1、.DNA聚合酶的定義 發(fā)布時(shí)間： 2010-6-3 瀏覽次數(shù)： 775 次DNA聚合酶的定義DNA聚合酶（DNA polymerase）是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5端點(diǎn)開始復(fù)制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。 真核細(xì)胞有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶（定位于胞核，參與復(fù)制引發(fā)具53外切酶活性），（定位于核內(nèi)，參與修復(fù)，具53外切酶活性），（定位于線粒體，參與線粒體復(fù)制具53和35外切活性），（定位核，參與復(fù)制，具有35和53外切活性），（定位于核，參與損傷修復(fù)

2、，具有35和53外切活性）。原核細(xì)胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關(guān)。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA 的延長；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；DNA聚合酶III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長的主要酶。DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事們就想到DNA的復(fù)制必然是一種酶的催化作用，于是決心分離出這種酶并研究其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制。為了達(dá)到這個(gè)目的，他們分離的蛋白，然后加到體外合成系統(tǒng)中即同位素標(biāo)記的dNTP、Mg2及模板DNA，經(jīng)過大量的工作，于1956年終于發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶（DNA polymerase ，D

3、NA pol ）原來稱為Kornberg酶。以后又相續(xù)發(fā)現(xiàn)了DNA pol 和DNA pol 。開始人們以為DNA pol I是細(xì)菌中DNA復(fù)制主要的酶類，后來發(fā)現(xiàn)DNA pol 的突變株照樣可以復(fù)制，才清楚它并不是主角?，F(xiàn)在已經(jīng)知道在DNA復(fù)制中起主導(dǎo)作用的是DNA pol ，至于pol 的功能現(xiàn)在還不十分清楚。DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外還有其它功能。所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3OH上加核苷酸使鏈延伸，其速率為1000 Nt/min。加什么核

4、苷酸是根據(jù)和模板鏈上的堿基互補(bǔ)的原則而定的。E.coli的DNA pol 涉及DNA損傷修復(fù)，在半保留復(fù)制中起輔助的作用。DNA pol 在修復(fù)損傷中也是有重要的作用。DNA pol 是一種多亞基的蛋白。在DNA新鏈的從頭合成（de novo）中起復(fù)制酶的作用。DNA聚合酶的共性此酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，以后陸續(xù)在其他原核生物及微生物中找到。這類酶的共同性質(zhì)是:1以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;2需要模板和引物的存在;3不能起始合成新的DNA鏈;4催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3-OH末端;5催化DNA合成的方向是53。下面首先介紹大腸桿菌的DNA聚合酶，然后簡略說明一

5、下其他原核生物的DNA聚合酶和真核生物DNA聚合酶。功能1聚合作用:在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個(gè)將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3-5外切酶活性位點(diǎn)所識別并切除之。235外切酶活性校對作用:這種酶活性的主要功能是從35方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有反應(yīng)底物dNTP時(shí)，

6、由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被35外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3末端與模板發(fā)生分離的機(jī)會更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNA的合成。由此推論，35外切酶活性的主要功能是校對作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補(bǔ)而游離時(shí)則被35外切酶切除，以便重新在這個(gè)位置上聚合對應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實(shí)性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的35外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T

7、4DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實(shí)性好，變異率低?？梢姡?5外切酶活性對DNA復(fù)制真實(shí)性的維持是十分重要的。353外切酶活性切除修復(fù)作用:53外切酶活性就是從53方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是53。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。4焦磷酸解作用:DNApol的這種活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是

8、無機(jī)焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA5焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。DNApol的DNA聚合酶活性和53外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷

9、酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApoI能從切口開始合成新的NDA鏈，同時(shí)切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。盡管DNApol是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下:1純化的DNApol催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內(nèi)DNA合成速率要比此高二倍數(shù)量級;2大腸桿菌的一個(gè)突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復(fù)制不正常;3而在另一些突變株中，DNApol的活力中只是野生型的1%，

10、但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在DNA修復(fù)中起著重要的作用。大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)這是1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)。(1)理化性質(zhì)：純化的DNApol由一條多肽鏈組成，約含1000個(gè)氨基酸殘基，MW（分子量）為109KD。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)-SH基。通過二個(gè)酶分子上的-SH基與Hg2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個(gè)酶分子中含有一個(gè)Zn2+

11、，在DNA聚合反應(yīng)起著很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中含有約400個(gè)分子，每個(gè)分子每分鐘在37下能催化667個(gè)核苷酸摻入正在生長的DNA鏈。經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個(gè)片段，大片段分子量為76KD，通常稱為Klenow片段，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。在無模板和引物時(shí)還可以從頭合成同聚物或異聚物。DNAPol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個(gè)約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn):1模板DNA結(jié)合位點(diǎn);2DNA生長鏈

12、或引物結(jié)合位點(diǎn);3引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專一引物或DNA生長鏈的3-OH;4脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn);553外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長鏈前方的5-端脫氧核苷酸并切除之;635外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的3-端核苷酸。2、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApol不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了DNApol。此酶MW為120KD，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNApol的5%。該酶的催化特性如下：(1)聚合作用:該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板

13、是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長于100個(gè)核苷酸。對于較長的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白(SSBP)可以提高其聚合速率，可達(dá)原來的50-100倍?；钚?，但無53外切酶活性。 (3)該酶對作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。(4)該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因?yàn)榇嗣溉毕莸拇竽c桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常。可能在DNA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。3、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA pol 全酶由多種亞基組成(見下表)，而且容易分解。大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中只有10-20個(gè)酶分子，因此不易獲得純

14、品，為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來了許多困難。直到不久前，才對其性質(zhì)和功能有所了解，但每個(gè)亞基的具體作用扔不十分清楚。盡管該酶在細(xì)胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶的15倍和30倍。該酶對模板的要求與DNA聚合酶相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApol也有35和53外切酶活性，但是35外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA，只產(chǎn)生5-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3端開始切除一個(gè)核苷酸。53外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DN

15、A聚合酶是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內(nèi)是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。DNA聚合酶的組成亞基 分子量(103) 其它名稱a 140 dnaE蛋白，polC蛋白 25 10 83 52 dnaZ蛋白 32 dnaX蛋白 40 dnaN蛋白，copol大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性功能 pol pol pol聚合作用53 + + +外切酶活性35 + + +外切酶活性53 + - +焦磷酸解和焦磷酸交換作用 + - +模板及引物的選擇完整的DNA雙

16、鏈 - - -帶引物的長單鏈DNA + - -帶缺口的雙鏈DNA + - -雙鏈而有間障的DNA + + +一般性質(zhì)分子量 1 09KD 120KD 140KD每細(xì)胞中的分子量 400 17-100 10-20結(jié)構(gòu)基因 polA polB polCT4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年來在枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏桿菌等細(xì)胞及噬菌體T4、T5、T7中分離到NDA聚合酶，這里只介紹T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個(gè)半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿菌DNApol不同;1它無53外

17、切酶活性;2它需要一條有引物的單鏈DNA作模板。在有缺口的雙鏈DNA作模板時(shí)，需要有基因32蛋白的輔助(基因32蛋白在T4DNA復(fù)制中的作用和大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白的作用相似，基因32蛋白在復(fù)制叉處和單鏈DNA結(jié)合后可以促進(jìn)雙鏈的進(jìn)一步打開，并保持其單鏈狀態(tài)有利于新生鏈的合成);它利用單鏈DNA為模板進(jìn)，可同時(shí)利用它作為引物，即此單鏈DNA的3端能環(huán)繞其本身的某一順序形成氫鍵配對，3端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的35外切酶活性切去，然后在其作用下從3-OH端開始聚合，合成該模板DNA的互補(bǔ)鏈，再以互補(bǔ)鏈為模板合成原來的單鏈DNA。真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具

18、有幾種DNA聚合酶，但這些聚合酶都沒有35或53外切酶活性。其聚合反應(yīng)機(jī)制與原核生物的聚合一樣。主要的酶(占總量的80-90%)是DNA聚合酶，分子量為300KD，含有4個(gè)或5個(gè)亞基，主要負(fù)責(zé)染色體DNA的復(fù)制。DNA聚合酶，分子量為45KD，僅含有一條鏈，主要作用是修復(fù)核內(nèi)DNA。第三種聚合酶，分子量為140KD，存在于線粒體內(nèi)，負(fù)責(zé)催化線粒體DNA的復(fù)制。最近從兔的骨髓細(xì)胞質(zhì)中分離到一種新的DNA聚合酶，這種酶與上述真核生物的DNA聚合酶不同，而與原核生物的聚合酶類似，具有35核酸外切酶活性，稱為DNA聚合酶。另外，從酵母、原蟲等低真核生物中分離到一些DNA聚合酶。一般來說，這些低等生物都

19、沒有低分子量的DNA聚合酶，而且與原核生物的DNA聚合酶相似，有35外切酶活性。實(shí)驗(yàn)室常用的耐熱DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5-3聚合酶活性，但不一定具有3-5和5-3的外切酶活性。3-5外切酶活性可以消除錯(cuò)配，切平末端；5-3外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類：一、普通耐熱DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達(dá)200,000單位/mg。具有5-3外切酶活性，但不具有3-5外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯(cuò)配沒有校正功能。TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3突出的單A核苷酸尾；另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將平端的質(zhì)粒的3端加