1、2020/6/21,體內藥物分析,1,體內藥物分析,Biopharmaceutical analysis,Chap.5,2020/6/21,體內藥物分析,2,第一節(jié) 體內藥物分析概述, 藥物分析的重要分支學科 研究生物機體中外源性藥物及其代謝物 和內源性活性物質的質與量的變化規(guī)律 綜合性較強的應用學科分析方法學 治療藥物監(jiān)測研究的重要的實驗手段,2020/6/21,體內藥物分析,3,藥物進入體內后 經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄等動力學過程 化學結構和存在狀態(tài)都可能發(fā)生變化 在不同個體中存在差異（個體差異） 進而直接影響到藥物在不同個體中的治療效應和毒副作用,需對生物體內藥物及其代謝物進行研究分析

2、,2020/6/21,體內藥物分析,4,狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對人和動物血液、尿和組織等樣品進行定性定量的分析 廣義：通過體內藥物濃度的分析，了解藥物在體內的數(shù)量和質量的變化，獲得藥代動力學參數(shù)，為藥品的生產(chǎn)、臨床應用作出評價,體內藥物分析的定義,2020/6/21,體內藥物分析,5,一 體內藥物分析的性質,體內藥物分析是一門研究生物機體中藥物及其代謝物和內源性物質的質與量變化規(guī)律的分析方法學 在探求科學用藥規(guī)律與安全、有效、合理用藥，在開發(fā)新藥、保障健康長壽方面具有重要作用,2020/6/21,體內藥物分析,6,二 體內藥物分析的作用和意義,通過檢測人（或動物）的體液或組織（生物樣

3、本）中的藥物或特定代謝物的濃度，為臨床藥學研究提供必要的數(shù)據(jù)和相關信息,2020/6/21,體內藥物分析,7,（一）在新藥評價 和開發(fā)中的意義 大量事實證明，如無臨床藥理學和臨床藥學研究給新藥以確切的評價，要做到臨床安全、合理、有效地用藥將會遇到許多困難。因此，加強藥物在生物樣品內作用機理的研究，以了解和闡明藥物藥物結構、理化性質、劑型及生產(chǎn)工藝與藥物療效等關系，已成為評價藥品質量的重要內容和依據(jù)。,體內藥物分析的意義,2020/6/21,體內藥物分析,8,1全面質量控制 2新藥報批 3為設計新藥提供信息 從代謝產(chǎn)物中開發(fā)新藥 保泰松羥基保泰松（作用強、副作用?。?非那西丁撲熱息痛 前藥設計

4、新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等 以上內容必須通過測定體內藥物濃度得以解決,2020/6/21,體內藥物分析,9,（二）臨床合理用藥中的意義 1血藥濃度與藥理作用 2. 影響血藥濃度的因素 （1）機體因素 a生理因素 年齡、性別、生理狀況 b病理因素 c遺傳因素 （2）藥物因素 a劑型因素（生物利用度問題） b藥物合并使用（酶抑、酶促） c時間因素,2020/6/21,體內藥物分析,10,（三）藥物中毒解救的意義 藥物中毒的診斷和治療方案的確立 （四）興奮劑檢測的意義 包括麻醉藥精神藥品濫用，吸毒及運動員違禁藥品檢測,2020/6/21,體內藥物分析,11,3從樣品的來源分,1從分析物分,母體

5、藥物 代謝物 內源性物質,2從生物樣品種類分,均勻樣品 非均勻樣品,人體 實驗動物,三 體內藥物分析的對象,2020/6/21,體內藥物分析,12,體內藥物分析的對象,研究對象 評價藥物的安全性（臨床前研究）動物 評價藥物的有效性（臨床研究）人體（健康志愿者或患者） 用藥的安全、有效與合理人體（患者TDM ） 具體檢材 生物體的各種器官、組織和體液等,2020/6/21,體內藥物分析,13,四 體內藥物分析的任務,1. 分析方法學的研究和完善 提供靈敏、專屬、準確可靠的分析方法與最佳的分析條件（首要任務）,2020/6/21,體內藥物分析,14,2. 治療藥物監(jiān)測 TDM，therapeuti

6、cal Drug Monitoring,只有具有明確治療范圍，血藥濃度和藥效關系密切，且具有下列情況者，要求進行藥濃檢測： 有效血藥濃度范圍窄，劑量小，毒性大的藥物； 藥代動力學個體差異大、藥理作用強、不易估計給藥后的血藥濃度藥物；,2020/6/21,體內藥物分析,15,藥物的毒性反應與該藥治療的疾病癥狀相似，難以判斷是劑量不足還是藥物毒性所致； 聯(lián)合用藥時，由于藥物相互作用產(chǎn)生不良反應，需要調整藥物劑量者； 在短期內難于判斷療效的藥物，預測藥物能否達到預防效果； 判斷患者用藥的依從性等要求進行藥物濃度檢測。,TDM,2020/6/21,體內藥物分析,16,3. 藥代動力學的研究 藥物動力學

7、參數(shù)、生物利用度及血漿蛋白結合率等基本數(shù)據(jù) 為新藥研究、老藥再評價、TDM、藥物濫用、司法鑒定等提供準確的體內藥物濃度數(shù)據(jù)和合理解釋 4. 代謝分型的應用 5. 內源性物質測定 為某些疾病的診斷及治療提供重要信息,2020/6/21,體內藥物分析,17,五 體內藥物分析的特點,由分析對象的特點所決定 1干擾物質多，樣品一般均需經(jīng)過分離、凈化后才能進行分析 生物樣品中含有大量的內源性物質，如蛋白質、脂肪等，以及代謝物、結合物等干擾分析 2樣品量少、不能重復取樣 生物樣品多數(shù)在特定條件下采集，無法再次取樣，且濃度低、變化幅度大 測定前需濃縮、富集以適應分析方法要求,2020/6/21,體內藥物分析

8、,18,3被測藥物和代謝物的濃度或活性極低 對方法的靈敏度及專屬性要求較高 4要求分析方法簡便、快速 藥物濃度監(jiān)測和藥物濫用及毒物分析中 5. 工作量較大，隨著工作的深入開展，會成倍地甚或按指數(shù)級數(shù) 6. 測定數(shù)據(jù)的處理和闡明有時不太容易,2020/6/21,體內藥物分析,19,六 體內藥物分析的一般步驟,分析方法建立 分析方法的驗證 體內藥物分析的實際應用,2020/6/21,體內藥物分析,20,（一）對分析方法的新要求,藥物服用的劑量越來越小、體液中藥物濃度越來越低，對體內藥物分析方法提出了新的要求： 1. 檢測方法的高靈敏度 最低檢測量10-910-7g 或10-15 10-12g 2.

9、 分離方法的高選擇性、高專屬性,2020/6/21,體內藥物分析,21,1. 色譜法 GC、HPLC、HPCE 2. 免疫分析法 RIA、EIA 3. 聯(lián)用技術 GC-MS、LC-MS,為滿足各項要求，最常用的分析方法有,2020/6/21,體內藥物分析,22,（二）體內藥物分析的常用分析方法,1. 光譜法 分光光度法、紫外光度法、熒光光度法 特點：操作簡便，所需儀器一般臨床實驗室都具備，檢測成本低，便于推廣 適于對治療血藥濃度水平較高，經(jīng)適當處理方法用光譜法能滿足臨床需要的藥物 如 阿司匹林、對乙酰氨基酚、氨茶堿、苯妥英鈉、苯巴比妥鈉等,2020/6/21,體內藥物分析,23,氣相色譜法(G

10、C)和高效液相色譜法(HPLC) 特點： 特異性、靈敏度和重復性均好，并可一次同時完成同一樣本中多種藥物及其代謝物檢測 聯(lián)用技術 如 GC-質譜、HPLC-質譜聯(lián)機檢測，更拓展了這類分析手段的性能,2. 色譜法,2020/6/21,體內藥物分析,24,3. 免疫化學法,主要有放射免疫法(RIA)、熒光免疫法(FIA)和酶免疫法(EIA) 根據(jù)抗原-抗體反應的特異性，應用免疫化學法檢測半抗原或抗原性藥物， TDM應用的免疫化學法一般都采用競爭性免疫分析 只有具備完全或半抗原性的藥物，并能制備特異性抗體，才可用免疫化學法進行TDM,2020/6/21,體內藥物分析,25,特點： 免疫化學法靈敏度極

11、高，大多可達ng甚至pg檢測水平，可滿足所有藥物TDM的要求；所需標本量少，預處理及測定操作簡便，并可制成商品化試劑盒；可利用一般生化、熒光自動分析儀進行自動化操作 在體內幾乎不發(fā)生代謝轉化而以原型排泄的藥物，較少代謝物干擾，尤其適用于免疫法檢測，如 慶大霉素等氨基甙類抗生素,2020/6/21,體內藥物分析,26,在體藥物分析示意圖,微透析系統(tǒng),2020/6/21,體內藥物分析,27,治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM ）是自本世紀60年代起，在臨床藥理學、藥代動力學和臨床化學基礎上，結合現(xiàn)代分析檢測技術，形成和發(fā)展的一門應用性邊緣學科,第二節(jié) 治療

12、藥物監(jiān)測,2020/6/21,體內藥物分析,28,TDM 對臨床藥物治療的指導，主要是指設計或調整合理的給藥方案，同時為藥物過量中毒的診斷和處理提供有價值的實驗依據(jù) 近年來國外又將其統(tǒng)稱為臨床藥代動力學監(jiān)測（Clinical Pharmacokinetic Mornitoring, CPM ）,2020/6/21,體內藥物分析,29,通過靈敏可靠的方法，檢測病人血液或體液中的藥物濃度，獲取有關藥動學參數(shù)，應用藥代動力學理論，指導臨床合理用藥方案的制定和調整，以及藥物中毒的診斷和治療，以保證藥物治療的有效性和安全性，實現(xiàn)合理的給藥方案個體化,一 治療藥物監(jiān)測的主要任務,2020/6/21,體內藥

13、物分析,30, 治療藥物監(jiān)測的核心目的是實現(xiàn)合理的給藥方案個體化 協(xié)助診斷和處理藥物過量中毒，及進行其臨床藥理學研究 了解患者是否遵醫(yī)囑用藥，提高用藥依從性,二 治療藥物監(jiān)測的目的,2020/6/21,體內藥物分析,31, 血藥濃度結果用于調整劑量，設計個體化給藥方案 一般只監(jiān)測一次血藥濃度，不測藥物經(jīng)時變化濃度 監(jiān)測方法要求快速、簡便、準確，以適應臨床需求,治療藥物監(jiān)測與臨床藥代動力學研究的區(qū)別,2020/6/21,體內藥物分析,32,治療藥物監(jiān)測（TDM ）利用各種分析技術測定血漿或組織中藥物的濃度，并根據(jù)藥代動力學的原理和公式來指導個體化給藥方案，以提高療效，避免或減少毒副作用的發(fā)生；為

14、藥物過量中毒的診斷和處理提供實驗室依據(jù),三 治療藥物監(jiān)測的意義,2020/6/21,體內藥物分析,33,據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）及我國衛(wèi)生部藥物不良反應監(jiān)測中心的統(tǒng)計資料均顯示，因用藥不當而致死者遠遠高于同期死于各種傳染病的人數(shù)。而用藥不當死亡者中，大多是劑量不當所致。 隨著醫(yī)療技術整體水平的提高，在TDM 指導下制定和調整個體化的合理用藥方案，是藥物治療學發(fā)展的必然趨勢,2020/6/21,體內藥物分析,34,臨床治療中的常規(guī)血藥濃度監(jiān)測是指測定規(guī)律服用某藥物 5 個半衰期后已達穩(wěn)定的血藥濃度,用一般劑量或超過一般劑量仍不能控制病情時，通過監(jiān)測可以了解病人是否規(guī)律用藥、代謝率是否加快、有無耐

15、藥現(xiàn)象等,四 何時需要進行治療藥物監(jiān)測,2020/6/21,體內藥物分析,35,聯(lián)合應用藥物，有可能影響藥物代謝時或需要了解藥物間的相互作用時 伴發(fā)其他疾病(如肝、腎、胃、腸道疾病和低蛋白血癥)時,藥物的有效血藥濃度范圍狹窄（代表藥物地高辛、奎尼丁等），在臨床上不易區(qū)分毒性反應和確定劑量時，特別是有效量和中毒量接近的藥物，通過測定可以及時調整藥量,2020/6/21,體內藥物分析,36,某些藥物的毒副作用表現(xiàn)與某些疾病本身的癥狀相似，不能明確辯別時（如地高辛、速尿等）,長期用藥的患者，依從性差；或產(chǎn)生耐藥性； 以及原因不明的藥效變化時 出現(xiàn)特殊的癥狀和反應，懷疑是藥物中毒時,2020/6/21

16、,體內藥物分析,37,以下情況下無需TDM監(jiān)測,藥物本身具有客觀有效的效應指標時 血藥濃度不能預測藥理作用強度時 有效血藥濃度范圍寬的藥物，一般也不需要做 TDM,2020/6/21,體內藥物分析,38,患者接受監(jiān)測品種的藥物治療時，是否需要監(jiān)測血藥濃度，應根據(jù)臨床具體情況判斷。藥師應協(xié)助臨床嚴格把握TDM適應癥，避免不必要的TDM申請,五 進行治療藥物監(jiān)測應注意的問題,1 嚴格把握TDM適應癥，避免不必要的血藥濃度測定,2020/6/21,體內藥物分析,39,2快速提供準確的血藥濃度測定結果 3直接面對臨床開展TDM工作 藥師往往同時承擔實驗室技術人員、臨床藥師的雙重任務，在做好實驗室工作的

17、同時，應深入臨床，開展血藥濃度的解釋、利用工作 4 具體工作中熟練運用專業(yè)技能,2020/6/21,體內藥物分析,40,六 監(jiān)測的藥物種類,1）強心苷類 2）抗心律失常藥 3）抗癲癇藥 4）三環(huán)類抗抑郁藥、抗狂躁藥 5）抗哮喘藥 6）氨基糖苷類及其他抗生素、抗腫瘤藥 7）免疫抑制劑及抗風濕藥等 需要指出的是，濫用TDM 將造成不必要的浪費，應根據(jù)監(jiān)測的原則和臨床指征，確定有無必要進行常規(guī)化監(jiān)測,2020/6/21,體內藥物分析,41,需進行TDM的主要藥物,2020/6/21,體內藥物分析,42,七 治療藥物監(jiān)測與體內藥物分析的關系,治療藥物監(jiān)測的要求促進了體內藥物分析學科的發(fā)展 體內藥物分析

18、學為治療藥物監(jiān)測提供分析方法和技術支持 體內藥物分析的發(fā)展和技術進步反過來促進了治療藥物監(jiān)測的發(fā)展和完善,2020/6/21,體內藥物分析,43,一、生物樣品的種類、采集和制備,血液(血漿、血清)體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關系 最常用的生物樣本,第三節(jié) 生物樣品的預處理,2020/6/21,體內藥物分析,44,（一）樣品的采集,1血樣 血樣濃度與作用點的濃度密切相關，可以反映靶器官的濃度。,血細胞,血漿（plasma）,血小板,血清（serum）,血細胞,測定血樣中平均分布于細胞內和細胞外的藥濃,抗凝,自然,全血,血液,2020/6/21,體內藥物分析,45,血樣主要應用于： 藥物動力學 生

19、物利用度 臨床治療藥物濃度監(jiān)測,第三章 生物樣品與樣品制備 第一節(jié) 生物樣品的種類采集,血樣的應用,2020/6/21,體內藥物分析,46,2尿樣 目的：藥物劑量回收，藥物清除率，生物利用度和，預測藥物代謝過程、類型 體內藥物清除主要是通過尿液排出，藥物以原型、相及相代謝物等多種形式排出 特點：濃度高，易于收集，體內代謝研究，應水解分離,2020/6/21,體內藥物分析,47,3唾液 一些藥物的唾液藥濃(S)與血漿游離藥濃(P)密切相關，因此： TDM中利用對S的測定代替對P的監(jiān)測 藥代動力學的研究 收集方法 離心 收集,2020/6/21,體內藥物分析,48,（二）樣品的貯藏,1血樣（血漿、

20、血清）及時分離冷藏， -70加入穩(wěn)定劑NaF 2尿樣 尿中水、無機鹽、尿素等細菌的生長， 4保存 加入防腐劑 a1%甲苯 b飽和氯仿 cpH改變 3唾液：同血樣,2020/6/21,體內藥物分析,49,二、生物樣品的預處理,（一）預處理的目的 存在形式的多樣性 游離 結合 代謝物 濃度低，雜質多（分離濃縮） 出現(xiàn)渾濁和沉淀 與試劑起反應 影響色譜柱壽命,2020/6/21,體內藥物分析,50,（二）處理方法選擇的一般原則,1藥物理化性質 pKa 親脂性 揮發(fā)性 溶解度 光譜特征 穩(wěn)定性 2濃度范圍 靈敏的方法 3測定的目的 定性 定量 母體 代謝 4生物樣品的種類 5樣品處理與分析方法的選擇

21、專一性 靈敏性,2020/6/21,體內藥物分析,51,（三）生物樣品去蛋白處理,1加入與水能混溶的有機溶劑及中性鹽 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl 2加入酸性沉淀劑 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白質分子的陽離子形成不溶性鹽而，pH低于等電點,2020/6/21,體內藥物分析,52,3組織酶消化法 加入酶使蛋白質水解 優(yōu)點：平衡條件下進行，可避免反應和降解 可改善對蛋白結合率強的藥物的回收率 不產(chǎn)生乳化 4其他 加熱 超濾,2020/6/21,體內藥物分析,53,（四）生物樣品中綴合物水解,1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 p

22、H4.5-7.0 37 3溶劑解 某些藥物的硫酸酯，往往加入率取溶劑時發(fā)生分解，同時提取有機溶劑中,2020/6/21,體內藥物分析,54,（五）生物樣品的萃取,1液-液萃取 （1）優(yōu)點：與雜質分離 簡便 濃集 提取率高 （2）提取率：在有機相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對生物樣品一般一次萃取， 70%重現(xiàn)性,2020/6/21,體內藥物分析,55,（3）影響提取率的因素 pH 堿性藥物在堿性pH 酸性 酸性pH 提取溶劑 相似相溶原理 沸點低，不影響檢測,性質穩(wěn)定，不起化學反應 離子強度 加入中性鹽 增加離子強度，與水結合強，便于有機溶劑提取,2020/6/21,體內藥物分

23、析,56,（4）離子對提取,對于離子性特強，水溶性極大的藥物，可采用離子對提取 原理 應用 陰離子：COOH+ SO3H- 反離子 四丁基銨 陽離子：NH2+ 反離子烷基或芳基磺酸鹽 （5）提取技術 一般在試管中進行,有機相與水相比1:1或2:1,2020/6/21,體內藥物分析,57,（6）乳化問題 措施 輕緩振搖 含有分散度大或不溶物應過濾掉 避免在高pH條件下，從水中提取藥物 避免使用易發(fā)生乳化的溶劑 萃取劑水中加入少量NaCl,2020/6/21,體內藥物分析,58,破乳方法 機械法 加入少量高級脂肪醇 改變表面張力 改善混合溶劑比例，增加分散相分數(shù),（7）藥物的吸附 玻璃容器吸附 1

24、%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷 血漿,2020/6/21,體內藥物分析,59,2液固萃取,固相萃取solid phase extraction SPE 針管式 抽空減壓 加壓 過濾,2020/6/21,體內藥物分析,60,（1）固相萃取步驟,固相選擇 樣品1ml 1ml規(guī)格固相 125ml 3ml規(guī)格固相 固相處理 反相C18 固定相的610倍體積甲醇洗柱，使溶劑化； 610倍水緩沖服液沖洗達分離狀態(tài) 上樣 分離 用適當?shù)娜跞軇┫礈?洗去雜質，通N2干燥固相 洗脫待測物 改變pH或極性,2020/6/21,體內藥物分析,61,（2）影響固相萃取的因素, 流速 流速快，按觸不充分，樣品流失

25、回收率低 柱處理 510mlmin-1 洗脫 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg） 裝樣 過載 突破性試驗 已知濃度樣品液 小體積上柱洗脫回收百分率 加大體積洗脫回收百分率 繪圖 當回收率下降時為過載,2020/6/21,體內藥物分析,62,（六）生物樣品的組分濃集 （七） 衍生化處理 GC衍生化 HPLC衍生化,2020/6/21,體內藥物分析,63,第四節(jié) 體內藥物分析方法的建立與評價,一、分析方法,根據(jù)藥物理化性質，結構特征，藥物濃度，干擾成分大小，實驗目的,2020/6/21,體內藥物分析,64,二、分析方法的設計依據(jù),方法的建立,原始方法改進創(chuàng)新 創(chuàng)立

26、方法,2020/6/21,體內藥物分析,65,1做好文獻總結 2充分了解藥物特征及體內狀況 pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動學參數(shù)、體內代謝情況 3明確測定目的、要求 目的,藥濃監(jiān)測 藥代動力學研究 母體藥物和代謝物,4結合實驗室條件 設備條件 預處理方法,2020/6/21,體內藥物分析,66,三、分析方法的建立,1純品進行測定 確定線性范圍、靈敏度、反應條件（pH、t、T） 2空白樣品測定 確定空白樣品是否有干擾 3以水代替空白樣品，加標準液后測定 了解提取率、檢測濃度 確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等 4空白樣品加入標準液測定 標準曲線建立 回歸方程 回收率 5實驗樣品測定,20

27、20/6/21,體內藥物分析,67,四、分析方法的評價,可行性和可靠性 1準確度 accuracy 測定結果與真實性的差異 用回收率表示 接近100% 相對恒定,2020/6/21,體內藥物分析,68,絕對回收率 也稱萃取回收率、提取回收率 測定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標準液=絕對回收率 考慮3個濃度（高、中、低） 分布在標準曲線成上、中、下 一般要求絕對回收率在70% 一般方法 HPLC內標 內標法時注意：藥物與內標用各自外標法測定回收率應相近，差值10%,2020/6/21,體內藥物分析,69, 相對回收率 方法回收率 藥物系列濃度+血樣標準曲線 取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測定，與加入標準量相比，得方法回收率，測定值15%，定量限20% 注意問題： a加入藥量與實際測定值相近 b加入物與實際存在狀態(tài)相近 c空白試驗 與已確定方法進行比較,2020/6/21,體內藥物分析,70,2精密度precision,標準差SD 相對標準性偏差 RSD不大于15%