1、.1.1 問題的提出1.1.1 我國水體富營養(yǎng)化狀況我國是一個湖泊眾多的國家，大于1 km2的天然湖泊就有2300多個，湖泊面積為70988 km2，約占全國陸地總面積的0.8。湖泊總蓄水量為7077多億m31。調(diào)查結(jié)果表明：2004年七大水系的412個水質(zhì)監(jiān)測斷面中，IIII類、類和劣類水質(zhì)的斷面比例分別為41.8、30.3和27.9，七大水系主要污染指標為氨氮、五日生化需氧量、高錳酸鹽指數(shù)和石油類3。2004年監(jiān)測的27個重點湖庫中，II類水質(zhì)的湖庫2個，III類水質(zhì)的湖庫5個，類水質(zhì)的湖庫4個，類水質(zhì)湖庫6個，劣類水質(zhì)湖庫10個。其中，“三湖”（分別為太湖、巢湖和滇池）水質(zhì)因總氮和總磷濃

2、度高而均為劣類。太湖水質(zhì)與上年比有所改善，但仍處于中度富營養(yǎng)化狀態(tài)。滇池的草海屬于中度富營養(yǎng)化，外海屬重度富營養(yǎng)化。巢湖水質(zhì)屬中度富營養(yǎng)化。對于海洋環(huán)境，2004年全海域共發(fā)現(xiàn)赤潮96次，較上年減少23次。赤潮累計發(fā)生面積266630平方公里，較上年增加83.0，其中，大面積赤潮集中在東海。目前，水體的富營養(yǎng)化已經(jīng)成為我國最為突出的環(huán)境問題之一。許多大型湖泊，如巢湖、太湖、鄱陽湖、滇池和西湖等，都已經(jīng)處于富營養(yǎng)或重度富營養(yǎng)化狀態(tài)。而且一些河流在部分河段也出現(xiàn)了富營養(yǎng)化現(xiàn)象，如黃浦江流域、珠江廣州河段等。據(jù)統(tǒng)計，我國主要湖泊處于因氮、磷污染而導(dǎo)致富營養(yǎng)化的占統(tǒng)計湖泊的564。因此，如何治理富營養(yǎng)

3、化的水體，減少其中的營養(yǎng)物質(zhì)的含量，回復(fù)水體的綜合功能，已成為當前全球性的環(huán)境問題的研究熱點5。1.1.2 富營養(yǎng)化水體的微生物治理針對水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象，其水質(zhì)改善及對策包括三個大的方面：污染源控制對策、水體生態(tài)修復(fù)對策以及應(yīng)急除藻對策6-8。水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵與核心是生物多樣性的破壞，其典型表現(xiàn)就是富營養(yǎng)化水體發(fā)生藻類“水華”現(xiàn)象9。因此，從保護和恢復(fù)生物多樣性入手，引入微生物、植物和動物，尤其是關(guān)鍵物種，重建食物鏈結(jié)構(gòu)，是恢復(fù)水體正常的主要手段之一10-12。為此經(jīng)常用到的技術(shù)措施包括：以藻控藻，投加細菌微生物13、放養(yǎng)魚類14，恢復(fù)與構(gòu)建水生植被15,16等。利用微生物種群的新陳代謝活動

4、對富營養(yǎng)化水體中的有機污染物、氨氮和有機氮等進行去除，尤其是氮污染物的去除，主要需要建立硝化反硝化體系。而在自然界中，原本存在有專門從事硝化反硝化過程中的微生物種群。但是由于某些微生物種群，如硝化細菌的代時較長，增殖速率非常低。同時，水體的人為活動的破壞。導(dǎo)致了富營養(yǎng)化水體中硝化反硝化體系的弱化甚至缺失。故針對富營養(yǎng)化水體，可采用向水體中投加復(fù)合微生物菌群，從而增強水體的生物自凈化能力，達到控制水體富營養(yǎng)化的目的，該技術(shù)被稱之為“微生物強化技術(shù)”。該技術(shù)具有費用低、見效快、無污染和方便安全等特點。復(fù)合微生物種群主要由光合細菌、硝化細菌等組成，再輔之以反硝化細菌。其中，光合細菌通過自身代謝與藻類

5、競爭性爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，并可降解、消除藻類代謝分泌于體外的多種物質(zhì)，削弱藻類的競爭力。一般的光合細菌都有固氮能力，在厭氧光照條件下固氮能力最強。光合細菌與其他細菌的混合培養(yǎng)，能夠提高其他細菌的固氮能力。另外，硝化細菌、反硝化細菌可針對水體中的有機氮和氨氮等進行降解處理。硝化細菌的生長條件是偏堿性的好氧環(huán)境。光合細菌在代謝過程中可產(chǎn)生堿性物質(zhì)，從而為硝化細菌提供了堿性環(huán)境。潘涌璋17等應(yīng)用復(fù)合微生物培養(yǎng)液和BBL1菌劑，采用投加菌液的方法對富營養(yǎng)化人工景觀湖水進行了凈化試驗，氨氮的去除率大于90。楊世平18等人利用固定化硝化細菌處理養(yǎng)殖廢水，24小時后COD去除率為74.9，氨氮去除率82.5。周康

6、群19等利用投加氨氧化菌、亞硝酸鹽氧化菌、芽孢菌和假單胞菌等于廣州市西村水廠的水源中，可降解氨氮4094.5。黃曉東20等人利用角野以聚丙烯酰胺凝膠為固定化載體，用包埋法固定硝化細菌，并以7.5的填充率將固定化細胞透入到內(nèi)循環(huán)的流化床中，對按標準活性污泥法運行、含硝化細菌極少的曝氣池活性污泥混合液進行連續(xù)處理實驗，停留時間僅為2小時，就可達到完全硝化。據(jù)Wagner M21等報道：某化工廠在采用兩步生物增強技術(shù)，投加降解硝基苯和對硝基苯的菌以及氨氧化菌后，可將出水中的NH4+-N從120 mg/L降到20 mg/L。1.2 硝化細菌的分類及研究現(xiàn)狀生物硝化作用（NH3NO2-NO3-）在地球氮

7、素循環(huán)過程中扮演著極其重要的角色。生物硝化作用主要通過硝化細菌中兩個“關(guān)鍵”共生菌群對氮素的遷移和轉(zhuǎn)化作用來實現(xiàn)，這兩個共生菌群分別是將氨氮氧化成亞硝酸鹽的氨氧化菌（ammonia-oxidizing bacteria ，AOB）和將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽的亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）22。1.2.1 硝化細菌的分類根據(jù)伯杰氏鑒定手冊第8版分類，硝化細菌統(tǒng)歸于7個屬，分別是硝化桿菌屬（Nitrobacter）、硝化刺菌屬（Nitrospina）、硝化球菌屬（Nitrococcus）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化螺菌屬（Nit

8、rosospira）、亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）和亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus），共14種。伯杰氏細菌鑒定手冊第9版中除了收錄上述7個屬外，另增加有2個屬，分別是硝化螺菌屬（Nitrospira）和亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio），總共20種。這些菌種的分布很廣，分布于土壤、湖泊及底泥和海洋等環(huán)境中23?；?6S rRNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有的自養(yǎng)型氨氧化菌系統(tǒng)發(fā)育較為單一，他們皆屬于變形菌綱（Proteobacteria）亞綱和亞綱（圖1所示）24，其中屬于亞綱的氨氧化菌又可以分為兩個類群：亞硝化單胞菌群（Nitrosomonas）和亞

9、硝化螺菌群（Nirosospira）。其中，亞硝化單胞菌群包括歐洲亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas europaea）和運動亞硝化球菌（Nitroscoccus mobilis）；亞硝化螺菌屬包括所有的屬于亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）的菌株，從進化距離上看，這3個屬可完全歸于1個屬。圖1-1 依據(jù)16SrRNA基因序列構(gòu)建的硝化作用微生物的系統(tǒng)發(fā)育25Fig. 1-1 Systematic evolution of nitrifying bacteria based on the sequ

10、ences of their 16S rRNAThe sequences of 16SrDNA were from GenBank, and accession numbers from up to down were L35503, L35504, Y14636, Y14644, L35511, L35507, M96400, M96399, M96396, M96397, M96401, M96404, L35510, and M96395與氨氧化菌不同，亞硝酸鹽氧化菌的系統(tǒng)發(fā)育則要復(fù)雜許多，Bock E等26人的研究結(jié)果表明，亞硝酸鹽氧化菌的4個屬分屬于不同的4個系統(tǒng)發(fā)育類型（圖1）。如

11、，硝化桿菌屬（Nitrobacter）屬于變形菌綱的亞綱，硝化球菌屬（Nitrococcus）屬于亞綱，硝化刺菌屬（Nitrospina）屬于亞綱、硝化螺菌屬（Nitrospira）屬于硝化螺菌門（phylum Nitrosira）。以上這些內(nèi)容充分說明了生物硝化作用中的微生物在進化上系統(tǒng)發(fā)育起源的異源性。Lipski A等27人研究了亞硝酸鹽氧化菌的脂肪酸圖譜，結(jié)果表明，亞硝酸鹽氧化菌中各屬所含的脂肪酸存在較大差異，并有各自的特征脂肪酸，所得結(jié)果與16S rRNA基因序列相似性分析的結(jié)果相吻合26。1.2.2 硝化細菌的特征1硝化細菌的自養(yǎng)性硝化細菌絕大部分種類皆為專性化能的自養(yǎng)菌，它們能夠

12、利用氨氮或者亞硝酸鹽獲得合成反應(yīng)所需的化學(xué)能。在有機培養(yǎng)基上幾乎不生長（維氏硝化桿菌除外），也不需要外源的生長因素。它們對底物的專一性很強，氨氧化菌以氨氮為底物提供能量，亞硝酸鹽氧化菌以亞硝酸鹽為底物提供能量。2生長緩慢，二均分裂28硝化細菌是化能自養(yǎng)型菌，其由自身合成糖類，這一過程需要較長的時間。因此，硝化細菌的平均代時一般都在10h以上。大多數(shù)種類為無性的二均分裂，只有維氏硝化桿菌為出芽繁殖。3好氧性硝化細菌皆為好氧生長，O2是最終的電子受體。硝化細菌正常代謝需要溶解氧，溶解氧供給不足可破壞氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌之間的生態(tài)平衡。4形態(tài)多樣性硝化細菌均為革蘭氏陰性菌，無芽孢，無莢膜。雖然生

13、理學(xué)上具有共同性，但是，同一生理亞群中的種類，其細胞形態(tài)卻多種多樣，例如，球形、桿形、螺旋形等。其細胞膜大多具有復(fù)雜的薄膜狀、囊泡狀和管狀膜內(nèi)褶結(jié)構(gòu)。DNA中GC分子百分含量范圍較窄，氨氧化菌的含量略高于亞硝酸鹽氧化菌。5分布硝化細菌對溶解氧、溫度、pH等外界環(huán)境因素的變化反應(yīng)較為靈敏，易受外界環(huán)境的影響。有些屬分布較廣，有些則較局限，如硝化球菌和硝化刺菌屬的種僅分布在海水中。1.2.3 硝化細菌的檢測方法早期對于硝化細菌的檢測是通過菌體分離、培養(yǎng)，然后形態(tài)觀察來進行的。但是，由于硝化細菌為化能無機自養(yǎng)型微生物，其生長速率十分緩慢，分離和培養(yǎng)硝化細菌的周期特別長，以硝化桿菌為例，在實驗室試驗中

14、，其最短的代時也在7h以上。而在自然環(huán)境中，絕大部分的硝化細菌由于底物、溶解氧、溫度和pH的限制，其代時更會長達幾天或者數(shù)周。同時，硝化細菌個體小，形態(tài)觀察十分困難。硝化細菌這種緩慢的生長速率嚴重的阻礙了對硝化細菌數(shù)量的檢測，同樣也使得對硝化細菌的菌群構(gòu)成和硝化動力學(xué)等方面的研究陷入困境29-31。在一個復(fù)雜的環(huán)境系統(tǒng)中，常規(guī)的硝化細菌檢測方法為MPN法32-35。此方法是建立在統(tǒng)計學(xué)基礎(chǔ)之上。然而，實施MPN法不僅耗時，而且容易對硝化細菌的數(shù)量造成低估，更不能對不同種的硝化細菌進行有效區(qū)分36,37。根據(jù)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的不同，MPN法僅僅只能對硝化細菌菌群中的一小部分進行計數(shù)。可以看出，M

15、PN法已經(jīng)不能適應(yīng)硝化細菌的研究。近20年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)、DNA測序技術(shù)以及核酸雜交和多態(tài)性技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使人們從分子水平研究硝化細菌成為可能。通過抗體或16S rRNA的寡聚核苷酸探針，復(fù)雜環(huán)境中的硝化細菌可以被檢測出來。熒光抗體技術(shù)可以被直接應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境系統(tǒng)中硝化細菌的檢測38-41。Voytek等（1995）利用嵌套引物兩步PCR擴增16S rRNA基因及熒光探針雜交法檢測了分離菌種和環(huán)境樣品中Proteobacteria亞綱的氨氧化菌42；Deni等（1995）利用16S rDNA引物特異性擴增了397bpDNA片段，對土壤中的硝化桿菌（Nitr

16、obacter）進行檢測和計數(shù)43。明鎮(zhèn)寰等利用PCR對煉化廠生物硝化池曝氣池中的硝化細菌進行檢測，大大縮短了檢測時間（整個過程大約需要6小時），而且勞動量小，靈敏度高44。但是，對于識別細胞壁上特異抗原的抗體，其首先需要分離純化得到靶細胞。盡管如此，這種抗體也僅僅只能識別極少部分的硝化細菌類別。而最近，以關(guān)鍵酶，如氨氧化還原酶和亞硝酸鹽氧化還原酶為目標的抗體已被開發(fā)成功45, 46。該技術(shù)的優(yōu)點是，其克服了抗體只能識別細胞壁上位點的問題。這種抗體技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于環(huán)境樣品中硝化細菌的檢測和關(guān)鍵酶的生理生化研究上47, 48。另外，環(huán)境樣品中的硝化細菌可以通過不同的PCR技術(shù)得以檢測，通常使

17、用16S rRNA49-50和關(guān)鍵酶51,52序列作為對象。其中，利用此原理的最為參見的方法就是熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)53 - 55。除了上述方法外，Lipski56等人研究發(fā)現(xiàn)，硝化細菌體內(nèi)的脂肪酸具有系統(tǒng)發(fā)育的多樣性，因此，可以作為硝化細菌不同種群的檢測手段。1.2.4 硝化細菌的生長代謝硝化細菌作為一種化能自養(yǎng)型微生物，其可以利用無機氮源促進生長。同時，又可通過卡爾文循環(huán)固定CO2，為生長提供碳源。但是，硝化細菌區(qū)別于純粹的化能自養(yǎng)型微生物，在生長過程中添加有機物質(zhì)可刺激細胞的生長和增值57, 58。此外，硝化桿

18、菌也可以利用丙酮酸、蟻酸鹽和醋酸鹽等作為碳源進行異養(yǎng)型代謝提供能量59。然而，整體上說，硝化細菌的這種異養(yǎng)型生長終歸是慢于自養(yǎng)型生長60, 61。另外，亞硝化單胞菌屬和硝化桿菌屬在低溶氧和缺氧環(huán)境下都可進行反硝化反應(yīng)，從而產(chǎn)生氧化一氮、氧化二氮或四氧化二氮等562- 64。而且研究表明，亞硝化單胞菌屬還可利用二氧化氮或四氧化二氮作為氧的電子供體，而不需要O265, 66。以下為氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌兩類主要硝化細菌種群的基本生化代謝情況。1.2.4.1 氨氧化菌的生長代謝氨氧化菌通過氧化氨氮為生長提供能量，此過程需要兩個關(guān)鍵酶進行催化作用，分別是氨單加氧酶（ammonia monooxyge

19、nase，AMO）和羥氨氧化還原酶（hydroxylamine oxidoreductase，HAO）。過程分為兩步進行。第一步，AMO氧化NH3為羥胺。此過程又分為兩個部分：O2經(jīng)放能還原反應(yīng)生成水；而后，其生成的能量促使NH3和氧氣作用生成中間產(chǎn)物羥胺67。第二步由羥氨氧化還原酶參與，氧化羥胺生成亞硝酸鹽。此過程亦分為幾個部分組成，具體如下：整個氧化過程，可以通過圖2反應(yīng)出來。圖 1-2 歐式亞硝化單胞菌屬的電子傳遞鏈模型AMO=氨單加氧酶；C=細胞質(zhì)；Cyt=細胞色素；HAO=羥胺氧化酶；NIR=亞硝酸鹽還原酶；P=細胞周質(zhì)；UQ=輔酶QFig. 1-2 Model of electro

20、n transport chain of NitrosomonasAMO = ammonia monooxygenase; C = cytoplasimc side og the membrane; Cyt = cytochrome; HAO = hydroxylamine oxidoreductase; NIR = nitrite reductase; P = periplasimic side of the membrane; UQ = ubiquinone1.1.3.2 亞硝酸鹽氧化菌生長的生化機制由亞硝酸氧化為硝酸鹽只需一步完成，該反應(yīng)由亞硝酸氧化酶系統(tǒng)來參與進行，電子經(jīng)細胞色素傳遞給

21、O2，再通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，過程如圖3所示。圖1-3 硝化桿菌屬的電子傳遞鏈模型C=細胞質(zhì)；Cyt=細胞色素；NOR=亞硝酸鹽氧化還原酶；P=細胞周質(zhì)；TCC=三羧酸循環(huán)；UQ=輔酶QFig. 1-3 Model of electron-transport chain of NitrobacterC = cytoplasmic side of the membrane; Cyt = cytochrome; NOR = nitrite oxidoreductase; P = periplasmic side of the membrane; TCC = tricarboxylic acid

22、 cycle; UQ = ubiquinone pool.在亞硝酸鹽氧化菌中用亞硝酸氧化酶將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽；電子通過一個極短的電子傳遞鏈（因為N03-/N02-具有高電勢）傳給終端氧化酶。細胞色素a和c參與亞硝酸氧化劑的電子傳遞，并通過細胞色素aa3的反應(yīng)產(chǎn)生一個質(zhì)子動力，最終促進ATP的形成。因為只有很少的一部分能量能被硝酸細菌利用，所以硝酸細菌的生長率更低。1.1.3.3 硝化細菌的生長速度硝化細菌與異養(yǎng)細菌的生長方式和消耗底物的類型是完全不同的。細菌的反應(yīng)動力常數(shù)與其底物的有效性有關(guān)。在處于最大活性時，它們都能消耗自身總量幾倍的底物。但硝化細菌只將少量的底物轉(zhuǎn)化為細胞成分，大部分A

23、TP用于合成NADPH，而異養(yǎng)細菌則將大量的底物轉(zhuǎn)化為新細胞68。因此，硝化細菌的生長速率相對而言緩慢得多。如Nitrosomonas在1020，pH 6.57.5的生長率為0.10d-10.61d-1，Nitrobacte為0.10 d-10.45d-1 69，比那些異養(yǎng)細菌的生長速率要慢許多。另一個重要的特性是，硝化細菌在較低底物濃度的環(huán)境中即可維持最大的反應(yīng)活性，所需的底物濃度是異養(yǎng)細菌的1%70。表1-2 氨氧化菌、亞硝酸鹽氧化菌和異養(yǎng)細菌的動力學(xué)常數(shù)Table 1-2 The kenetic parameters of AOB, NOB and heterotrophic bacte

24、ria細菌類群底物消耗速率（mg/mgd）比生長速率（/d）增長效率（mg /mg底物）飽和常數(shù)（mg/L）氨氧化菌6200.52.00.050.291亞硝酸鹽氧化菌10400.21.00.020.081異養(yǎng)型細菌203010150.40.5751251.2.5 環(huán)境因子對硝化細菌的影響 硝化細菌作為自然界氮素循環(huán)的重要組成部分，其具有不可或缺的作用。但是，由于硝化細菌本身為化能自養(yǎng)型細菌，且其代時較長等特殊性，決定了硝化細菌對環(huán)境因子即為敏感。其中，主要的影響因子如下： 1溫度溫度對硝化細菌的生長和氧化速率的影響很大。根據(jù)伯杰氏細菌鑒定手冊中所記錄，硝化細菌的最適溫度為1035范圍了，高于或

25、低于此溫度范圍，硝化細菌的生長和氧化速率都會受到極大的影響。如溫度低于10，硝化細菌的生長速率減慢，同時其亞硝酸鹽氧化速率和氧化活性衰減速率也同時降低71。而溫度高于35時，高溫直接對硝化細菌的酶系產(chǎn)生不可逆的破壞。在1035范圍內(nèi)所以，溫度每升高10，硝化速率可提高3倍72。因此，在進行硝化細菌培養(yǎng)時，應(yīng)盡量將溫度控制在2030范圍。2pHpH對微生物的主要作用在于，其可引起細胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；影響代謝過程中酶的活性；改變生長環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性；以及有害物質(zhì)的毒性。因此，pH也是影響硝化細菌的重要因子之一。一般來說，氨氧化菌的最適pH值為7.07.8，而亞

26、硝酸鹽氧化菌的pH在7.78.1。此時，兩者的活性最高73。但是有文獻報道，氨氧化菌的最適pH范圍是7.08.5，亞硝酸鹽氧化菌的最適pH范圍是6.07.574。Shammas75和Groenewegh76等人認為，硝化反應(yīng)的適宜pH在7.59.0之間，最佳pH在8.08.5。當pH6.5或者pH9.8時，硝化速率降低50以上。當pH5.5時，硝化反應(yīng)則完全停止。綜合來講，硝化細菌的最適生長pH為弱堿性環(huán)境，不同的環(huán)境系統(tǒng)中，硝化細菌的最適生長和硝化pH范圍會有所不同。 此外，pH值和溫度一同作用，決定了氨在總氨氮中的比例，氨對于硝化細菌是具有微量的毒性作用。當氨的濃度達8mg/L時，就能對硝

27、化細菌產(chǎn)生抑制77。亞硝酸鹽氧化菌的硝化活性對環(huán)境中的pH變化較為敏感，往往pH發(fā)生變動，短時間內(nèi)，硝化細菌的活性便會發(fā)生顯著性的變化72。3COD硝化細菌屬于化能自養(yǎng)型微生物。因此，早期人們普遍認為，有機物對硝化細菌具有一定的毒害作用。但是，眾多的研究和實踐證明，有機物（非有毒有機物）對硝化作用并無特定的毒害作用78。產(chǎn)生毒害現(xiàn)象的原因可能是，有機物的存在促進了異養(yǎng)細菌的快速生長，從而導(dǎo)致其與硝化細菌競爭氧和其他營養(yǎng)物質(zhì)，而使得硝化細菌的生長受到限制，但有機物本身并不直接影響硝化細菌的生長與硝化作用79。Hanaki也認為有機物導(dǎo)致硝化作用的降低不是直接毒害作用的結(jié)果，其分析原因可能有兩點：

28、一是異養(yǎng)菌的同化作用導(dǎo)致氨的減少；二是異養(yǎng)細菌細胞的凝聚體會對氨的氧化作用產(chǎn)生抑制作用。二者共同作用導(dǎo)致了硝化作用的降低。3滲透壓硝化細菌對滲透壓的能力較強，這主要由硝化細菌的生長環(huán)境所決定。一般來說，從淡水到海水，硝化細菌都有相關(guān)的種屬生活其中。即使環(huán)境條件土壤發(fā)生變化，例如，從淡水突然轉(zhuǎn)到海水中，多數(shù)的硝化細菌可以快速適應(yīng)環(huán)境，且活性的變化不大80。從某種意義上可以說，滲透壓對硝化細菌沒有影響，因此，在眾多的文獻報道中均不將滲透壓作為硝化細菌的主要研究內(nèi)容。4溶解氧硝化細菌皆為好氧菌，因此，在生長過程中需要氧來提供電子供體，從而獲得能量。一般來說，每毫克氮素經(jīng)過硝化作用途徑后，由氨轉(zhuǎn)變?yōu)橄?/p>

29、酸根，最大需要4.57毫克溶解氧來“清除”含氮物質(zhì)釋放的電子81。研究認為，硝化過程中溶解氧的濃度一般控制在1.0 mg/L2.0 mg/L比較好，過高和過低的溶解氧含量都會不利于硝化細菌的硝化能力。溶解氧過低會對硝化細菌的生長和硝化細菌的活性產(chǎn)生抑制，溶解氧過高則會對污泥深處中反硝化細菌產(chǎn)生抑制作用，不能把由硝化細菌產(chǎn)生的硝酸鹽最終從污水中去除，從而硝酸鹽反過來也抑制了硝化細菌的生長和活性。Eckenfelde提出DO濃度必須在2mg/L以上；也有人提出DO不能低于0.5mg/L；還有人提出氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌有所差異，DO濃度分別為1.0mg/L與2.0mg/L。而Michael K.

30、 Stenstrom與RichardA.Poduska在總結(jié)大量文獻的基礎(chǔ)上，通過對各種因素及雙底物限制動力學(xué)進行分析，認為這些濃度之所以各不相同，主要是由于雙底物限制動力學(xué)的原因，并得出結(jié)論：在較高的平均細胞停留時間（MCRT）的條件下，DO濃度為0.51.0mg/L就可完成硝化作用，MCRT較低時，完全硝化則需要相對高的DO濃度；而能夠發(fā)生硝化作用的最低DO濃度約為0.3mg/L82。Kanaki,K.等通過實驗發(fā)現(xiàn)，低的DO不會對氨的氧化產(chǎn)生影響，因為在低的DO（0.5mg/L）條件下，氨氧化菌的生長量會增加，恰好補償了DO太低引起的氨氧化速率的降低。而低的DO會大大地抑制亞硝酸鹽的氧化

31、作用，因為亞硝酸鹽氧化菌的生長量未增加，不能補償由DO過低引起的亞硝酸鹽氧化速率的降低，并且低的DO會加劇有機負荷對硝化作用的影響83。王建龍等也發(fā)現(xiàn)低的DO 0.8mg/L 會對亞硝酸鹽氧化菌的生長酶系產(chǎn)生抑制作用，而對氨氧化菌的生長酶系則會起到促進的作用。有趣的是，好氧硝化細菌也有反硝化的能力。在大量的純培養(yǎng)研究中，部分氨顯示出被轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的氮化合物。顯然，這些氣態(tài)化合物是由硝化細菌的反硝化反應(yīng)所產(chǎn)生。這些反硝化反應(yīng)的主要副產(chǎn)物是N284，NO85, 86或N2O87。在低的溶解氧濃度和亞硝酸鹽存在的條件下，超過60的氮被轉(zhuǎn)化為這些化合物88。在厭氧條件下，Nitrosomonas eut

32、ropha能夠利用氫和亞硝酸鹽89以及氨和NO2生長90。在這種情況下的終產(chǎn)物都是氮氣。4光照 亞硝酸鹽氧化菌對近紫外波段很敏感，其原因可能與細胞膜上的氧產(chǎn)生超氧化物游離基有關(guān)。但對于這一波段的光對亞硝酸鹽氧化菌產(chǎn)生負面影響的確切原因尚未發(fā)掘。對于那些受光照影響的亞硝酸鹽氧化菌，應(yīng)及時的將其轉(zhuǎn)移到暗區(qū)，并提供足量的供能物質(zhì)，大約需要幾個小時它們才能修復(fù)。5抑制劑很多化學(xué)物質(zhì)能對硝化細菌產(chǎn)生抑制作用，如：ATU（烯丙基硫脈）、乙炔、重金屬、金屬鰲合劑（尤其是與銅鰲合的）、二硫化碳、游離氨、2-氯_6一三氯甲基吡啶（Nitrapyrin）等。表1-3列出了一些經(jīng)常被使用的硝化細菌抑制劑。表1-3

33、一些常用的硝化作用抑制劑91Table 1-3 some comonely used inhibitors of nitrification抑制劑抑制對象丙烯基硫脲（ATU）亞硝酸鹽氧化菌氯酸鈉氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌2-氯-6-三氯甲基吡啶亞硝酸鹽氧化菌疊氮化鈉亞硝酸鹽氧化菌乙炔亞硝酸鹽氧化菌游離氨氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌亞硝酸氨氧化菌6共代謝正如前文提及的，催化亞硝酸細菌反應(yīng)的是氨單加氧酶（ammoniamonooxygenase，AMO），它與甲基營養(yǎng)菌的甲烷單加氧酶（methanemonooxygenase，MMO）極其相似92, 93。甲烷單加氧酶能催化氧化已分解的碳氫化合物，包括鹵

34、代烴類。最近一些研究成果表明氨單加氧酶（AMO）也具有類似的功能，它能通過共代謝的途徑來氧化其他非氨底物92。有人估計，亞硝酸細菌能以共代謝的途徑降解其每日耗氮量十分之一的碳氫化合物。1.2.6 硝化細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用硝化細菌為自然界氮循環(huán)中氧化亞硝酸鹽為硝酸鹽的一類重要微生物1。 由于養(yǎng)殖水體的定期消毒，水體微生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中亞硝酸鹽大面積過度積累事件頻繁爆發(fā)，直接或間接造成我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失, 并日益成為限制我國水產(chǎn)養(yǎng)殖進一步發(fā)展的重要因素之一。 然而，長期對水體亞硝酸鹽積累現(xiàn)狀的忽視，使得我國市面上硝化細菌產(chǎn)品極其匱乏（多為其他種類低效混合微生物的替代產(chǎn)

35、品，如光合細菌、芽孢桿菌等），同時針對富營養(yǎng)化水體亞硝酸鹽降解研究的缺失。因此，硝化細菌菌劑的研究與開發(fā)顯得尤為重要。有關(guān)硝化細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的報道不多，分析原因主要是硝化細菌菌劑本身價格昂貴，而且由于保質(zhì)期較短大大限制了其使用范圍。養(yǎng)殖水體中的氨氮與亞硝酸鹽對水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的毒害是非常嚴重的，其中，尤其是對蝦養(yǎng)殖，近年來，由于氨氮或亞硝酸鹽積累產(chǎn)生毒害造成大面積病害蝦和死蝦的現(xiàn)象日益頻繁。在一個水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，氨氮和亞硝酸鹽的除去通常有硝化細菌來完成。但是在一個新建的水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中，氨氮或亞硝酸鹽往往在足夠的硝化細菌生成前就以積累到對養(yǎng)殖對象產(chǎn)生毒害。因此，為了縮短硝化細菌生成足夠量所需的時

36、間，人為添加硝化細菌以降低氨氮和亞硝酸鹽所產(chǎn)生的毒害。Grommen等向養(yǎng)魚池廢水投加由高活性亞硝酸鹽氧化菌及富集液組成的復(fù)合菌液，試驗結(jié)果表明，當復(fù)合菌液的質(zhì)量分數(shù)為5 mgVSS/L時可確保4 d之內(nèi)對NH3 - N和NO2 - N的去除率由10 mg/L到低于可檢測范圍。當DO大于6 mg/L時沒有檢測出NO2- ，因此，投加該復(fù)合菌液表現(xiàn)出可靠性和可再生性。邢華等人采用純硝化細菌直接潑灑，使得池塘中的菌體濃度達到1ppm后，在未換水的情況下，經(jīng)過19天時間，亞硝態(tài)氮下降了98.6，且對蝦生長狀況良好。馬悅欣等94研究了牙鮮自凈式養(yǎng)殖槽水層和過濾層氨氧化菌含量分別為3.0102 m/L和

37、2.0104 m/L，亞硝酸鹽氧化菌含量是2.0102 m/L和3.0103 m/L。無循環(huán)過濾槽中氨氧化菌和硝化細菌含量為3.5103 m/L和3.5103 m/L。王國祥等95研究認為自然水體中硝化細菌分布廣泛，他對同一水體不同小環(huán)境中的硝化細菌的分布作了深入的研究。Danil.S.Hagopian91綜述了硝化細菌的特點，推薦開展硝化細菌水生微生態(tài)研究。養(yǎng)殖水體中存在的三氮（NH3N、NO2N和NO3N）中，NH3N和NO2N具有很強的毒性。王鴻泰等96研究了池塘中亞硝酸鹽對草魚的毒害作用。黃正等97利用固定化硝化細菌處理養(yǎng)殖廢水，24小時后，COD除去率達到74.9，NH3N去除率達到

38、82.5。C.Schuster等人用硝化細菌處理閉合循環(huán)養(yǎng)殖隨系統(tǒng)，氨氮含量比對照降低了77。H.Shah和J.P.Obbard等用固定化的硝化細菌處理龍蝦養(yǎng)殖廢水，獲得了理想的效果。Suny-Koo Kim等選擇了適合固定化硝化細菌且具有經(jīng)濟利用價值的固定化材料。他們使用混合固定化的硝化細菌處理循環(huán)養(yǎng)殖水，獲得了70 g/m3d的氨氮處理負荷。N.Sauthier等使用硝化細菌生物濾池處理循環(huán)養(yǎng)殖水，氨氮負荷可達到2.41 g/m3d。R.Gromman等用生物濾池也得到了相同的結(jié)果。1.3 論文研究的內(nèi)容及目的1.3.1 論文選題的意義國際上公認的水體發(fā)生富營養(yǎng)化的限制濃度是：TN0.2

39、mgL，TP 0.02 mgL。根據(jù)1986年至1989年，中國第一次開展的大規(guī)模湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查結(jié)果，全國26個主要湖泊、水庫中TN全部高于0.2 mgL，92的水體TP超過0.02 mgL。目前許多城市和市郊的小湖已發(fā)展到富營養(yǎng)化及“超”富營養(yǎng)化狀態(tài)。富營養(yǎng)化現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在象湖泊這樣水流緩慢的水體中，甚至在某些水淺的急流河段，河床礫石上也大量生長著藻類，出現(xiàn)了十分明顯的富營養(yǎng)化現(xiàn)象。在我國，對蝦養(yǎng)殖模式主要為分散式、高密度養(yǎng)殖模式，即小面積、分散式、高密度的投放及投喂對蝦養(yǎng)殖模式。在這種養(yǎng)殖模式下，一個養(yǎng)殖周期所產(chǎn)生的總磷（TP）、總氮（TN）和固體懸浮物（TSS）分別為321,668和2

40、15,000公斤公頃。為了除去養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，尤其是氨氮和亞硝態(tài)氮，幾天內(nèi)往往需要更換40的養(yǎng)殖水體，而這種富營養(yǎng)化的養(yǎng)殖廢水又往往未經(jīng)任何處理直接排入河流進入入海口和近海區(qū)域。這樣，大大增加了近海“赤潮”發(fā)生的幾率，同時大量生長的好氧生物所造成的局部缺氧環(huán)境嚴重的破壞了我國近海海洋生態(tài)平衡。同時由于高密度的投放飼養(yǎng)和投喂，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體本身所積累的氨氮和亞硝態(tài)氮，一直是我國高密度養(yǎng)殖的最大問題。氨氮和亞硝態(tài)氮直接對養(yǎng)殖對象產(chǎn)生毒害，使養(yǎng)殖對象對病害的抵抗力降低，從而染病乃至死亡，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖戶的巨大損失。一般不同的養(yǎng)殖對象對氨氮和亞硝態(tài)氮的耐受濃度不同，以南美白對蝦為例，非離子型氨氮

41、的安全值為小于0.1 mgL，亞硝態(tài)氮的安全值為小于0.2 mgL。而根據(jù)我國尤其是廣東地區(qū)，在整個養(yǎng)殖過程中，氨氮的濃度一般在0.15 mg/L左右，亞硝態(tài)氮的一般為0.20.8 mg/L左右，這樣大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖的風險。硝化細菌（包括氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌）在養(yǎng)殖水體中是存在的。但是，由于養(yǎng)殖過程中非規(guī)范性的頻繁換水和不定期的消毒，往往導(dǎo)致水體中硝化細菌的大量流失或死亡，破壞了整個養(yǎng)殖水體的生態(tài)平衡，也導(dǎo)致了硝化細菌脫除氨氮和亞硝態(tài)氮作用的弱化乃至喪失。針對養(yǎng)殖廢水的富營養(yǎng)化導(dǎo)致的經(jīng)濟損失和環(huán)境破壞，各國研究人員進行了相關(guān)研究，其中，硝化細菌菌劑的投放技術(shù)、污水工程反應(yīng)器處理技術(shù)便是主

42、要的兩種處理方法。工業(yè)及市政污水處理工程中用到的污水工程反應(yīng)器處理技術(shù)，大都集中應(yīng)用于經(jīng)濟效益較好的大規(guī)模的工廠化養(yǎng)殖場地，這樣將廢水集中處理，有效地緩解了養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化的情況。但是由于其繁瑣的處理工藝及高昂的維持費用使得其在我國分散式高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理上難以得到應(yīng)用。這種情況還出現(xiàn)在許多發(fā)展中國家，例如泰國、馬來西亞、菲律賓和越南等地。分散的低值養(yǎng)殖個體戶，由于區(qū)域分散、風險投資和經(jīng)濟效益等原因，決定了其不可能進行大規(guī)模的生物廢水處理工程。因此，針對這種分散式高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖模式，市場上出現(xiàn)了許多的純“硝化細菌”產(chǎn)品，主要為國外及港臺等地的產(chǎn)品，而國內(nèi)這種純“硝化細菌菌劑”產(chǎn)品幾乎沒有。即使是國外或港臺的這類產(chǎn)品，由于價格昂貴也大都應(yīng)用于觀賞魚的養(yǎng)殖和水族館等場所?，F(xiàn)今水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有關(guān)“硝化細菌”的產(chǎn)品魚目混雜，大都為混合菌群，其中絕大多數(shù)為異養(yǎng)厭氧微生物菌群，例如，芽孢桿菌類、乳酸菌類和光合細菌類，其本身并不是硝化細菌菌種。即使是真正的硝化細菌產(chǎn)品，也因為其使用方式的限制，尤其是其菌劑本身氧化性能低，保藏期短等限制，其功效也往往難以達到產(chǎn)品宣傳的效果。我國幅員遼闊，養(yǎng)殖面積很廣，以水產(chǎn)養(yǎng)殖凈化水質(zhì)的微生態(tài)制劑為例，2000年全國淡水池塘養(yǎng)殖面積約300萬畝，若每畝水質(zhì)改良劑的用量為30公斤/年，則需