1、.,第五章 雙向凝膠電泳 (2D-PAGE),蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)路線 雙向凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展及原理 儀器簡介 樣品制備 技術(shù)流程,.,1. 蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)路線,要求 流程 技術(shù)路線,.,蛋白質(zhì)組分析的首要要求,將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質(zhì)進行分離、檢測和分析 。,.,生物學問題的提出,實驗模型的設(shè)計,實驗組和對照組樣品的制備,蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離,圖像掃描和初步分析,感興趣蛋白點的切取,胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化,質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析,質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學分析和比對,新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),其它實驗的進一步驗證,蛋白信息的初步獲得,蛋 白 質(zhì) 組

2、分 析 流 程,.,蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線,蛋白質(zhì)樣品的制備,雙向電泳,圖像分析,轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白,凝膠中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白質(zhì)質(zhì)量,N端測序,肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù),肽指紋圖,數(shù)據(jù)搜索,新的或已知蛋白,蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定,.,2. 雙向電泳技術(shù)的發(fā)展及原理,雙向凝膠電泳的發(fā)展 雙向凝膠電泳的基本原理,.,雙向凝膠電泳的發(fā)展,雙向凝膠電泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033

3、)，蛋白質(zhì)第一向電泳是根據(jù)其自由溶液遷移率 (free-solution mobility)，在濾紙條上進行；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進行。 隨后，Raymond發(fā)明了聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，雙向電泳的支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma prot

4、eins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)，這即是雙向凝膠電泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的發(fā)展，以第一向為蛋白質(zhì)等電聚焦的雙向凝膠電泳技術(shù)建立起來，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in

5、 acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seylers Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。,.,20世紀70年代初，在第二向電泳中又使用了十二烷基磺酸鈉 (SDS) (Barrett

6、 T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendu

7、ng auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向電泳基本上根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量來分離，從而奠定了現(xiàn)代雙向凝膠電泳的基礎(chǔ)，即IEF-SDS PAGE。 1975年，OFarrell、Klose和Scheele分別對雙向凝膠電泳做進一步的優(yōu)化，建立了高分辨率的雙向凝膠電泳 (OFarrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；Klos

8、e J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。 此項技術(shù)是目前唯一能將數(shù)

9、千種蛋白質(zhì)同時分離并展示的分離技術(shù)，一般能分離1000 3000個蛋白質(zhì)點，最好的膠能分離得到11000個左右的蛋白質(zhì)點。,.,雙向凝膠電泳的基本原理,先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點在 pH 梯度膠內(nèi)進行等電聚焦，然后按照它們的相對分子質(zhì)量大小進行 SDS-PAGE 第二次電泳分離。 第一向進行等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當?shù)鞍走w移至其等電點 pH 位置時，其

10、凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。當?shù)鞍讛U散到低于其等電點 pH 區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極移動。同樣，如果蛋白質(zhì)擴散到高于其等電點的 pH 區(qū)域時，則帶負電，在電場的作用下會向陽極移動。根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的pH 梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG 膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。 第二向是將在 IPG 膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 SDS-PAGE凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分離。沿垂直的方向

11、進行 SDS-PAGE 電泳，按分子量大小進行分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。,.,IPG 膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構(gòu)成了分布在pH 310不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。,.,三種雙向凝膠等電聚焦系統(tǒng),根據(jù)第一向等電聚焦條件和方式的不同，可將雙

12、向凝膠電泳分為三種系統(tǒng)：ISO-DALT、NEPHGE和IPG-DALT。 在ISO-DALT系統(tǒng)中，等電聚焦在聚丙烯酰胺管膠 (tube gel) 中進行，載體兩性電解質(zhì) (carrier ampholyte) 在外加電場的作用下形成pH梯度，pH梯度在堿性區(qū)不穩(wěn)定（陰極漂移）、重復性不易掌握和上樣量低是其主要缺點，并且一般不能分離等電點大于8.0的堿性蛋白質(zhì)，其優(yōu)點是電泳設(shè)備要求不高，電泳溶液容易配制，易于開展工作，各種電泳條件經(jīng)優(yōu)化后，可達到非常高的分辨率，也可獲得好的重復性，目前唯一分辨到10000個蛋白質(zhì)斑點的圖譜正是采用了這一系統(tǒng)。 NEPHGE為非平衡pH梯度電泳 (nonequ

13、ilibrium pH gradient electrophoresis)，是IPG (immobilized pH gradient) 膠發(fā)明前用于分離堿性蛋白質(zhì)的一種方法，蛋白質(zhì)在等電聚焦場中達到平衡前結(jié)束電泳，第一向的pH也是依靠載體兩性電解質(zhì)和電場來建立。 IPG-DALT的第一向電泳是采用1982年發(fā)明的IPG膠 (Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG et al. Isoelectric focusing in immobilized pH gradient: principle, methodology and some applications. J

14、Biochem Biophys Methods, 1982, 6: 317-339)，其pH梯度的形成依賴于不同pK值的一種合成的化合物immobiline，該化合物是丙烯酰胺的衍生物，為非兩性的弱酸和弱減，在凝膠聚合過程中，能與聚丙烯酰胺共價結(jié)合，因此，IPG膠的pH梯度是穩(wěn)定的，不依賴于外加電場，基本上克服了ISO-DALT的主要缺點，無論在重復性和上樣量上均優(yōu)于ISO-DALT。,.,非變性2D-PAGE：兩向均在非變性條件下進行，這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； 非變性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非變性IEF，之后在2% SDS溶液

15、中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進行。適于分析非共價鍵連接的蛋白-蛋白間的相互作用。 非變性/還原/SDS-2D-PAGE：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素 + 5%-ME + 2%SDS進行平衡，再進行第二向SDS-PAGE電泳。此時分離的蛋白質(zhì)點可進行點的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。 變性2D-PAGE：樣品先用2%SDS + 5%-ME + 95變性5min, IEF在8M尿素 + 1%NP-40條件下進行，之后膠條用2%SDS + 5%-ME平衡，然后進行SDS-PAGE。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析

16、被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100KD的蛋白質(zhì)點少于第三種方式。,雙向電泳的分類,.,3. 儀器簡介,第一向：,采用珀耳帖溫度控制聚焦平臺；最大電壓為10, 000伏；有不同的電壓上升方式；可分步進行時間或電壓小時控制；重泡脹可采取整體的或獨立的步驟；程序可時時控制；可同時聚焦24根7cm，12根17cm膠條；有三個預設(shè)程序的方法；有十個用戶自定方法；采集運行數(shù)據(jù)可經(jīng)RS232端口輸出或任何熱敏打印紙。,BIO-RAD公司PROTEAN IEF Cell 等電聚焦儀：,Amersham pharmcia Biotech公司IPGphor等電聚焦儀：,

17、電極區(qū)域為銅鍍金板；最多上12個樣品；平臺溫度為18-251；膠條槽 (Holder) 體為氧化鋁陶瓷，丙烯酸的蓋子；適合7、11、13和18cm的膠條；程序參數(shù)包括重泡脹時間、平臺溫度、每根膠條的最大限流、每步的電壓、每步的電流改變模式、每步的時間；可編輯10個程序，每個程序分有九個步驟；電壓輸出最大為8000V；最大電流為1.5mA；最大功率為12W。,.,第二向：,BIO-RAD公司PROTEAN II xi Cell電泳槽： 電極是直徑為0.01英寸的白金電極；適用于16.520cm 凝膠電泳；凝膠厚度為1.0mm；可同時運行1-2塊膠；上槽緩沖溶液350ml，下槽緩沖溶液1.2 L；

18、典型SDS-PAGE電泳時間：無冷卻時為5小時，帶冷卻時為3.5小時。配套電源為Power Pac 1000：在進行電泳時，最大電壓不超過1000V，最大功率不超過80W，最大室溫不超過50。,Amersham pharmcia Biotech公司Ettan DALT II System： (1) 此系統(tǒng)的電源控制為Power Supply/Control Unit：最大輸出功率是200W；溫度控制范圍是10-50最大電壓600V；最大電流1A。(2) 使用Gel caster灌膠模具：最多可同時灌25.520.5cm、1mm厚的梯度膠或均一膠14塊。 Amersham pharmcia Bi

19、otech公司Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit： 膠大小為10.08cm ;最多可同時跑兩塊膠；跑一塊膠時需1.7L電極緩沖液，跑兩塊膠時需1.2L電極緩沖液；最大電壓是600V，最大功率是25W；所配置電源為Electrophoresis Power Supply EPS 301。,.,圖像分析軟件：,Amersham pharmcia Biotech公司： imageMasterTM 2D version:5.0 BIO-RAD公司： PDQuesTM,.,4. 雙向電泳分析中的樣品制備,應使所有待分析的蛋白樣品全

20、部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。,.,樣品的分級處理,通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進行分級處理，可降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。,.,樣品的溶解,是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。,1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復合物和聚積體完全破壞，從而形成

21、各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降）； 2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除； 3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。,溶解的目標：,.,增加樣品溶解性的手段,變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑Triton X-100和NP-40、兩性離子去

22、污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦 (TBP) 進行還原。 起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應用時，兩性電解質(zhì)的濃度應小于0.2(w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇

23、不同pH范圍的IPG膠條時，也應使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。,.,樣品中核酸的去除,對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。 解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì) (SCA) 同核酸結(jié)合形成復合物的能力，再通過超速離心來去除復合物。,.,亞蛋白質(zhì)組樣品的制備,用超離心技術(shù)分離出細胞器、質(zhì)膜和細胞核等成分，再用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。,第一步：用Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白； 第二步：把未溶解的pel

24、let用標準IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白； 第三步：用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。,順序抽提法：根據(jù)細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。,.,特殊樣品的制備,低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量, 但同時增加了高豐度蛋白的負荷，且造成蛋白的疊加效應而影響分離?，F(xiàn)常用預分級窄pH膠的微制備技術(shù)進行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個pH單位的IPG膠進行窄pH范圍的分離。 強堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預處理以富集，再

25、用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3-12、4-12或10-12) 進行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12) 的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12) 等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。 極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子

26、量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復合物變成了多肽，或者可能是大分子。,.,5. 雙向凝膠電泳技術(shù)流程,IPG重泡漲及樣品加樣 第一向等電聚焦 第二向SDS-PAGE 檢測 問題及解決辦法,.,IPG膠條的重泡脹,重泡漲時間至少要10h，泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收。 重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時需參照相關(guān)說明書。 不同的加樣方法和加樣量會導致最終結(jié)果的差異。 溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時溫度一般穩(wěn)定在20，太低尿素會結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)也會造成膠上的蛋白質(zhì)點位置的變化。 重泡漲時加上30-50V的低電壓會促進膠條對蛋白質(zhì)的吸收，但這一點在制備型電泳時才有意義

27、。,商品化的膠條使用前是以干膠條的形式和塑料支撐薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。重泡漲液的成分是：8mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5%IPG Buffer, 痕量Bromophenol Blue，和裂解液成分基本相同，在10-100mmol/L濃度范圍內(nèi)適當提高DTT的濃度可提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。 重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進行，此時樣品已經(jīng)加到重泡漲液中，在加樣杯上樣 (cup loading) 方式中，膠條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電聚焦盤內(nèi)加樣。 泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入IPG內(nèi)，從而能進行接下

28、來的IEF。,.,加樣,樣品可以在重泡漲時加入，稱為膠內(nèi)重泡漲 (in-gel rehydration)，也可以重泡漲完成后再加入，如加樣杯上樣。重泡加樣相對不可靠，操作比較困難而且蛋白質(zhì)容易在膠和樣品的界面產(chǎn)生沉淀，然而在某些特殊情況下，重泡漲后加樣具有優(yōu)勢，如使用 pH 6-9 的膠條分離堿性蛋白質(zhì)時，在陽極用加樣杯加樣，可以得到更好的圖譜。一般而言，膠內(nèi)重泡漲是推薦方式，可以增加蛋白質(zhì)的上樣量，也避免了在陰極或陽極加樣的方向問題。 分析型雙向凝膠電泳上樣量在幾十至幾百微克之間，制備型雙向凝膠電泳上樣量在數(shù)百（銀染）到最大幾十毫克（考馬斯亮藍染色）之間，上樣量的大小和膠條的pH范圍也有關(guān)系

29、，pH 范圍越窄，上樣量月大。但由于蛋白質(zhì)定量方法的重復性并不十分可靠，最佳的上樣量要根據(jù)實驗結(jié)果來優(yōu)化。,.,蛋白載樣量,影響IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括： 待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質(zhì)譜分析。 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。 待研究蛋白的豐度： 樣品的復雜度：復雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。 IPG膠條的pH范圍：,.,IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量,.,IPG IEF 中 pH梯度的選擇,常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預試驗確定。,.,預分步收集,細胞漿,細

30、胞核,細胞膜,核糖體及其他特定細胞成份,細胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH 3-4,pH 4-5,pH 5-6,pH 6-7,pH 7-8,pH 8-9,pH 9-10,pH 10-11,pH 11-12,第一步,第二步,第三步,用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白,陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質(zhì),亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖,3倍,3倍,.,聚焦時間的優(yōu)化,重泡漲結(jié)束后，在膠條和電極之間加上潤濕的小紙片，它可以吸收鹽離子和補充水分。在陰極加上20mmol/L DTT潤濕的紙片可減少堿性端的水平條紋并且有助于堿性

31、蛋白質(zhì)的聚焦。 從理論上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復性所需的最佳時間是IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。 聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 過度聚焦雖然不會導致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。 等電聚焦的電壓上升分為三個階段首先加上一個比較低的電壓，去出膠條中的過多的鹽離子；然后開始加高電壓，電壓上升的模式為緩慢上升；最后是持續(xù)高壓，電壓上升的模式為快速上升。一般原則是：根據(jù)膠條的pH范圍和上樣量的多少，總電

32、壓時間積可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)整。,.,IEF的基本條件,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,total,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,

33、40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,.,兩維間的平衡,一維（等點聚焦）電泳結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于80保存數(shù)月。 但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS-PAGE 時電泳能順利進行。 建議方案是：用含2% (m/v) SDS、1% (m/v) DTT、6 mM尿素和30%甘油的50mM Tris (pH8.8) 緩沖液先平衡15min，再用5% (m/v) 碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液

34、平衡15 min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。,.,二維 SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE類似。 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，可以把 IPG 膠條看作是壓縮膠，因為在 IPG 膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性 IEF 膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠，所以只需使用分離膠（也可使用壓縮膠）。 IPG 膠條平衡好后，一般將膠條在電泳緩沖夜里浸一下，這樣一方面可以清洗膠條去除膠條上的平衡液，另一方面，潤濕的膠條也容易沿著玻璃板推到SDS-PAGE膠上端。 IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE有兩種方式：一種方式是先將IPG膠條放到SDS-PAGE膠上，再加入熔化的瓊

35、脂糖溶液；另一種方式是先加入熔化的瓊脂糖溶液，再將 IPG 膠條放到 SDS-PAGE 膠 上。兩種方法各有優(yōu)劣，第一種方式圖譜不易變形，但在兩塊膠之間容易有小氣泡發(fā)生，第二種方式非常好地解決了膠之間的氣泡問題，但瓊脂糖容易凝固，插入 IPG 膠時有時會造成圖譜變形。相比較之下，氣泡對圖譜的影響較小，故常推薦第一種方式。 SDS-PAGE膠的濃度需根據(jù)研究目的和樣品性質(zhì)而定。常用的是12%和12.5 %的均一膠，灌膠方便，重復性好，但相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)斑點較為聚集，分離不佳。如采用9-16%的線性梯度膠，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)點在整塊凝膠上分布比較均勻，但灌膠不易。 電泳過程中溫度一般控制在10-15。,.,聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測,理想顯色劑的7S 安全 (safety)； 靈敏 (sensitivity)； 簡單 (simplicity)； 特異性