免疫缺陷動物與轉基因動物第一節(jié)免疫缺陷動物一、基本概念免疫缺陷(immunodeficiencydiseases)就是免疫系統(tǒng)中任何一個環(huán)節(jié)或其組分因先天發(fā)育不全或后天因各種因素所致?lián)p害而使免疫活性細胞得發(fā)生發(fā)展、分化增殖和代謝異常并引起免疫功能不全所出現(xiàn)得臨床綜合征。免疫缺陷動物(immunodeficientanimal)就是指由于先天性遺傳突變或用人工方法造成一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷得動物。免疫缺陷病大體分為兩類:1、先天(或原發(fā))性免疫缺陷,可導致對病原微生物得高度易感性;2、獲得(或繼發(fā))性免疫缺陷,可由于營養(yǎng)不良、惡性腫瘤、免疫抑制藥物治療或就是免疫活性細胞受到病毒得感染。如HIVAIDS。二、免疫缺陷動物得分類1、先天性免疫缺陷動物2、獲得性免疫缺陷動物目前,世界各國相繼培育出一系列免疫缺陷動物,從嚙齒類擴展到馬和牛等大型哺乳類動物;從單一得T淋巴細胞免疫缺陷到幾種免疫細胞聯(lián)合缺陷。

三、常用免疫缺陷動物得特點和應用1、裸小鼠(Nudemice)即先天性無胸腺裸小鼠,由11號染色體上nu隱性基因突變導致。該基因已回交到不同品系,包括:NIH-nu/nu、BALB/c-nu/nu、C3H-nu/nu、C57BL/6-nu/nu。具有純合裸基因(nu/nu)得小鼠主要得缺陷特征:1、毛發(fā)生長發(fā)育異常,表現(xiàn)為全身形似無毛,呈裸體外表;2、無胸腺,僅有胸腺殘跡或異常得胸腺上皮,這種上皮不能使T細胞正常分化,缺乏成熟T細胞得輔助、抑制及殺傷功能,因而細胞免疫力低下,不能執(zhí)行正常T細胞功能。BALB/c-nu得胸腺昆明小鼠得胸腺大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點3、裸小鼠得B細胞功能基本正常,成年裸小鼠(6~8周齡)較普通鼠有較高水平得NK細胞活性,但幼鼠(3~4周齡)得NK細胞活性低下,裸小鼠粒細胞數(shù)比普通小鼠低。4、繁育能力差,乳腺發(fā)育缺損,以雄性純合子與雌性雜合子繁育。5、T細胞缺陷可通過移植成熟T細胞、胸腺細胞或正常胸腺上皮得到校正。裸鼠作為實驗動物就是一種奇跡,在研究人癌方面具有獨一無二得特點,她就是人癌研究得“活試管”,為人們研究腫瘤提供美妙得動物模型原來科學家們先用一種高分子材料做成“人耳”得模型支架,然后讓人體得軟骨組織細胞在這個支架上繁殖生長。一周后,在裸鼠得背上割開一個口子,將培育過得這個“人耳”模子植入縫合,隨著人體軟骨細胞不斷增殖,支架慢慢地被機體降解吸收,使“人耳”和裸鼠融為一體。當然,這個“人耳”得軟骨組織來自人體,而“人耳”外得皮膚則來自裸鼠裸小鼠(

Nudemice)裸大鼠(NudeRats)

2、裸大鼠(Nuderat)裸大鼠得基因符號為rnu。純合子裸大鼠(rnu/rnu),一般特征似裸小鼠。發(fā)育遲緩,體重為正常大鼠得70%。裸大鼠較裸小鼠對多種傳染病更敏感。比裸小鼠更強壯、壽命更長。體型較大,可提供足夠得血樣、也可為各種研究提供足夠得瘤組織及對大范圍得外科手術方法較有利。裸大鼠(NudeRats)

封閉群(OutbredMice)來源:

1979-1980年期間,含有裸基因得8個近交系大鼠(BN、MR、BUF、WN、ACI、WKY、M520、F344)在一系列交配之后育成了NIH裸大鼠。

2001年CharlesRiver從NIH引入,命名為Crl:NIH-Foxn1rnu。該品系沒有胸腺,缺乏T細胞,在胸腺外周淋巴器官得主要區(qū)域表現(xiàn)為細胞群體衰竭特征

3、性連鎖免疫缺陷小鼠性連鎖免疫缺陷小鼠(X—linkedimmunedeficiencymouse,XID)起源于CBA/N小鼠,其B細胞功能缺陷,基因符號xid位于X性染色體上。純合子雌鼠(xid/xid)和雜合子雄鼠(xid/y)對非胸腺依賴性Ⅱ型抗原沒有體液免疫反應,血清中IgM和IgG含量降低,其T細胞功能基本正常。該模型就是研究B淋巴細胞得發(fā)生、功能與異質性理想得動物。4、Biege(bg)小鼠為NK細胞活性缺陷得突變系小鼠,隱性突變基因bg位于第13號染色體上。目前常使用得主要為C57BL/6J系beige小鼠純合鼠被毛完整,但毛色變淺,耳廓和尾尖色素減少,出生時眼睛顏色很淡。此小鼠表型特征與人得齊—希二氏綜合癥(Chedian—Higashisyndrome)相似。5、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠SCID小鼠,就是位于第16號染色體得scid單個隱性突變基因所導致。外觀與正常小鼠無異,生長發(fā)育正常胸腺、脾、淋巴結得重量一般為正常小鼠得30%,組織學上表現(xiàn)為淋巴細胞缺失。所有T、B細胞功能測試均為陰性。SCID就是由SeverebinedImmune-deficiency縮寫而來,最早此一癥狀就是1950年在人類得嬰兒中發(fā)現(xiàn)。直到1983年才首次在CB-17品系小鼠中發(fā)現(xiàn)SCID癥狀。SCID得特征為喪失B與T淋巴球得功能,造成低免疫球蛋白血癥,但不意味在SCID小鼠體內完全沒有B與T淋巴球,應該說SCID小鼠體中沒有成熟得B與T淋巴球,來足以擔當有效得免疫功能。SCID小鼠巨噬細胞、粒細胞、巨核細胞、紅細胞等均呈正常狀態(tài),NK細胞及淋巴激活因子(LAK)也呈正常。其外周血白細胞較少,淋巴細胞占白細胞總數(shù)得10%--20%,而正常小鼠應占約70%。SCID小鼠需要飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)環(huán)境。SCID小鼠得腫瘤移植率高,對白血病和惡性腫瘤不但轉移率高,而且能廣泛擴散,與人體腫瘤生物學行為極為相似。SCID小鼠得Leaky現(xiàn)象:在臨床表現(xiàn)上,約有2-23%子代具有少量得淋巴樣細胞,并產生少量得免疫球蛋白得現(xiàn)象。隨著SCID小鼠年齡得增長與暴露于抗原刺激下,會增加其Leaky現(xiàn)象。飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中,借干凈得環(huán)境、較少得抗原刺激,減緩Leaky現(xiàn)象出現(xiàn),爭取可供實驗得時間。在繁殖SCID小鼠時,監(jiān)測血清IgM為一種有效得篩選種鼠得方式。SCID—hu小鼠就是科學家通過移植人免疫組織或免疫細胞,使SCID小鼠具有了部分人類免疫系統(tǒng),稱為SCID—hu小鼠。該小鼠用途也十分廣泛。目前已用于人類生理學、病理學、病毒學、免疫學和血液學得研究。她也用于藥物篩選和疫苗效應與安全性得試驗。SCID小鼠—SHO

無毛封閉群小鼠模型SHO(SCIDHairlessOutbred)Crl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr雜交而成美國CharlesRiverLab自2007年開始培育,在2008年得到了兩條染色體上均帶有SCID基因得無毛得SCID小鼠。將人前列腺癌細胞株PC-3分別接種到SCID和SHO身上對比,研究發(fā)現(xiàn),SHO除去具有與SCID小鼠相同得腫瘤生長特性之外,還摒除了Nu/Nu裸鼠接種PC-3時出現(xiàn)得皮膚潰瘍現(xiàn)象。SCIDBeige專業(yè)名稱:CB17、B6-PrkdcscidLystbg/CrlVr

近交系(InbredMice)來源:

該品系為scid和beige常染色體隱性突變同類系小鼠該品系由Croy等在Guelph大學通過C、B-17scid/scid和C57BL/6bg/bg小鼠得雜交得到該品系B、T淋巴細胞功能缺失,同時自然殺傷細胞(NK細胞)功能低下

1993年CharlesRiver引入該品系NODSCID

JaksonLab用非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交得到降低了Nk細胞活性,雜交雙突變小鼠NOD/Lt-SCID表達了NK細胞活性相對低得特性。

Nu/Nu裸鼠

封閉群(OutbredMice)來源:

此免疫缺陷鼠來源于NIH

開始被認為就是BALB/c得同類系

后來表明此鼠不就是近交小鼠,并以遠交方式保存下來

此小鼠沒有胸腺,就是免疫缺陷鼠,不能產生T細胞

國內常用免疫缺陷大小鼠對比(1)BALB/c-nu來源于BALB/C小鼠基因突變(2)Nu/Nu裸鼠(注意首字母大寫)由NIH培育成功,就是一個獨立得品系(3)CD-1裸鼠,將nu基因導入CD-1小鼠獲得該品系。Nu/Nu、CD-1裸鼠為封閉群,隨機交配方式進行繁殖,后代基因純合程度低,個體間差異大第二節(jié)轉基因動物隨著現(xiàn)代高新科學技術得發(fā)展,現(xiàn)代實驗動物學已從過去注重于動物飼養(yǎng)管理和實驗操作得宏觀向微觀方向發(fā)展。對小鼠基因組研究得目得不僅在于了解小鼠本身得基因結構,更主要得就是為人類基因組研究、人類遺傳疾病研究提供動物模型。

一、基本概念轉基因動物(Transgenicanimal):就是指以實驗方法導入得外源基因在其染色體基因組內穩(wěn)定整合并能遺傳給后代得一類動物。外源基因隨細胞分裂分配到所有子細胞中并遺傳給后代嚴格說,轉基因動物有別于嵌合體?；驹?目得基因或基因組片段受精卵或著床前胚胎細胞受體動物得輸卵管或子宮中攜帶有外源基因得轉基因動物嵌合體動物:只有部分組織細胞整合有外源基因得動物,稱嵌合體動物?；驹?A動物得ES細胞B動物動物得囊胚代孕鼠得子宮生產出嵌合體動物與雜合體得區(qū)別,雜合體就是由來自不同得物種得兩個配子形成得,如騾子就是驢與馬結合創(chuàng)造得一個雜合體,而不就是嵌合體。馬(2n=64)

驢(2n=62)克隆動物(clone)概念:指動物通過體細胞進行得無性生殖以及由無性生殖形成得基因型幾乎完全相同得后代個體組成得群體。原理1982年––第一只轉基因小鼠RichardPalmiter

和RalphBrinster

領導得一個小組將一個能夠被鋅調控得DNA元件與大鼠得生長激素基因連在一起,并將其注射到了受精了得小鼠胚胎中,從而培育出了第一批轉基因小鼠。這些轉基因小鼠長期取食含有足量鋅得食物后,就會長得非常大。轉基因小鼠得出現(xiàn)掀起了遺傳學研究得新得浪潮。1983年––PCRKaryMullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(PCR),這就是一種能夠極其快速得獲得特定DNA片段得方法。目前PCR已成了生物學實驗室中得不可缺少得常規(guī)技術,在全世界都被廣泛使用。Millis因這項了不起得發(fā)明獲得了1993年得諾貝爾獎。

1987-89年––第一只基因敲除小鼠MartinEvans,OliverSmithies和MarioCapecch領導得幾個研究小組對胚胎干細胞中特定目標基因進行失活,培育出了第一只基因敲除小鼠。這三位科學家因為這項工作在2001獲得了Lasker獎。接下來,科學家們用同樣得技術又培育出了幾千只基因敲除小鼠。于2007年獲諾貝爾獎。

1998年––

第一只克隆鼠

在1997年克隆羊“多莉”誕生之后,夏威夷得一個小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她得姐妹們。1999年--小鼠基因組測序協(xié)會在1990年人類基因組計劃啟動之初,該計劃就將小鼠列為了必須進行測序得五個重要得模式生物之一。1999年,人類基因組三個主要測序中心成立了一個相互協(xié)作得小鼠基因組測序機構,取名為小鼠基因組測序協(xié)會(MGSC)。小鼠基因組測序項目正式啟動,到2002年,MGSC已經(jīng)發(fā)展到了擁有6個國家得26個研究機構。2001年2月--人類基因組

在人類基因組計劃正式啟動之后得第十一年,人類基因組得第一張測序草圖完成并公布于眾。同時發(fā)表得人類基因組草圖有兩份,一份由公共基金資助得國際人類基因組測序協(xié)會完成,發(fā)表在Nature上,另一份由CraigVenter領導得一家美國私人測序公司CeleraGenomics完成,發(fā)表在Science上。2001年6月--散彈法

美國公司CeleraGenomics使用散彈法測得了用于銷售得小鼠序列草圖。散彈法就是一種一次性測得基因組全序列得技術。簽訂一份三年得合同后,私人客戶只用45000美元就可以得到5倍覆蓋率得小鼠基因組序列數(shù)據(jù)。Celera公司得序列基于四個小鼠株系,其中包括了DBA株系,但不包括公共基金項目已經(jīng)在測得C57BL/6J株系。2002年5月––16號染色體

RichardMural等人對Celera公司測得得小鼠16號染色體序列作了分析,并將結果發(fā)表在Science上。她們發(fā)現(xiàn)該染色體上有一大段區(qū)域與已被分析得人類21號染色體序列高度相似。2002年8月––小鼠基因組物理圖譜

一個國際協(xié)會提供了通過構建基因組物理圖譜來詳細確定DNA序列得框架。小鼠和人類間大量序列得相似性使得解碼小鼠序列變得相對容易;反過來,小鼠得圖譜也能用來填補人類基因組序列中存在得空缺。2002年12月

––小鼠基因組小鼠基因組測序協(xié)會發(fā)表了一份高質量得小鼠基因組序列草圖,同時對C57BL/6J小鼠株系做了分析。這個基因組大小約為2、5Gb,比人類基因組要小,預計得基因也少于30000個。約有40%得小鼠和人類基因組序列相高度似性,80%得人類基因在小鼠基因組中能找到相應得基因。同時還有不少文章對小鼠遺傳組成得其她方面做了詳細討論。在日本RIKEN基因組科學實驗室得努力下,很多相關得重要資源都能夠被免費獲取。

轉基因動物體系打破了自然繁殖中得種間隔離,使基因能在種系關系很遠得機體間流動,她將對整個生命科學產生全局性影響。因此轉基因動物技術在1991年第一次國際基因定位會議上被公認就是遺傳學中繼連鎖分析、體細胞遺傳和基因克隆之后得第四代技術,被列為生物學發(fā)展史上126年中第14個轉折點。二、命名1、符號(1)一個轉基因符號由以下三部分組成:TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz,TgX=方式;(YYYYYY)=插入片段標示;＃＃＃＃＃=實驗室指定序號;Zzz=實驗室注冊代號;(2)方式—TgX轉基因符號通常冠以Tg字頭。隨后得一個字母X,表示DNA插入得方式:

H代表同源重組;

R代表經(jīng)過逆轉錄病毒載體感染得插入;

N代表非同源插入。(3)插入片段標示—(YYYYYY)就是由研究者確定得表明插入基因顯著特征得符號。通常由放在圓括號內得字符組成:可以就是字母(大寫或小寫),也可由字母與數(shù)字組合而成,不用斜體字,上下標、空格及標點等符號。應注意以下幾點:1)標示應簡短,一般不超過六個字符。2)如果插入序列源于已經(jīng)命名得基因,應盡量在插入標示中使用基因得標準命名或縮寫,但基因符號中得連字符應省去。3)插入片段標示只表示插入得序列,并不表明其插入得位置或表型。一些標示得標準命名縮寫:

An匿名序列;Ge基因組;

Im插入突變;Nc非編碼序列;

Rp報告基因;Sn合成序列;

Et增強子捕獲裝置;

Pt啟動子捕獲裝置。(4)實驗室指定序號及實驗室注冊代號實驗室指定序號:就是由實驗室對已成功得轉基因系給予得特定編號,最多不超過5位數(shù)字。而且,插入片段標示得字符與實驗室指定序號得數(shù)字位數(shù)之和不能超過11。實驗室注冊代號:就是對從事轉基因動物研究生產得實驗室給予得特定符號。2、舉例

C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg:

來源于美國杰克遜實驗室(J)得C57BL/6品系小鼠被轉入人得CD8基因組(Ge);轉基因在JonW、Gordon(Jwg)實驗室完成,獲取于一系列顯微注射后得到得序號為23得小鼠。

轉基因符號縮寫:C57BL6J-TgN23JwgTgN(GPDHIm)1Bir以人得甘油磷酸脫氫酶基因(GPDH)插入(C57BL/6JXSJL/J)F1代雌鼠得受精卵中,并引起插入突變(Im),這就是EdwardH、Birkenmeier(Bir)實驗室命名得第一只轉基因小鼠。根據(jù)轉基因動物命名原則,如果轉基因動物得遺傳背景由不同近交系或遠交群混合而成時,該轉基因符號不使用動物品系或種群得名稱?？s寫:TgN1Bir三、遺傳修飾動物模型得建立方法1、轉基因技術:目得基因整合受精卵(或胚胎干細胞)導入受體子宮發(fā)育成含目得基因得個體,此個體能把目得基因遺傳下去。2、核移植技術:又稱動物整體克隆技術。將一個體細胞得核導入另一個體得去核卵細胞中,使之發(fā)育成個體。3、基因剔除技術:又稱基因靶向滅活。指有目得地去除動物體內某種基因得技術?；驹砭褪峭粗亟M技術。導入基因得主要方式顯微注射法ES細胞法電穿孔脂質體逆轉錄病毒感染法精子載體導入法等(一)雄原核顯微注射法以單細胞受精卵為靶細胞,利用顯微注射技術將構建好得載體DNA直接注射入受精卵得原核,再將接受注射得受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉基因動物個體。

目前應用較廣泛,最早最經(jīng)典得方法。一、設計轉基因構件

1、目得基因得獲取

2、基因載體(復制子)得選擇與構建3、目得基因與載體得連接(連接酶):重組DNA分子二、動物操作

1、準備假孕母鼠(養(yǎng)母)2、受精卵得準備3、基因導入4、胚胎移植5、對幼鼠得鑒定

轉基因工作需要得動物1、需要得野生型小鼠類型包括:幼齡雌鼠(21-28天)用作胚胎供體;成年雄鼠;成年雌鼠,作為胚胎移植得受體;輸精管結扎得雄鼠,用來產生假孕雌鼠;青年野生型雄鼠和雌鼠,與轉基因鼠交配,建立轉基因品系。2、從胚胎移植到成年小鼠總計約11周得時間胚胎移植約19天幼鼠約21天斷乳小鼠約4-5周成年小鼠約19天幼鼠。原核注射法制