1、.,1,第八章：PCR技術(shù)及應(yīng)用,PCR技術(shù)是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的的方式，在體外選擇性的將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)。其過程與普通DNA復(fù)制一樣有三個(gè)步驟，首先是模板DNA變性，由雙鏈狀態(tài)變成單鏈狀態(tài);然后引物與模板結(jié)合，完成復(fù)制過程；最后在DNA聚合酶和底物存在情況下合成與模板互補(bǔ)的DNA。,.,2,第一節(jié) PCR技術(shù)原理和工作方式,一、PCR的基本原理 1、基本要素和擴(kuò)增原理 DNA的復(fù)制是生命活動(dòng)中最基本的過程之一，PCR的基本原理離不開DNA復(fù)制的基本規(guī)律。在PCR過程中模板可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，最后擴(kuò)增出來的是雙鏈狀態(tài)的。其中引物是DNA復(fù)制中不可缺少的。,.,3,

2、與單純的DNA復(fù)制不同的是，PCR擴(kuò)增總是在兩個(gè)引物的存在下對(duì)DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制的結(jié)果得到一條雙鏈DNA。通過儀器的自動(dòng)控制，使這樣的DNA復(fù)制重復(fù)進(jìn)行，從而得到大量的位于兩個(gè)引物之間的DNA片段，即目的片段。前一輪擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物可做下一輪擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增產(chǎn)物以幾何級(jí)別遞增。,.,4,2、PCR擴(kuò)增的步驟 首先將模板DNA置于9296度進(jìn)行變性處理，使雙鏈DNA在高溫下解鏈成為單鏈DNA此時(shí)的溫度稱為解鏈溫度Tm，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)；染后退火，將溫度降至3772度，使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，最后在72度條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3羥基端合成DNA這個(gè)

3、步驟稱為延伸。這三個(gè)熱反應(yīng)過程的重復(fù)性稱為一個(gè)循環(huán)經(jīng)過2040個(gè)循環(huán)可擴(kuò)增得到大量位于兩條引物序列之間的DNA片段。,.,5,Tm (melting temperature)：50%DNA分子變性時(shí)溫度稱為熔解溫度/解鏈溫度。 一般生理?xiàng)l件下，Tm在85 -95之間。影響Tm值的因素： （G+C）含量增加，Tm值增高 溶液的離子強(qiáng)度高，則Tm增加（離子鍵的形成增多）； 甲酰胺的濃度增加，則Tm下降（使堿基對(duì)間的氫鍵不穩(wěn)定，可避免G、C含量高的DNA在高溫變性時(shí)引起斷裂而失活）； 若DNA組成比較單一，則變性發(fā)生在狹窄的溫度范圍內(nèi).,.,6,二、PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)需要在一定的條件下才能完

4、成，只有 這些條件協(xié)調(diào)作用時(shí)才能達(dá)到很好的效果。 1、緩沖液 2、脫氧三磷酸核苷（dNTP） 3、引物 4、模板 5、DNA聚合酶,.,7,1、 緩沖液： 緩沖液除了提供pH緩沖能力外，還有一些輔助反應(yīng)進(jìn)行的成分，主要是Mg2+。 Mg2+濃度的高低會(huì)影響擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)率，直接影響擴(kuò)增的成敗，最佳的鎂離子濃度對(duì)于不同的引物對(duì)和模板都不同。為了確定最佳濃度, 可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的Mg2+濃度。 2、脫氧三磷酸核苷 （dNTP） 脫氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高濃度dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。四種脫氧三磷酸核

5、苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。 PCR中常用終濃度為200M的dNTP,.,8,3、模板 模板是將要被復(fù)制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是PCR 的關(guān)鍵，模板的質(zhì)量是PCR 成功的先決條件，一般要有較高的純度，最好用純化的DNA樣品，（粗品應(yīng)避免混有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的數(shù)量也會(huì)直接影響擴(kuò)增的效果，一般要求含量合適，3105分子數(shù)（1g）（提高產(chǎn)量，減少非特異性擴(kuò)增）； 4、DNA聚合酶 PCR反應(yīng)中使用的DNA聚合酶是耐高溫的，在90度以上的高溫下仍能有活性。也正是高溫DNA

6、聚合酶的應(yīng)用才使得PCR技術(shù)得以推廣。選擇聚合酶要從實(shí)驗(yàn)的具體要求考慮，高保真的酶成本較高，只有要求嚴(yán)格時(shí)選用。,.,9,Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因?yàn)槠淙鄙?到5外切核酸酶（校正）活性，但是產(chǎn)量高，是目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最多的酶。使用帶有3到5外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶可以提高保真度。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。 (1)Taq DNA聚合酶 是目前實(shí)驗(yàn)室PCR中應(yīng)用最多的酶。具有5到3合成活性和5到3外切酶活性，但無3到5外切酶活性。在95度的半衰期為40分鐘。由于沒有3到5外切酶活性，在擴(kuò)增中有8.910-51.110-4的錯(cuò)配率。,.,10,（2）Tth

7、DNA聚合酶 來自嗜熱熱細(xì)菌HB8在74度下進(jìn)行擴(kuò)增Mg+存在條件下，以DNA為模板合成DNA，Mncl2存在下可以RNA為模板合成cDNA。 （3）VentDNA聚合酶 （4）pwoDNA聚合酶 是使用較多具有3到5外切酶活性且具有高保真度的PCR酶 （5）pfuDNA聚合酶 是目前使用最廣范具有3到5外切酶活性的PCR酶商用混合酶,.,11,學(xué)習(xí)本節(jié)課我們應(yīng)該掌握以下問題,1.簡述PCR反應(yīng)的工作原理。 是在模板DNA、引物和dNTP的存在下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。由一對(duì)引物介導(dǎo),通過溫度的調(diào)節(jié)，使雙鏈DNA變性為單鏈DNA、單鏈DNA能與引物復(fù)性（退火）成為引物-DNA單鏈復(fù)合物、

8、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA（引物的延伸）；這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程，就是一個(gè)PCR循環(huán)；,.,12,2.循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？ 很明顯不是的，任何事都要有一個(gè)度。 一般循環(huán)在25到30次之間爾后循環(huán)數(shù)的進(jìn)一步增加并不意味著產(chǎn)物的數(shù)量一定增加這是由于PCR擴(kuò)增過程中后期會(huì)出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)，這時(shí)期產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長這時(shí)一些不利因素也會(huì)產(chǎn)生：如底物和引物濃度降低、dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低、產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)產(chǎn)生末端產(chǎn)物抑制作用、非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體會(huì)產(chǎn)生非特異性競爭、擴(kuò)增產(chǎn)物的自身復(fù)性、高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底,.,13,3

9、. 進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些原則? (1)長度： 16-30bp ，一對(duì)引物。 過短-非特異性擴(kuò)增增加，竟?fàn)幉⒁种铺禺悢U(kuò)增， 從而降低擴(kuò)增的靈敏性； 過長-易形成穩(wěn)定的雜合體或鏈內(nèi)互補(bǔ)，使引物的延伸溫度超過Taq酶的最適溫度，同時(shí)還使檢測成本增加。 (2)G+C含量：占40-60%，Tm值在55 以上。 GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性； GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。,.,14,(3)堿基的隨機(jī)分布： 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。 3末端最佳選擇為G 和C；但不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。但現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，在3端盡可能選用T，少用G或C，這樣可更好的避免假引發(fā)。（錯(cuò)配率： T G或C A ） (4)引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列 引物自身和引物之間不能有連續(xù)3個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物自身存在互補(bǔ)序列，會(huì)使引物自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使引物本身復(fù)性，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。 兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體的形成。