1、DNA的粗提取和鑒定，一、實(shí)驗(yàn)原理，一.血球過(guò)度浸透蒸餾水會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和核膜破裂。 利用這個(gè)特性可以得到含有DNA的溶液。 2.DNA在氯化鈉溶液中的溶解度根據(jù)氯化鈉濃度的變化而變化。 在物質(zhì)量濃度為0.14mol/L的氯化鈉溶液中，DNA的溶解度最低，利用該原理可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出。3.DNA不溶解在酒精溶液中，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)可以溶解在酒精中。 利用這個(gè)原理，可以進(jìn)一步提取雜質(zhì)少的DNA。 4.DNA遇到二苯胺(沸水浴)就變藍(lán)，所以二苯胺成為鑒定DNA的試劑。 二、方法和過(guò)程、1 .雞血球液(活雞血液分離或沉淀而得)、用500mL燒杯攪拌玻璃棒，離心分離或靜置沉淀。 2

2、.提取DNA。 取出血球5-10mL 20mL的蒸餾水，用玻璃棒向一個(gè)方向急速攪拌。 紗布過(guò)濾：濾液中含有DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。 原理：血球細(xì)胞膜、核膜吸水膨脹，玻璃棒迅速攪拌，機(jī)器加速血球破裂。 提取血液核物質(zhì)；溶解核內(nèi)的DNA；將濾液2mol/L的NaCl溶液40mL、玻璃棒向一個(gè)方向輕輕攪拌。 .析出含有DNA的粘稠物：.濾出含有DNA的粘稠物：. DNA粘稠物的再溶解：慢慢向上述溶液中加入蒸餾水，向一個(gè)方向輕輕攪拌，出現(xiàn)線(xiàn)狀物，線(xiàn)狀物不增加時(shí)，停止加水(此時(shí)，NaCl溶液的濃度為0.1 用多層紗布過(guò)濾，將含有DNA的粘稠物留在紗布上。 用20mL燒杯輕輕攪拌3分鐘，使盡可能多的

3、DNA溶解在NaCl溶液中。 過(guò)濾含DNA的NaCl溶液：用裝有雙層紗布的漏斗對(duì)按照步驟得到的溶液進(jìn)行過(guò)濾，濾液中含有DNA。 提取雜質(zhì)少的DNA，按步驟將得到的濾液體積分率為95%的冷卻醇50mL用玻璃棒單向輕輕攪拌，溶液中出現(xiàn)乳白色的線(xiàn)狀物，用玻璃棒卷起線(xiàn)狀物，用濾紙吸收上面的水分。 3.DNA的鑒定：加入4mL二苯胺試劑，用玻璃棒攪拌溶解DNA，沸水浴5分鐘，觀察溶液是否變成淺藍(lán)色。 1 .有“三次過(guò)濾、二次析出、七次攪拌”，2 .加入“二次蒸餾水、三次NaCl溶液、一次醇”，三、實(shí)驗(yàn)總結(jié)，四、介紹了實(shí)驗(yàn)原理。 1.DNA的釋放。 DNA主要位于雞血球核內(nèi)，正常情況下不能釋放。 蒸餾水對(duì)

4、雞血細(xì)胞為低滲透液，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞，使其膨脹。 同時(shí)，加上玻璃棒快速攪拌的機(jī)械作用，加速血細(xì)胞細(xì)胞膜和核膜破裂。 但是，大量釋放的DNA與RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，不是單純的DNA，而是多被稱(chēng)為DNA核蛋白。 2.DNA和蛋白質(zhì)分離。 在高濃度(2mol/L )的氯化鈉溶液中，核蛋白容易溶解，析出DNA，溶解于高濃度的氯化鈉溶液中，3.DNA的析出和取得。 DNA在低濃度(0.14mol/L )的氯化鈉溶液中溶解度小，但蛋白質(zhì)的溶解度大。 因此，向含有DNA的高濃度氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，就會(huì)降低DNA溶解度，提高蛋白質(zhì)溶解度。 4.DNA的再溶解。 用高濃度(2mol/L

5、 )的氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物。 5.DNA的沉淀和濃縮。 去除蛋白質(zhì)的DNA氯化鈉溶液，需要進(jìn)一步沉淀和濃縮，常用的是酒精沉淀法。 也就是說(shuō)，在含有Na的DNA溶液中，加入體積分率95%的冷卻醇，混合后使DNA沉淀濃縮，形成含有雜質(zhì)的少的DNA絲狀物，使其在溶液中懸浮。 絲狀物少時(shí)，把混合液放入冰箱冷卻幾分鐘即可。 濃縮的DNA絲狀物可以用玻璃棒(玻璃棒具有吸附DNA的作用)緩慢旋轉(zhuǎn)的方法纏繞。 6.DNA的鑒定。 鑒定時(shí)藍(lán)色的濃淡與溶液中的DNA含量多少有關(guān)系。加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止凝血，促進(jìn)血球破裂，溶解DNA，為了最大限度地釋放DNA，稀釋2mol/L的NaCl溶液，將含有、

6、DNA的粘稠物殘留在紗布上，盡可能多地將含有DNA的粘稠物溶解在溶液中除去含有DNA濾液中的雜質(zhì)，提取DNA，A在藍(lán)色b中沒(méi)有變化，2 .實(shí)驗(yàn)中的NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol/L和0.14mol/L對(duì)，1 .在DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，向燒杯中加入2次蒸餾水的作用是() a .稀釋血液，清洗樣品b。 使血球破裂，降低NaCl濃度，使DNA析出。 使血球破裂，增大DNA的溶解量。 使血球破裂，提取含有雜質(zhì)的DNA。 a:b :前者溶解DNA，后者析出DNA，3.DNA用二苯胺(沸水浴)染色。 a:DNA的提取，雜質(zhì)的除去很重要，上清是血液中的血漿部分，因?yàn)椴缓珼NA，所以除去上清(含蛋白質(zhì)

7、)。 a:d，(1)PCR原理，體內(nèi)DNA復(fù)制：模板DNA原料：dNTP酶：外消旋酶，DNApol.引物，合成方向合成環(huán)境，鏈解除模板改性引物-出發(fā)引物-模板復(fù)合性鏈延長(zhǎng)子鏈延長(zhǎng)，(1)PCR原理，結(jié)果分析和評(píng)價(jià)這是紫外光吸收檢查的結(jié)果檢查法，采用在實(shí)踐中很少使用的瓊脂糖凝膠電泳法檢查PCR結(jié)果，F(xiàn)ig.7.23，denaturealpcrprimersextendndpcrprimersw/taqlrepeat，聚合物二、實(shí)驗(yàn)原理、聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR )是體外酶促進(jìn)特異DNA片段合成的一種方法。 典型的PCR由高溫變性、低溫退火和適當(dāng)拉伸

8、三階段反應(yīng)構(gòu)成一個(gè)循環(huán)周期，通過(guò)多循環(huán)反應(yīng)可以迅速地?cái)U(kuò)增目標(biāo)DNA。 其原理是，將擴(kuò)增的DNA在高溫下解開(kāi)鏈，人工合成的2個(gè)寡核苷酸在低溫下分別互補(bǔ)地結(jié)合到目標(biāo)片段兩側(cè)的2條鏈上，DNA聚合酶在72下從引物的3端導(dǎo)入一個(gè)堿基，向模板53端方向延伸通過(guò)重復(fù)這種改性、退火和伸長(zhǎng)反應(yīng)循環(huán)，可以指數(shù)放大兩引物限定范圍內(nèi)的DNA序列。 循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，理論上一個(gè)模板DNA分子經(jīng)過(guò)20次循環(huán)放大達(dá)到106。PCR的基本原理、改性、恢復(fù)性、半保留復(fù)制、一生二、二生四生萬(wàn)物、PCR三步曲、改性9097、退火4565、拉伸72左右、PCR過(guò)程、(二) PCR的反應(yīng)過(guò)程、改性-恢復(fù)性-拉伸多重環(huán)(

9、n )模板為2En放大段既可以應(yīng)用于基因分離、克隆和核苷酸序列分析，也可以應(yīng)用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)節(jié)和研究、基因多態(tài)性分析、遺傳病和傳染病診斷、腫瘤機(jī)制探索和醫(yī)學(xué)鑒定等多方面，也可以應(yīng)用于刑事物證鑒定、父子鑒定和古分子系統(tǒng)學(xué)研究本課題的學(xué)習(xí)目標(biāo)是，體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物高分子的基本過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物高分子的基本原理。 1、主要概念：凝膠色譜電泳緩沖溶液在血紅蛋白的提取中分別發(fā)揮著什么樣的作用？ 2 .主要原理：凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的原理電泳法分離樣品的原理緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3，課題重點(diǎn)：凝膠色譜的原理和方法4，課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理柱填料的處理和柱填

10、充。2003年4月14日公布人類(lèi)基因組序列圖已完成。 這表明進(jìn)入了后基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代。 人基因組： DNA分子擁有的所有遺傳信息，蛋白質(zhì)組學(xué)：指生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)分子的總和。 主要是關(guān)于蛋白質(zhì)功能的研究。 2 .問(wèn)題：血液中有什么成分？1 .問(wèn)題：雞紅血球提取DNA，人紅血球提取血紅蛋白的原因是什么？雞紅血球有核，含有DNA，容易提取DNA的人紅血球沒(méi)有核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白血紅蛋白、各肽鏈包圍著血紅素基，該基能攜帶氧或二氧化碳的分子，血紅蛋白因?yàn)楹醒t素而呈紅色。 血紅蛋白特征：1 .分離生物高分子的基本想法：以一定的物理或化學(xué)方式分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物高分子。 2、

11、蛋白質(zhì)分離和提取原理：根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、帶電性質(zhì)和量、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等，可以分離不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)。 一、血紅蛋白的提取和分離，三.高溫滅菌和酒精滅菌的結(jié)果：微生物的蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞。 (1)凝膠色譜(分配色譜)，2 .凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖類(lèi)化合物(葡聚糖和瓊脂糖等)組成的多孔球體，內(nèi)部有很多通道。 根據(jù)分離的物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩作用進(jìn)行分離。 1 .概念：3 .凝膠色譜原理-分子篩效果：相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢； 相對(duì)

12、分子量大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程短，移動(dòng)速度快。 分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子被分離出來(lái)。 所依據(jù)的特性是蛋白質(zhì)分子量的大小。 4 .通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過(guò)程，(二)緩沖溶液，1 .概念：在一定范圍內(nèi)，由于少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響，可以使原始溶液的PH幾乎保持恒定，可以抵抗混合溶液。 可以抵抗外部酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，使PH幾乎維持一定。 2、作用：3 .緩沖溶液的制備：通常是將1-2種緩沖劑溶解在水中制備的。 調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例，可以制造在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 4 .問(wèn)題：本課題中使用的緩沖液為：_，其目的為：利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)

13、境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)、磷酸緩沖液、緩沖液的組成和分類(lèi)，弱酸和相應(yīng)的鹽：弱酸和其CH3COOHCH3COONa、NH3H2ONH4CL； NH4OHNH4CL、NaHCO3Na2CO3； NaH2PO4Na2HPO4，緩沖溶液由足夠濃度的共軛酸堿對(duì)組成。 其中，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)堿的被稱(chēng)為共軛酸的能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)酸的被稱(chēng)為共軛堿。 這種共軛酸堿通常被稱(chēng)為緩沖對(duì)、緩沖劑或緩沖體系。 常見(jiàn)的緩沖對(duì)主要有以下三種： (3)電泳：1 .概念：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下移動(dòng)的過(guò)程。 2 .原理：許多重要的生物高分子，如多肽、核酸等具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH值下，這些基團(tuán)帶

14、正電或負(fù)電。 通過(guò)電場(chǎng)，這些帶電分子向與其帶電的電荷相反的電極移動(dòng)。 電泳利用分離樣品中各種分子的帶電特性的差異和分子本身的大小、形狀的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度，實(shí)現(xiàn)了樣品中各種分子的分離。 3 .類(lèi)型：瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。由于電場(chǎng)，這些帶電分子向與其帶電的電荷相反的電極移動(dòng)，瓊脂糖凝膠電泳的圖像、聚丙烯酰胺凝膠電泳、1、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)常用的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是具有單丙烯酰胺和作為交聯(lián)劑n，n -亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)遷移率取決于其擁有的凈電荷量和分子

15、的大小等。 可以將SDS施加到凝膠上，以消除凈電荷對(duì)遷移率的影響。 2 .原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS使蛋白質(zhì)完全變性。 由幾個(gè)多肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物被SDS分解成一個(gè)多肽鏈，因此測(cè)定結(jié)果只是一個(gè)多肽鏈的分子量。 SDS形成各種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)SDS復(fù)合體，SDS帶有的負(fù)電荷量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子的原始電荷量。 因此，可以掩蓋不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異，使電泳遷移率完全依賴(lài)于分子的大小。 3.SDS作用機(jī)制：用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，可以選擇已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)并同時(shí)進(jìn)行電泳，取決于已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳區(qū)的位置市場(chǎng)上出售高分子量、

16、亞高分子量、低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑。 二、實(shí)驗(yàn)操作、樣品處理粗分離精制純度鑒定，一.樣品處理：(一)蛋白質(zhì)的提取和分離步驟，(二)操作過(guò)程，本課題選擇豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液分離血紅蛋白。 (1)清洗紅血球：清洗目的：去除雜質(zhì)，有利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，清洗次數(shù)不可過(guò)少。 清洗操作：1、采集血液樣品。 2、低速短時(shí)間離心(速度越高，時(shí)間越長(zhǎng)，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等越沉淀，得不到分離的效果) 3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。 4、鹽水洗滌：用5倍體積質(zhì)量分率為0.9%的氯化鈉溶液洗滌。 5、低速離心(低速短時(shí)間) 6、4、5的步驟重復(fù)3次，顯示上清沒(méi)有黃色，顯示清洗干凈。 (2)血紅蛋白

17、釋放：將蒸餾水加入原來(lái)的血液體積中，加入40%的甲苯，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘(加速細(xì)胞破裂)，細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白。 (3)分離血紅蛋白溶液：過(guò)程：將攪拌的混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。 試管中的溶液水平：第1層(最上層):甲苯層(無(wú)色透明)第2層(中上層):脂溶性物質(zhì)沉淀層(白色薄層固體)第3層(中下層):血紅蛋白的水溶液層(紅色透明液體)第4層(最下層):雜質(zhì)沉淀層(暗紅色)。 分離：用濾紙過(guò)濾，去除脂溶性沉淀層，在分液漏斗上靜置一會(huì)兒后，分離下層的紅色透明液體。 二、實(shí)驗(yàn)操作、甲苯層(無(wú)色透明)、白色薄層固體、紅色透明液體、雜質(zhì)沉淀層(暗紅色)、試管中溶液層、(4)透析：過(guò)程：將1ml血紅蛋白溶液放入