1、a,1,液相色譜的應用以及方法開發(fā),a,2,提綱：,一.HPLC的廣泛應用 二.方法開發(fā)過程 一）選擇HPLC檢測器 二）分配色譜及選擇流動相 三）方法開發(fā)的具體步驟 四）梯度洗脫方法,a,3,一.HPLC的廣泛應用,據(jù)2004年統(tǒng)計，世界上化合物總數(shù)多達4700多萬種 在全部有機化合物中僅有20左右的樣品適用于GC分析 而HPLC可對80左右的有機化合物進行分離和分析,a,4,HPLC的廣泛應用,HPLC特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質的分離和分析并且可以做制備 在醫(yī)藥、食品、農業(yè)、生命科學、化工、環(huán)保等領域都有著廣泛的應用潛力。,a,5,HPLC的應用領

2、域,在食品研究中的分析應用 食品中的天然成分 碳水化合物 類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇 脂肪酸和有機酸 蛋白、肽、氨基酸 食品添加劑 酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑 抗氧化劑、防腐劑 顏料和染料（色素 維生素 污染物 霉菌（黃曲霉毒素 農藥殘留和獸藥殘留 多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸,a,6,HPLC的應用領域,在醫(yī)藥研究中分析應用 藥物分析有USP、BP、CP等標準 常用藥物研究中的應用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。 甾體藥物研究中的應用：腎上腺皮質激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素類藥物研究中的應用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。

3、 中草藥研究中的應用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類 手性藥物研究中的應用：光學異構體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構體毒性很強) 醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。 在獸藥研究中分析應用,a,7,HPLC 的應用領域,在生物化學和生物工程中的應用 氨基酸、多肽合成和蛋白質的分析研究 核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（兒茶酚胺類) 在精細化工分析中的應用 醇、醛和酮、醚的分離分析 酸和酯的分離分析 表面活性劑的分析 聚合物的分析研究 藥物、農藥、染料、炸藥等工業(yè)產品,a,8,HPLC的應用領域,化妝品行業(yè)要控制和分析： 防腐劑、防曬

4、劑、性激素以及維生素等； 在公安、刑警破案工作需要 投毒藥物、毒品分析等 在環(huán)境污染分析中的應用 廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農藥殘留、酚類和胺類的檢測,在無機離子分析中應用 飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析,a,9,二.方法開發(fā)的過程,Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2,a,10,第一步干什么?,想辦法得到各種信息 向同行了解是否做過

5、此類樣品，或有否類似樣品的分析方法 查文獻和方法，如CA,AA,AOAC,EPA- 儀器制造商的文獻，如Dionex,Waters 對色譜柱有足夠的了解 掌握分離機理，自己開發(fā)方法 充分了解您自己的樣品,a,11,分析時要了解哪方面的情況？,靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?,a,12,分離(制備)時要了解哪方面的情況？,要分離（即制備）的樣品量有多大? 要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對分離產物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定如何完成?,a,1

6、3,使用文獻方法注意點,色譜柱填料的種類、品牌是否相同? 注意文獻方法的流動相 是否損害色譜柱? 如色譜填料品牌不同，需要調整流動相 注意色譜柱的規(guī)格：內徑、柱長 需要調整流速、進樣量 注意梯度條件 了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）,a,14,一）選擇HPLC檢測器,對樣品有響應并有一個輸出信號 應該提供在檢測器響應值與樣品濃度之間的線性關系；并且所設計的校正技術應該促進這種關系 但是： 由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產生響應與濃度之間關系的與線性偏離現(xiàn)象 并不是所有的檢測器是線性的 受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距,a,15,用于HPLC的檢測器,沒有任何

7、一種單獨的檢測器可以適應所有的液相色譜分離！ HPLC檢測器可以分為： 溶質性質檢測器（選擇型） 對溶質的物理或化學性質響應，一般不反應流動相的變化（選擇型） 整體性質檢測器（通用型） 不管是否有溶質，對流動相任何物理性質的變化作出響應（通用型）,a,16,理想的HPLC檢測器,高靈敏度；可忽略的基線噪音 寬的線性范圍 獨立于流動相及操作參數(shù)的響應 對壓力、溫度及流速等變化不敏感 長時間操作的穩(wěn)定性 低死體積 非破壞性 選擇性,a,17,靈敏度：信噪比,靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N） 檢測限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有

8、利于： 更好的色譜峰確認 更好的定量 更好地完成色譜峰純度/均一性,6:1,N,S,a,18,選擇液相色譜的檢測器,要考慮的因素： 你要分離的化合物/樣品的化學特性 化學結構、分子量及紫外光譜等等 流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等） 梯度還是等度 靈敏度需求 是否有雙檢測的需求,a,19,選擇液相色譜的檢測器,通用檢測器 RI ELSD MS 靈敏度 ug ng pg 線性范圍 104 否 103 流速敏感 是 否 是 溫度敏感 是 否 否 破壞性 否 是 是,選擇性檢測器 ABS FL EC Cond MS 靈敏度 ng pg fg pg pg 線性范圍 105 103 106 105 1

9、03 流速敏感 否 否 是 是 是 溫度敏感 否 否 是 是 是 破壞性 否 否 是 否 是,a,20,吸光度（ UV/Vis）檢測原理,原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收 定量基礎：比耳定律，AKCL 優(yōu)點：1）對溫度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脫 3） 靈敏度較高，ng級檢測 缺點：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質,a,21,吸光度（ UV/Vis）檢測的應用,大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器 -多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外/可見檢測器，25%是PDA）,a,22,背

10、景吸收的影響,背景吸收降低了線性范圍 多數(shù)流動相有紫外吸收,a,23,光電二極管矩陣（Photo Diode Array）,Photo Diode Array 簡稱：PDA或DAD,a,24,光電二極管矩陣檢測器（ PDA ）的特點和用途,一種三維水平的吸光度檢測器-采集三維譜圖 兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息 在收集色譜圖的同時，得到光譜圖 提供許多有用的功能 -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認 -可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰 -任意波長的色譜再處理 -光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合,熒光（Fluorescence）檢測原理,原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達到激發(fā)

11、態(tài)，當其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光 優(yōu)點：熒光檢測器靈敏度高, pg級檢測 缺點：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生,a,26,熒光檢測器原理,a,27,熒光檢測器的應用,環(huán)境中的污染物 多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、飲料 食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素 染料 維生素及衍生氨基酸 生物技術及制藥,氨基甲酸酯類殺蟲劑,黃曲霉毒素,多環(huán)芳烴（PAH）,維生素,a,28,示差折光（Refractive Index）檢測,示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀六十年代末、七十年代初） 通常被認為是一種通用檢測器 檢測溶液中所有被溶解的溶質 非特異性 任何光

12、學介質的折光率都被定義為光在該介質中與真空中的速度之比值,a,29,示差折光（RI ）檢測 的原理,原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣 各組分濃度。 優(yōu)點：通用型檢測器 缺點： 1）對溫度變化敏感 2）不能用于梯度檢測 3）靈敏度低，ug級檢測,返回,a,30,示差檢測器的應用,示差折光檢測器是通用型檢測器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質都可以檢測 特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物,例如糖類,醇類,酯類以及脂肪酸等 高分子化合物GPC,GFC分析以及復雜樣品純化,a,31,蒸發(fā)光散射（ELSD）原理,用氮氣把流動相吹成細霧狀 流動相的液滴通過一個預加熱的腔體后被蒸發(fā)掉 蒸發(fā)的溶劑

13、被從檢測器中除去 溶質的揮發(fā)性小于流動相，因此產生顆粒束與光束相交 被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集 PMT的輸出與溶質的存在量呈比 例關系,a,32,ELSD 優(yōu)點及應用領域,通用型 比流動相揮發(fā)性小的物質都能被檢測 可以作梯度實驗； 檢測下限可到納克級水平 對環(huán)境條件不敏感；可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相 應用領域： 碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制藥行業(yè) 表面活性劑 天然產物,a,33,ELSD 缺點,不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽） 要求使用霧化氣源（典型的是氮氣或空氣） 不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化 破壞性技術 蒸發(fā)出的溶劑要引到戶外

14、或通風櫥里 對揮發(fā)性化合物的檢測不理想 一般得到的是非線性校正曲線 某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器,a,34,二）色譜基本分類,色譜基本分類： 按溶質（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質可以分為： 1.分配色譜分配系數(shù) * 2.親和色譜親和力 3.吸附色譜-吸附力 4.離子交換色譜離子交換能力 5.凝膠色譜（體積排阻色譜）-分子大小引起的體積排阻,a,35,分配色譜,分配色譜分為： 正相色譜：固定相（填料）為極性，流動相為非極性 反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。 用得最多，約占60-70% 相對應的色譜柱： 反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS） C8,C4,C

15、3，苯基等 正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團為-CN氰基， -NH2氨基等,a,36,分配色譜的分離機理,a,37,分配色譜概述,反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離 洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫,a,38,流動相極性,a,39,流動相洗脫強度,反相色譜最常用的流動相及其洗脫強度： 水 甲醇乙腈 乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水” 正相色譜最常用的流動相及其洗脫強度： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇 *應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法,a,40,流動相的選擇原則,樣品易溶，且溶解度盡可能大 化學性質穩(wěn)定，不損壞柱子 不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收

16、 * 黏度低，流動性好 * 無毒或低毒，易于操作 易于從其中回收樣品 易于制成高純度，即色譜純 廢液易處理，不污染環(huán)境,a,41,三）方法開發(fā)的具體步驟,先用一根短的色譜柱 用相對較高的流速 使用盡可能純度高的標準品 先用高強度的洗脫液 調節(jié)k 值改變保留值 調節(jié)a值改變選擇性 通過改變流動相的pH值，使樣品成中性 加入“對離子”，使樣品呈中性 調節(jié)柱長度改變柱效及分離速度,a,42,反相色譜的方法開發(fā),開發(fā)過程實例 色譜條件 色譜柱：C18，4.6mm15mm 流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度） 舉例中用不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱 流速：1

17、ml/min 樣品： 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),a,43,1.改變容量因子 K,譜圖,a,44,2.調節(jié)值改變選擇性,同樣強度的不同溶劑，改變了流動相值 改變色譜柱,a,45,離子型化合物的色譜分離,離子型化合物的分離方式 多數(shù)化合物是離子型的！ 使用離子交換柱：離子交換法 主要用于“強”陰、陽離子 使用反相柱 離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性 離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性,a,46,3.離子抑制色譜,離子型化合物在反相色譜柱上不保留 改變

18、流動相的pH值，抑制樣品離子的電離使樣品成中性 適用于弱酸性化合物的分離 加入TFA,磷酸鹽等降低流動相的pH值，使樣品降低離子化 使用硅膠基質C18填料 使用條件應在填料基質的范圍內 硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內,離子抑制色譜實例,而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。,a,48,離子抑制色譜的使用范圍,下列情況下不能使用離子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2時還保持離子化 一些堿在pH高于7時還保持離子化 可以有以下的選擇 離子交換色譜 使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法 使用“離子對色譜法”,a,49,4.離子對色譜法

19、,在反相色譜流動相內加入“離子對”試劑 與樣品中可電離的組份形成“對離子” 在反相色譜柱上分離離子型化合物 離子對試劑的類型 季銨鹽、叔胺鹽 （正離子），適用于弱酸 烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負離子），適用于弱堿 烷基長度不同，形成對離子的能力不同,a,50,離子對色譜機理,a,51,離子對色譜的應用,抗組胺及減充血劑藥物的分析,a,52,離子對色譜分析水溶性維生素,a,53,用離子對、還是用離子抑制方法？,a,54,方法開發(fā)的其他因素,流速對柱效的影響 不同內徑的色譜柱有自己的最佳流速 樣品的進樣量(濃度)對柱效的影響 樣品的進樣體積對柱效的影響 溶劑粘度對柱效的影響 以上因素均影響分離度,a,

20、55,色譜方法轉換,如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱 轉換進樣量 轉換流速,a,56,四）液相色譜方法開發(fā),梯度洗脫方法,a,57,在這一部分您將學習:,關于梯度洗脫過程及其優(yōu)點. 如何優(yōu)化梯度分離. 有關梯度分離的一些實用考慮.,a,58,液相色譜泵,穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速 可靠且充分的溶劑混合 準確及重現(xiàn)的自動溶劑混合 準確及重現(xiàn)的梯度形成 有效的流速范圍 制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮 滯后體積 梯度分析更為關注 目的：在任何情況下保持最高精度,a,59,梯度的洗脫方式,高壓梯度及低壓梯度,a,60,梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響,注意滯后體積包括進樣器、阻尼 器、混合器及其管路,a,61,梯度滯后大小的影響,滯后體積太大會引起梯度變化的延遲 例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min 實際梯度會比設置值晚 2 分鐘響應，沒有問題 對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min 實際梯度會比設置值晚20 分鐘響應，不能接受 滯后體積的不同會使方法轉換麻煩 滯后體積比文獻大或小都會使方