2026年生物醫(yī)藥研究員分子生物學實驗技術實操技能考核題一、選擇題（每題2分，共20題）1.在進行PCR擴增時，引物退火溫度的確定主要依據(jù)是（）。A.引物長度B.引物GC含量C.產物大小D.模板濃度答案：B解析：引物退火溫度與GC含量密切相關，GC含量越高，Tm值越大，通常退火溫度需相應提高。2.以下哪種方法最適合用于檢測微量RNA樣本的完整性？（）A.PCR擴增B.電泳分析C.蛋白質印跡D.原位雜交答案：B解析：RNA完整性檢測常用瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察18S和28SrRNA條帶是否清晰可判斷RNA質量。3.在進行WesternBlot實驗時，封閉抗體常用的種類不包括（）。A.牛血清白蛋白（BSA）B.脫脂奶粉C.小鼠IgGD.綿羊抗兔IgG答案：D解析：D選項是二抗，封閉抗體應為BSA或脫脂奶粉等非特異性蛋白。4.下列哪種酶參與DNA復制起始？（）A.RNA聚合酶B.DNA聚合酶IIIC.DNA連接酶D.解旋酶答案：B解析：DNA聚合酶III是復制延長的主要酶，而其他酶參與不同階段。5.在進行基因克隆時，連接酶最常用的類型是（）。A.T4DNA連接酶B.T7RNA連接酶C.E.coliDNA連接酶D.T3RNA連接酶答案：A解析：T4DNA連接酶具有高活性且能連接平末端或粘性末端，應用最廣泛。6.瓊脂糖凝膠電泳中，DNA條帶跑動速度受以下因素影響，錯誤的是（）。A.瓊脂糖濃度B.DNA分子大小C.電場強度D.染料種類答案：D解析：染料種類主要影響遷移速度但不改變電泳原理，其他選項均影響條帶跑動。7.以下哪種方法可用于檢測基因表達的可逆性？（）A.RT-PCRB.NorthernBlotC.原位雜交D.WesternBlot答案：C解析：原位雜交可檢測細胞內mRNA定位及動態(tài)變化，其他方法多用于定量分析。8.在進行細胞培養(yǎng)時，Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基通常添加（）。A.酵母提取物和胰蛋白胨B.血清和雙抗C.碳酸鈣和瓊脂D.乙酸鹽和谷氨酰胺答案：A解析：LB培養(yǎng)基是通用型培養(yǎng)液，含酵母提取物和胰蛋白胨，不含特殊添加劑。9.CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，向導RNA（gRNA）的作用是（）。A.切割DNAB.識別靶向序列C.修復斷裂位點D.增強轉錄活性答案：B解析：gRNA與靶向DNA結合，引導Cas9酶精準切割。10.在進行qPCR實驗時，內參基因的選擇原則不包括（）。A.表達穩(wěn)定B.參與核心代謝C.質量控制嚴格D.易于擴增答案：B解析：內參基因應表達穩(wěn)定且不受實驗條件影響，核心代謝基因可能波動較大。二、填空題（每空1分，共10空）1.PCR反應體系中，dNTPs通常以______摩爾濃度添加，以避免競爭性抑制。答案：等量解析：dNTPs需均衡添加，過高或過低均影響擴增效率。2.WesternBlot中，一抗通常為______抗體，二抗需與一抗的靶標物種相匹配。答案：特異性解析：一抗需特異性識別目標蛋白，二抗需識別一抗物種（如羊抗鼠IgG）。3.RNA干擾（RNAi）的核心機制是通過______降解靶向mRNA。答案：RNA酶H解析：siRNA被RISC識別后，RNA酶H降解互補mRNA。4.細胞培養(yǎng)過程中，CO2培養(yǎng)箱的pH值主要通過______調節(jié)。答案：CO2濃度解析：CO2溶于水形成碳酸，影響培養(yǎng)基pH。5.基因芯片的檢測原理基于______雜交技術，可同時檢測成百上千個基因。答案：核酸解析：基因芯片通過探針與目標核酸雜交進行表達譜分析。6.質粒載體通常含有______和復制起點（ori），以確保在宿主細胞中穩(wěn)定復制。答案：抗性基因解析：抗性基因用于篩選轉化成功細胞，ori保證質粒擴增。7.原核表達系統(tǒng)中，常用______作為啟動子，驅動外源基因高效表達。答案：T7RNA聚合酶解析：T7啟動子由T7RNA聚合酶驅動，表達量高且特異性強。8.真核表達系統(tǒng)中，轉錄終止主要依賴______結構，在多聚腺苷酸化位點下游形成。答案：多聚胸苷酸解析：Poly(A)信號與RNA聚合酶解離相關，促進轉錄終止。9.流式細胞術通過______檢測細胞，可分析細胞數(shù)量、大小及熒光標記物。答案：激光散射和熒光解析：激光散射反映細胞物理特性，熒光檢測分子表達水平。10.限制性內切酶識別的識別序列通常具有______對稱性，切割后形成粘性或平末端。答案：回文解析：回文序列在正反鏈上互補，如EcoRI識別GAATTC。三、簡答題（每題5分，共5題）1.簡述PCR反應體系中dNTPs的作用及其優(yōu)化原則。答案：dNTPs是PCR合成DNA的原料，需以等摩爾濃度添加（約200μM），過高會導致非特異性擴增，過低則抑制延伸。優(yōu)化時應考慮模板濃度、退火溫度等因素，避免過量或不足。2.比較qPCR和傳統(tǒng)PCR在檢測靈敏度和定量方面的差異。答案：qPCR通過實時監(jiān)測熒光信號實現(xiàn)定量檢測，靈敏度高，可檢測ng級RNA；傳統(tǒng)PCR為終點檢測，僅判斷擴增是否發(fā)生，無法定量。qPCR適用于表達分析，傳統(tǒng)PCR適用于基因存在性驗證。3.簡述WesternBlot實驗中封閉步驟的原理和注意事項。答案：封閉步驟通過非特異性蛋白（如BSA）占據(jù)抗體結合位點，避免假陽性。注意事項包括封閉時間（4-12h）、溫度（室溫或4℃）、封閉劑濃度（無血清培養(yǎng)基效果更佳）。4.解釋CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，gRNA設計的關鍵要素。答案：gRNA設計需考慮靶向序列的Tm值（60-80℃）、避免PAM序列鄰近、避免脫靶效應（如發(fā)夾結構）。優(yōu)先選擇無同源的內源基因序列，確保精準切割。5.簡述RNA干擾（RNAi）的生物學機制及其應用場景。答案：RNAi通過siRNA（約21nt）觸發(fā)mRNA降解，抑制基因表達。機制包括siRNA加載RISC，RNA酶H降解靶mRNA。應用場景包括基因功能驗證、疾病治療（siRNA藥物）。四、實驗設計題（每題10分，共2題）1.設計一個實驗方案，驗證某基因在細胞應激條件下的表達變化。答案：實驗步驟：（1）用H2O2處理細胞（應激組），設未處理組（對照組）；（2）提取總RNA，用TRIzol法裂解；（3）反轉錄為cDNA，用qPCR檢測目標基因表達（設GAPDH為內參）；（4）分析應激組與對照組的相對表達倍數(shù)變化。關鍵點：-細胞同步化（傳代時間固定）；-RNA純度檢測（A260/A280）；-重復實驗（至少3次）。2.設計一個基因敲除實驗，驗證某基因的功能缺失表型。答案：實驗步驟：（1）設計sgRNA和敲除載體（含篩選標記如Neo）；（2）轉染細胞，篩選G418抗性克??；（3）PCR驗證基因敲除（如長片段PCR檢測缺失）；（4）觀察表型變化（如細胞形態(tài)、功能實驗）。關鍵點：-對照實驗（空載體轉染）；-同源重組效率（測序驗證）；-表型分析標準化（圖像采集、統(tǒng)計分析）。五、計算題（每題5分，共2題）1.某qPCR實驗中，目標基因Ct值從對照組10.5下降至處理組8.5，計算相對表達倍數(shù)。答案：相對表達=2^(-ΔCt)，ΔCt=10.5-8.5=2，相對表達=2^(-2)=0.25（即處理組表達降低4倍）。2.已知限制性內切酶EcoRI識別序列為GAATTC，其Tm值為37℃。若退火溫度設為55℃，計算該酶的最優(yōu)識別位點。答案：EcoRI識別序列對稱，最佳退火溫度應覆蓋兩端序列Tm值范圍。假設兩端序列Tm差異不大，最優(yōu)位點為中間位置（如G...AATTC...C），確保退火平衡。六、論述題（每題10分，共2題）1.論述基因編輯技術CRISPR-Cas9在生物醫(yī)藥研究中的優(yōu)勢與局限性。答案：優(yōu)勢：-高效（單細胞水平編輯）；-易設計（gRNA快速合成）；-成本低（較傳統(tǒng)方法）；-可修正基因缺陷。局限性：-脫靶效應（非靶向切割）；-