1、.,1,薄層色譜（TLC法）,.,2,定義、原理 薄層色譜(Thin Layer Chromatography)簡稱TLC，又稱薄層層析，屬于固液吸附色譜。樣品在薄層板上的吸附劑（固定相）和溶劑（移動相）之間進行分離。由于各種化合物的吸附能力各不相同，在展開劑上移時，它們進行不同程度的解吸，從而達到分離的目的。,.,3,TLC是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，將樣品點成一條線，則可分離多達500mg的樣品。因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性

2、較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質。此外，在進行化學反應時，薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應及進行柱色譜之前的一種“預試”，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應是否完成。,.,4,薄層色譜常用的固定相是氧化鋁或硅膠。硅膠略帶酸性，適用于酸性和中性物質的分離；堿性物質則能與硅膠作用，不易展開或發(fā)生拖尾的斑點，不好分離。對于氧化鋁則相反。流動相則是一種極性待選的溶劑。大多數(shù)實驗室實驗中都使用標準硅膠板。 應該根據(jù)化合物的極性大小來選擇吸附活性合適的吸附劑，對極性小的試樣可選擇吸附活性較高的吸附劑，對極性大的試樣，選擇活性較低的吸附劑。,.,5,將溶液中的反應混合物點在薄板上

3、，然后利用毛細作用使溶劑（或混合溶劑）沿板向上移動進行展開。根據(jù)混合物中組分的極性，不同化合物將會在薄板上移動不同的距離。極性強的化合物會“粘”在極性的硅膠上，在薄板上移動的距離比較短。而非極性的物質將會在流動的溶劑相中保留較長的時間從而在板上移動較大的距離。,.,6,薄層色譜（TLC）實驗步驟：,1、 點樣 通常將樣品溶于低沸點溶劑（丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳）配成1 %的溶液，用內徑小于1 mm管口平整的毛細管點樣。 實驗具體操作： （1）先用鉛筆在距薄層板一端1.5cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細管吸取樣品，在起始線上小心點樣，斑點直徑一般不超過2-3mm。 （2

4、）若樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，而影響分離效果。 （3）若在同一板上點幾個樣，樣點間距離應為1.5-2cm。 （4）點樣要輕，不可刺破薄層。,.,7,展開方式可分為三類：上行展開和下行展開；單次展開和多次展開；單向展開和多向展開 常用的是上行展開，就是使展開劑從下往上展開：當樣點上的溶劑充分揮干后，將薄層置于盛有適當展開劑的標本缸、大量筒或方形玻缸中，使展開劑浸入薄層的高度約為0.5cm。 注意事項：先懸空飽和、再入液展開；樣點不能泡在展開劑中；薄層浸入時不能歪斜進入。,2展開：,.,8,3顯跡：用適當?shù)姆椒ɑ蛘哌m當?shù)娘@

5、色劑處理薄層，使其上可能已經(jīng)分離的各成分斑點顯示出來，以方便計算各個斑點的比移值，從而提供定性與定量的依據(jù)。方法有： 物理顯跡法 化學顯跡法： 1）蒸氣顯色 利用一些物質的蒸氣與樣品作用而顯色； 2）噴霧顯色 將顯色劑配成一定濃度的溶液，用噴霧的方法均勻噴灑在薄層上。噴霧器與薄層相距最好0.5-0.8m，對于未加粘合劑的薄層，應趁展開劑未干前噴霧顯色，以免吸附劑吹散。 生物顯跡法 薄層色譜掃描儀,.,9,4比移值的計算與定性、定量：展開結束后，經(jīng)過各種顯色操作后，樣品中各個成分的斑點可能出現(xiàn)了不同程度的分離，為了表達各成分的相對位置（極性）通常以比移值作為稱量斑點位置的指標。 比移值Rf(斑點

6、中心與原始樣點之間的距離)/(溶劑前沿與原始樣點之間的距離) 各種物質的Rf 隨要分離化合物的結構，濾紙或薄層板的種類、溶劑、溫度等不同而不同，但在條件固定的情況下，Rf對每一種化合物來說是一個特定數(shù)值。,.,10,1）讓溶劑向上展開約90%的薄板長度。 2）從展開池中取出薄板并且馬上用鉛筆標注出溶劑到達的前沿位置。 3）讓薄板上的溶劑揮發(fā)掉，將薄板干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色，用鉛筆標出所有顯色點或有紫外活性的點。,.,11,薄層層析的Rf 值受多種因素影響，即使嚴格按照實驗要求做了，結果的重現(xiàn)性仍較差。因此，薄層定性時常與標準品一起點樣進行對比分析。在跟蹤反應進行時，一定要點上起始反

7、應物、反應混合物以及兩者的混合物。,.,12,根據(jù)初始薄層色譜結果修改溶劑體系的選擇。如果想讓Rf變得更大一些，可使溶劑體系極性更強些；如果想讓Rf變小，就應該使溶劑體系的極性減小些。如果在薄板上點樣變成了條紋狀而不是一個圓圈狀，那么你的樣品濃度可能太高了。稀釋樣品后再進行一次薄板層析，如果還是不能奏效，就應該考慮換一種溶劑體系。,.,13,展開劑：薄層層析中用來將樣品展開的溶劑。 展開：用極性適當?shù)娜軇┙櫼呀?jīng)點了樣品的薄層板一端，憑借毛細作用帶動樣品在薄層板上移動，最終使樣品分離的操作過程。 展開劑常是由兩種或者兩種以上的溶劑按一定的比例組成的溶劑系統(tǒng)。簡稱溶劑系統(tǒng)或展開所用的溶劑。 在吸

8、附薄層中，化合物在吸附薄層上移動的速度與展開劑的極性有關。展開劑的極性越大，化合物移動的速度越快，展開劑的極性越小，化合物的移動速度慢。 薄層層析要得到較好的展開效果，必須依據(jù)所要分離的樣品來正確選擇層析條件，對樣品的極性進行認真研究，以確定及實驗摸索適宜的吸附劑、展開劑。選擇適當?shù)恼归_劑是首要任務.有時使用單一溶劑不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑。,.,14,展開劑的比例要靠嘗試. 展開劑的選擇條件： 對所需成分有良好的溶解性； 可使成分間分開； 不與待測組分或吸附劑發(fā)生化學反應； 沸點適中，黏度較??； 展開后組分斑點圓且集中； 混合溶劑最好用新鮮配制。,.,15,單一溶劑的極性從小到大順序為：,石油醚環(huán)己烷四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇甲醇吡啶乙酸,.,16,混合溶劑的極性順序由小到大為：,苯氯仿（1+1） 環(huán)己烷乙酸乙酯（8+2）氯仿丙酮（95+5）苯丙酮（9+1）苯乙酸乙酯（8+2）氯仿乙醚（9+1）苯甲醇（95+5） 苯乙醚（6+4）環(huán)己烷乙酸乙酯（1+1）氯仿乙醚（8+2）氯仿甲醇（99+1）苯甲醇（9+1）氯仿丙酮（85+15）苯乙醚（4+6）苯乙酸乙酯（1+1）氯仿甲醇（95+5）氯仿丙酮（7+3）苯乙酸乙酯（3+7）苯乙醚（1+9）乙醚甲醇（99+1）乙酸乙酯甲醇（99+1）苯