān)系，但未能進(jìn)一步確定兩者之間的因果關(guān)系。BDNF表達(dá)變化是導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶功能改變的直接原因，還是只是慢性應(yīng)激導(dǎo)致的一個(gè)伴隨現(xiàn)象，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)明確。未來(lái)的研究可以通過(guò)基因敲除、過(guò)表達(dá)等技術(shù)手段，人為地改變BDNF的表達(dá)水平，觀察其對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響，從而確定兩者之間的因果關(guān)系。本研究只檢測(cè)了BDNF在海馬和前額葉皮層等腦區(qū)的表達(dá)變化，對(duì)于其他腦區(qū)的BDNF表達(dá)情況以及BDNF在不同細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)差異尚未進(jìn)行深入研究。未來(lái)的研究可以擴(kuò)大檢測(cè)范圍，深入探討B(tài)DNF在不同腦區(qū)和細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)變化及其與空間學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系。在研究方法上，本研究主要采用了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于慢性應(yīng)激影響小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及BDNF表達(dá)的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制尚未進(jìn)行研究。未來(lái)的研究可以結(jié)合光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)等先進(jìn)技術(shù)，深入探究慢性應(yīng)激作用的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制，為揭示慢性應(yīng)激導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供更全面的理論依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過(guò)建立多因素慢性應(yīng)激小鼠模型，綜合運(yùn)用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究了慢性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激顯著損害了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索實(shí)驗(yàn)中在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)大幅減少；Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組小鼠的自發(fā)交替率顯著降低，在起始臂的停留時(shí)間明顯增加，對(duì)新異臂和其他臂的探索意愿降低。這些結(jié)果一致表明，慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，使其在空間定位、記憶保持和探索等方面的能力受到嚴(yán)重削弱。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激顯著下調(diào)了小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，慢性應(yīng)激組小鼠海馬和前額葉皮層的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，陽(yáng)性反應(yīng)減弱；Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，慢性應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，且在與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬和前額葉皮層等腦區(qū)，BDNF蛋白表達(dá)下降