1、分子生物學(xué)教案一、課程性質(zhì) 必修課二、教學(xué)目的要求分子生物學(xué)是一門近年來(lái)發(fā)展迅速并且在生命科學(xué)領(lǐng)域里應(yīng)用越來(lái)越廣泛、影響越來(lái)越深遠(yuǎn)的一個(gè)學(xué)科。從學(xué)科角度來(lái)講，分子生物學(xué)函蓋面非常廣，與生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等生命科學(xué)主干課程有一些交叉。在學(xué)習(xí)本課程之前，要求學(xué)生已掌握了必要的數(shù)、理、化知識(shí)，并學(xué)習(xí)了植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、微生物學(xué)與生物化學(xué)等基礎(chǔ)課程。通過(guò)對(duì)本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握基因概念在分子水平上的發(fā)展與演變、基因的分子結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)、基因的復(fù)制、基因表達(dá)（在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平）的基本原理、基因表達(dá)調(diào)控的基本模式、基因發(fā)生突變與交換及DNA遺傳多型性檢測(cè)的分子生物學(xué)原理，了解新興起的基因組學(xué)和后基因組學(xué)研究

2、現(xiàn)狀。通過(guò)與實(shí)驗(yàn)課相結(jié)合，系統(tǒng)地介紹與基因克隆相關(guān)的DNA技術(shù)，使學(xué)生們掌握一些基本的分子生物學(xué)技術(shù)。三、教材及有關(guān)參考書朱玉賢等，現(xiàn)代分子生物學(xué)高等教育出版社，2002Benjamin Lewin編著 余龍等主譯，Gene 科學(xué)出版社，2005趙壽元等，現(xiàn)代遺傳學(xué)高等教育出版社，2001孫乃恩等，分子遺傳學(xué)南京大學(xué)出版社，1990四、適用專業(yè)生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物工程、科學(xué)教育等專業(yè)五、授課學(xué)時(shí) 48學(xué)時(shí)六、課程內(nèi)容第一章 緒論教學(xué)目的：使學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史、分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容及發(fā)展前景有較全面的了解。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：基因概念的發(fā)展與演變；對(duì)現(xiàn)代遺傳學(xué)各發(fā)展階段的認(rèn)識(shí)。課時(shí)安排：

3、3學(xué)時(shí)教學(xué)內(nèi)容：一、 什么是分子生物學(xué)？分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)。二、 分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史從1847年Schleiden和Schwann提出細(xì)胞學(xué)說(shuō)，證明動(dòng)、植物都是由細(xì)胞組成的到今天，雖然不過(guò)短短一百多年時(shí)間，我們對(duì)生物大分子-細(xì)胞的化學(xué)組成卻有了深刻的認(rèn)識(shí)。孟德?tīng)柕倪z傳學(xué)規(guī)律最先使人們對(duì)性狀遺傳產(chǎn)生了理性認(rèn)識(shí)，而Morgan的基因?qū)W說(shuō)則進(jìn)一步將性狀與基因相耦聯(lián)，成為分子遺傳學(xué)的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。在蛋白質(zhì)化學(xué)方面，繼Sumner在1936

4、年證實(shí)酶是蛋白質(zhì)之后，Sanger利用紙電泳及層析技術(shù)于1953年首次闡明胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，開(kāi)創(chuàng)了蛋白質(zhì)序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術(shù)解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結(jié)構(gòu)，論證了這些蛋白質(zhì)在輸送分子氧過(guò)程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構(gòu)型的先驅(qū)?？偨Y(jié)與分子生物學(xué)相關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)。三、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容1 DNA重組技術(shù)-基因工程基因工程指將不同DNA片段（如某個(gè)基因或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。DNA重組技術(shù)有著廣

5、闊的應(yīng)用前景： 在生物技術(shù)制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。如：利用基因工程技術(shù)改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)；利用克隆的基因表達(dá)生產(chǎn)有用的肽類和蛋白質(zhì)藥物或疫苗。定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)，使它們具備某些特殊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。如：基因的克隆與分析；啟動(dòng)子分析。2基因表達(dá)調(diào)控因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子參與并控制了細(xì)胞的一切代謝活動(dòng)，而決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和合成時(shí)序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現(xiàn)為特定的核苷酸序列，所以基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時(shí)序發(fā)生變化（時(shí)序調(diào)節(jié)），并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正（環(huán)境調(diào)控）。原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)都

6、比真核生物簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一時(shí)間和空間內(nèi)發(fā)生，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生物有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程在時(shí)間和空間上都被分隔開(kāi)，且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有復(fù)雜的信息加工過(guò)程，其基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同的水平上?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在信號(hào)傳導(dǎo)研究、轉(zhuǎn)錄因子研究及RNA剪輯3個(gè)方面。3生物大分子結(jié)構(gòu)功能-結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究（又稱結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)） 一個(gè)生物大分子，無(wú)論是核酸、蛋白質(zhì)或多糖，在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必須具備兩個(gè)前提:首先，它擁有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)）；其次，在它發(fā)揮生物學(xué)功能的過(guò)程中必定存在著結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定

7、的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。它包括結(jié)構(gòu)的測(cè)定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)變化規(guī)律的探索及結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的建立3個(gè)主要研究方向。最常見(jiàn)的研究三維結(jié)構(gòu)及其運(yùn)動(dòng)規(guī)律的手段是X射線衍射的晶體學(xué)（又稱蛋白質(zhì)晶體學(xué)），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液相結(jié)構(gòu)，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學(xué)方法研究生物高分子的空間結(jié)構(gòu)。4功能基因組學(xué)與生物信息學(xué)研究先后完成了包括從大腸桿菌、釀酒酵母到線蟲(chóng)等十余種模式生物基因組全序列的測(cè)定工作，并于2002年2月12日完成人類基因組測(cè)序工作。世界兩大最著名的學(xué)術(shù)刊物nature和science同時(shí)發(fā)表了人類基因組全序列?；蚪M測(cè)序工作的進(jìn)展

8、是非常令人振奮的。 但是也隨之產(chǎn)生了新問(wèn)題。大量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個(gè)問(wèn)題。在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。因此讀懂基因組稱為后基因組時(shí)代的生命科學(xué)領(lǐng)域面臨的巨大的挑戰(zhàn)。在功能基因組時(shí)代，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，高通量地注釋基因組所有編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能是一個(gè)重要的特征。生物信息學(xué)是在各種“組學(xué)”研究的推動(dòng)下發(fā)展起來(lái)的.傳統(tǒng)的研究方法是只研究某一個(gè)基因或蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而“組學(xué)“的研究是采用高通量的技術(shù)分析細(xì)胞中全部的基因和蛋白質(zhì)，這樣勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生海量的信息，因此，人們必須尋求一種高速度、高效率、大規(guī)模的方式積累數(shù)據(jù)處理分析方法。四、分

9、子生物學(xué)展望未來(lái)的發(fā)展方向：不同模式生物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的比較分析；RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；表觀遺傳（epigenetic）信息的整合；從數(shù)據(jù)整合到系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology）。第二章 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)DNA教學(xué)目的：使學(xué)生了解并掌握DNA的結(jié)構(gòu)與功能教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及超螺旋結(jié)構(gòu)。課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)內(nèi)容：第一節(jié) DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)一、一級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成 所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。核苷酸序列對(duì)DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成有很大影響，如B-DNA中多聚（G-C）區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋DNA（Z-DN

10、A），而反向重復(fù)的DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)等。二、 一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列測(cè)定 目前所用的DNA測(cè)序方法是在末端終止法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。由英國(guó)科學(xué)家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列測(cè)定方面做出了杰出貢獻(xiàn)。他曾在1953年利用小片段重迭法成功測(cè)定了胰島素51個(gè)氨基酸序列，并獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1977年又利用末端終止法測(cè)定了FX174噬菌體得DNA序列，第二次獲得諾貝爾獎(jiǎng)。末端終止法又稱為雙脫氧法，基本原理是模擬體內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程在體外合成DNA，通過(guò)測(cè)定DNA片段的相對(duì)長(zhǎng)度來(lái)推斷核苷酸序列。至于成分大家不要死記，可以回憶一下DNA復(fù)制過(guò)程需要哪幾種組分：模板、dNTP、引物、DNA聚

11、合酶，其中一種dNTP的磷酸基團(tuán)用P32標(biāo)記。除此之外還需要每個(gè)管中分別加入一種ddNTP。DDNTP是雙脫氧核苷酸，由于在3位上缺少-OH，無(wú)法與下一個(gè)單體之間形成磷酸二酯鍵，因此，一旦摻入DNA鏈的延伸后，便終止DNA的合成這樣，在DNA聚合酶的作用下核苷酸鏈不斷延伸，我們可以調(diào)整dNTP和ddNTP的濃度，使ddNTP在每個(gè)位置上都有一個(gè)摻入的機(jī)會(huì)。每個(gè)管都會(huì)產(chǎn)生一系列長(zhǎng)短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最后一個(gè)堿基是相同的。我們將所得的所有DNA片段進(jìn)行凝膠電泳，長(zhǎng)度不同，泳動(dòng)的速度不同。8%-20%的聚丙烯酰胺可將相差一個(gè)堿基的DNA片段區(qū)分開(kāi)，由于dCTP是放射性標(biāo)記的，我們將

12、凝膠放射自顯影后，有DNA片段的位置就會(huì)顯示出相應(yīng)的信號(hào)帶。自下而上依次將堿基序列讀出。第二節(jié) DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)一、二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)DNA不僅具有嚴(yán)格的化學(xué)組成，還具有特殊的高級(jí)結(jié)構(gòu)，它主要以有規(guī)則的雙螺旋形式存在，其基本特點(diǎn)是： 1、 DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成的；2、 DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)；3、 兩條鏈上的堿基通過(guò)氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥(niǎo)嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對(duì)的堿基必定是G

13、。堿基之間的這種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系叫堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。組成DNA分子的堿基雖然只有4種，它們的配對(duì)方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構(gòu)成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個(gè)不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。二、變性、復(fù)性及雜交 變性：指雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，只涉及次級(jí)鍵的破壞。常用的DNA變性方法：熱變性和用變性劑處理。如何判斷DNA是否發(fā)生變性了呢？常用的方法是測(cè)定DNA的光吸收值。在堿基的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中存在共扼雙鍵，在240290nm波長(zhǎng)有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。（蛋白質(zhì)由于存在肽鍵，在280n

14、m有明顯的吸收峰）當(dāng)DNA變性時(shí)，有序的堿基排列被破壞，光吸收值顯著增加，該現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。當(dāng)緩慢增加DNA溶液的溫度時(shí)，記錄不同溫度下的A260的數(shù)值，即繪制成DNA的變性曲線。以溫度為橫坐標(biāo)，以A260為縱坐標(biāo)。當(dāng)A260增加到最大值的一半時(shí)，這時(shí)的溫度稱為DNA的溶解溫度或熔點(diǎn)，Tm表示。除此之外，光吸收法也是實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定DNA和RNA濃度和純度的一種方法。從某種樣品中提取了基因組DNA，可根據(jù)A260/A280的比值判斷其純度。 復(fù)性：變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)條件下重新締合成雙螺旋的過(guò)程。 雜交：在退火條件下，帶有互補(bǔ)核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的互補(bǔ)區(qū)段會(huì)形成雙

15、鏈結(jié)構(gòu)。分子雜交是分子生物學(xué)常用的技術(shù)，可用來(lái)檢測(cè)某一特定基因的時(shí)空表達(dá)情況和在基因組中的。分子雜交最初是由Southern設(shè)計(jì)出來(lái)的。當(dāng)時(shí)是用DNA探針檢測(cè)的DNA，也就是DNA與DNA的雜交，人們就將這種方法稱為是Southern blotting。在此基礎(chǔ)上，人們?cè)O(shè)計(jì)出DNA探針檢測(cè)RNA，稱為Northern blotting?；蛐酒墓ぷ髟砼c經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southern、northern）是一致的，都是探針和互補(bǔ)的靶基因結(jié)合，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析?；蛐酒―NA microarray）指將N個(gè)目的DNA用自動(dòng)化設(shè)備點(diǎn)在固體支持物上，DNA經(jīng)固化后，用

16、不同顏色的熒光標(biāo)記的探針對(duì)這些DNA同時(shí)進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果呈現(xiàn)的不同顏色，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析后得到關(guān)于N個(gè)基因表達(dá)情況的數(shù)據(jù)。第三節(jié) DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)一、 超螺旋結(jié)構(gòu)及拓?fù)洚悩?gòu)體雙螺旋DNA進(jìn)一步扭曲盤繞則形成其三級(jí)結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。自從1965年Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋以來(lái)，現(xiàn)已知道絕大多數(shù)原核生物都是共價(jià)封閉環(huán)(covalently closed circle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)。有些單鏈環(huán)形染色體(如174)或雙鏈線形染色體(如噬菌體入)，在其生活周期的某一階

17、段，也必將其染色體變?yōu)槌菪问?。?duì)于真核生物來(lái)說(shuō)，雖然其染色體多為線形分子但其DNA均與蛋白質(zhì)相結(jié)合，兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)之間的DNA形成一個(gè)突環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)，類似于CCC分子，同樣具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分為正超螺旋和負(fù)超螺旋兩種。真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體結(jié)構(gòu)時(shí)，存在著負(fù)超螺旋。研究發(fā)現(xiàn)，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生的。二、 拓?fù)洚悩?gòu)變化的生物學(xué)意義DNA拓?fù)洚悩?gòu)的變化是DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程所必須的。一個(gè)閉合的DNA 分子可以用其連環(huán)數(shù)進(jìn)行描述，連環(huán)數(shù)(Linking number) 是指一條鏈空間跨越另一條鏈的次數(shù)。順序相同的閉合DNA 分子可能有不同

18、的連環(huán)數(shù)，這反映了超螺旋程度的差異。連環(huán)數(shù)不同的相同DNA 分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體(Topological isomers) 。連環(huán)數(shù)由兩個(gè)成分組成：纏繞數(shù)(Writhing number ,W) 和扭轉(zhuǎn)數(shù)(Twisting number, T) 。扭轉(zhuǎn)數(shù)T 是雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)自身的一種性質(zhì)，代表一條鏈繞另一條鏈旋轉(zhuǎn)的雙螺旋總?cè)?shù)。它由每一圈配對(duì)的堿基數(shù)決定。對(duì)于平放在平面上的一個(gè)松弛的閉合環(huán)狀DNA 來(lái)說(shuō)，用堿基對(duì)的總數(shù)除以每一圈的堿基對(duì)數(shù)就是它的扭轉(zhuǎn)數(shù)。纏繞數(shù)W 代表雙螺旋軸在空間上的彎曲，在直觀上與超螺旋的概念相對(duì)應(yīng)，但并非具有完全相同的數(shù)量上的定義或衡量。對(duì)于一個(gè)松弛分子，W=0 時(shí)連環(huán)數(shù)等于

19、扭轉(zhuǎn)數(shù)。我們經(jīng)常用下面的公式計(jì)算連環(huán)數(shù)的變化量：L=W+T第三章 染色體和基因教學(xué)目的：使學(xué)生掌握基因組的概念、原核生物基因組的特點(diǎn)和真核生物染色體及基因組特點(diǎn)。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：真核生物染色體的基本特征；衛(wèi)星DNA及在分子標(biāo)記中的應(yīng)用；斷裂基因；基因家族及串連重復(fù)基因簇。課時(shí)安排：6學(xué)時(shí)教學(xué)內(nèi)容：第一節(jié) 基因組大小與C值矛盾一、基因組概念一個(gè)物種單倍體的染色體的數(shù)目，稱為基因組?；蚪M中DNA 的總量是物種所特有的，稱為C 值(C-value) 。C 值的范圍變化很大，從微生物中的1011。圖3.1 總結(jié)了進(jìn)化中不同門類生物的C 值范圍。隨著復(fù)雜度增加，每組中最小基因組大小也會(huì)隨著增加。三、

20、C值矛盾現(xiàn)象單倍體基因組DNA 含量在低等真核生物中與形態(tài)復(fù)雜性有一定的正相關(guān)，但在高等真核生物中卻非如此，它們的單倍體基因組DNA 含量變化不定?；蚪M大小與遺傳復(fù)雜性并非線性相關(guān)，稱為C 值矛盾(Paradox) 。它涉及到真核基因組絕對(duì)和相對(duì)的DNA 數(shù)量。例如，蟾蜍Xenopus 和人類基因組大小差不多，但是人類遺傳發(fā)育上更為復(fù)雜。在表面復(fù)雜程度相似的種屬間(見(jiàn)圖) 也存在C 值矛盾，這個(gè)問(wèn)題局限于一些種族內(nèi)，昆蟲(chóng)、兩棲和植物最為明顯。在兩棲中，最小的基因組1 而m 為1-4 ；3端具有單鏈尾，且富含GT。端粒一方面可保護(hù)線性DNA免受核酸酶攻擊，另一方面，利用用從頭合成的方式加入重復(fù)

21、，能抵消在染色體端部無(wú)法復(fù)制所導(dǎo)致的重復(fù)丟失。 討論端粒與壽命的關(guān)系。第四節(jié) 真核生物的基因一、 真核生物基因組中包含非重復(fù)序列和重復(fù)序列1重復(fù)序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，它占DNA總量的40%80%。多為結(jié)構(gòu)基因。2中度重復(fù)序列 這類重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在10104之間，占總DNA的10%40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。該類基因一般不編碼。3高度重復(fù)序列衛(wèi)星DNA 這類DNA只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10%60%，由6100個(gè)堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)幾百萬(wàn)次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開(kāi)，形成含量

22、較大的主峰及高度重復(fù)序列小峰，后者又稱衛(wèi)星區(qū)帶（峰）。該類基因一般不轉(zhuǎn)錄。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列是由比衛(wèi)星序列的重復(fù)序列單位更短的單位構(gòu)成，其重復(fù)單位的長(zhǎng)度分別為10100bp和10bp，而重復(fù)序列單位的數(shù)目通常為550個(gè)，不同個(gè)體間重復(fù)序列單位數(shù)目變化很大。在人類中小衛(wèi)星位點(diǎn)是15kb的順序，此順序由長(zhǎng)15-100nt的重復(fù)單位組成。當(dāng)將人類的總DNA提出后，用限制性內(nèi)切酶切成不同長(zhǎng)度的片斷（各種小衛(wèi)星上都沒(méi)有酶切位點(diǎn)），然后以小衛(wèi)星DNA中的特異順序?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交，可發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性片斷的長(zhǎng)度各不相同。由于不同個(gè)體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目和位置都不相同，所以小衛(wèi)星DNA的Southern雜

23、交帶譜就具有高度的個(gè)體特異性，人們就稱其為DNA指紋分析技術(shù)（DNA fingerprints）。 二、 斷裂基因大多數(shù)真核生物的基因（包括編碼蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA的基因）由間隔的外顯子（表現(xiàn)在最終RNA產(chǎn)物中的序列）和內(nèi)含子（從初始轉(zhuǎn)錄物中去除的序列）組成。 “一條基因，一種蛋白質(zhì)”應(yīng)修正為“一種蛋白質(zhì)，一條基因”。因?yàn)橐恍〥NA序列編碼一種以上蛋白質(zhì)。三、 基因家族與基因簇真核生物的基因組中有許多來(lái)源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因，這樣一組基因稱為基因家族（gene family）。 同一基因家族的不同成員緊密排列在一起，稱為基因簇（gene cluster）。但更多情況下是散布在不

24、同染色體上。如：珠蛋白基因、。同一家族成員是由同一個(gè)祖先基因經(jīng)過(guò)復(fù)制和變異傳遞下來(lái)的。四、 串連重復(fù)基因簇串連重復(fù)基因出現(xiàn)在其產(chǎn)物被極度需要的情況下，如組蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。如：組蛋白基因，編碼H1/H2A/H2B/H3/H4五種組蛋白的基因彼此靠近構(gòu)成一個(gè)重復(fù)單位，這樣的重復(fù)單位串連在一起。rRNA基因，真核生物中的5.8S/18S/28S rRNA（主體rRNA ）基因組成重復(fù)單位，轉(zhuǎn)錄出一個(gè)45S rRNA前體，然后通過(guò)轉(zhuǎn)錄后處理。此外，還有，tRNA基因也是串連重復(fù)排列，但各重復(fù)單位中的各tRNA可以不同。五、 假基因 基因組中因突變而失活的基因，它和同一家族的活躍基

25、因在結(jié)構(gòu)和DNA序列上有相似性。第三章DNA復(fù)制教學(xué)目的：使學(xué)生掌握DNA復(fù)制的機(jī)理及一般過(guò)程、復(fù)制的各階段的主要生物學(xué)事件、復(fù)制的方式、復(fù)制的調(diào)控、DNA修復(fù)系統(tǒng)。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：復(fù)制的機(jī)理；復(fù)制的起始；端粒的復(fù)制。課時(shí)安排：6學(xué)時(shí)教學(xué)內(nèi)容：第一節(jié)DNA復(fù)制的機(jī)理及一般過(guò)程一、半保留復(fù)制半保留復(fù)制：Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)即推測(cè)，DNA在復(fù)制時(shí)首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開(kāi)，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。1957年，梅塞爾和斯塔爾利用大腸桿菌（E

26、Coli）研究遺傳物質(zhì)DNA。在這項(xiàng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，他們先將大腸桿菌放入只含有既氮15（氮14的同位素）的營(yíng)養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將這些大腸桿菌轉(zhuǎn)移到只含氮14的營(yíng)養(yǎng)基中。提取不同培養(yǎng)代數(shù)細(xì)菌的DNA，用CsCl密度梯度離心。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在全部由15N標(biāo)記的培養(yǎng)基中得到的15N-DNA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。當(dāng)轉(zhuǎn)入14N標(biāo)記的培養(yǎng)基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是15N-DNA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個(gè)區(qū)帶，這表明它們分別為15N14NDNA和14N14N-DNA。隨著以后在14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶逐漸減弱，離心結(jié)束后，

27、從管底到管口，CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在與其相當(dāng)?shù)腃sCl密度處，在紫外光下可以看到DNA分子形成的區(qū)帶。為了證實(shí)第一代雜交分子確實(shí)是一半15N-DNA半14NDNA，將這種雜交分子經(jīng)加熱變性，對(duì)于變性前后的DNA分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心，結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶(15NDNA)及低密度帶(14NDNA)。它們的實(shí)驗(yàn)只有用半保留復(fù)制的理論才能得到圓滿的解釋。二、 半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模虼?，在?fù)制起點(diǎn)處兩條DNA鏈解開(kāi)成單鏈時(shí)，一條是53方向，另一條是35方向。當(dāng)以這兩條鏈為模板

28、時(shí)，新生鏈延伸方向一條為35，另一條為53。但生物細(xì)胞內(nèi)所有催化DNA聚合酶都只能催化53延伸，這是一個(gè)矛盾。岡崎片段(Okaxaki fragments)的發(fā)現(xiàn)使這個(gè)矛盾得以解決。在復(fù)制起點(diǎn)兩條鏈解開(kāi)形成復(fù)制泡(replication bubbles)，DNA向兩側(cè)復(fù)制形成兩個(gè)復(fù)制叉(replication forks)。以復(fù)制叉移動(dòng)的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?5，以此為模板而進(jìn)行的新生DNA鏈的合成沿53方向連續(xù)進(jìn)行，這條鏈稱為前導(dǎo)鏈(leading strand)。另一條模板鏈的方向?yàn)?3，以此為模板的DNA合成也是沿53方向進(jìn)行，但與復(fù)制叉前進(jìn)的方向相反，而且是分段，不連續(xù)合成的，這條

29、鏈稱為滯后鏈(lagging strand)，合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。第二節(jié) 復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程總的說(shuō)來(lái)包括起始、延伸和終止三個(gè)階段。一、復(fù)制的起始 1復(fù)制的起始原點(diǎn) 很多實(shí)驗(yàn)都證明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開(kāi)始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(diǎn)(originof replication)常用ori或O表示。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開(kāi)始就會(huì)連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開(kāi)始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或

30、復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中，每個(gè)DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因而只有一個(gè)復(fù)制子，而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始的，所以每個(gè)DNA分子上有許多個(gè)復(fù)制子。DNA復(fù)制起始點(diǎn)有結(jié)構(gòu)上的特殊性，例如：大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點(diǎn)Oric由422個(gè)核苷酸組成，是一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個(gè)核苷酸或13個(gè)核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識(shí)別的位置，大腸桿菌染色體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復(fù)制是典型的“”型復(fù)制(由于形狀像希臘字母，見(jiàn)下圖)。從一個(gè)起點(diǎn)開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)兩個(gè)復(fù)制方向相遇

31、時(shí)，復(fù)制就停止。而有些生物的DNA復(fù)制起始區(qū)是一段富含AT的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)于在DNA復(fù)制起始過(guò)程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識(shí)別和結(jié)合都是必須的。2復(fù)制的方向3DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)解鏈酶：DNA開(kāi)始復(fù)制時(shí)首先在起始點(diǎn)處解開(kāi)雙鏈，反應(yīng)是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進(jìn)行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿53方向移動(dòng)，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿35方向移動(dòng)。解鏈酶的作用就是打開(kāi)DNA雙鏈之間的氫鍵。單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)：它與解開(kāi)的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會(huì)再度螺旋化并且避

32、免核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時(shí)的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用。DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開(kāi)始，隨從鏈DNA的合成也隨著開(kāi)始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對(duì)簡(jiǎn)單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由DnaB. DnaC和單鏈結(jié)合蛋白組成。引物酶 (primase)是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等，它們?cè)贒NA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個(gè)磷酸二酯鍵的

33、位置。高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來(lái)，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開(kāi)始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3-OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開(kāi)始。二、DNA的延伸由DNA聚合酶催化完成。1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，(DNA polymerase ,簡(jiǎn)寫DNA pol)后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶、 、和 ，其中主要的復(fù)制酶是DNA聚合酶。當(dāng)聚合酶的一個(gè)亞基連續(xù)合成先導(dǎo)鏈時(shí)，另一個(gè)亞基在模板鏈所形成的大單鏈環(huán)中，循環(huán)式起始

34、、終止后隨鏈上岡崎片段的合成。真核生物的NA聚合酶可分為復(fù)制所需的酶如：、和損傷修復(fù)所需的酶、，其中， DNA聚合酶起始DNA鏈的合成， DNA聚合酶延伸先導(dǎo)鏈，另一個(gè)DNA聚合酶或延伸后隨鏈。 DNA聚合酶負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。真核生物線性DNA末端的端粒是怎樣合成的呢？四膜蟲(chóng)抽提物中有一種酶，稱端粒酶(Telomerase)，它使用端粒鏈的G+T 的3-OH 作為引物合成隨機(jī)的TTGGGG 重復(fù)。此反應(yīng)只需要dGTP 與dTTP。端粒酶是一個(gè)大的核糖核蛋白，它含有一個(gè)短RNA 組分，四膜蟲(chóng)中長(zhǎng)159nt 而在Euplotes 中長(zhǎng)192nt 。每個(gè)RNA 都含有一個(gè)15-22nt 的序列

35、和一個(gè)富含C 的重復(fù)序列的重復(fù)相同。這種RNA 為合成富含G 的重復(fù)序列提供模板。三、復(fù)制的終止當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminus region（ter，帶有多個(gè)20bp序列）時(shí)，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點(diǎn)像一個(gè)陷井（trap），使復(fù)制叉只能進(jìn)入，不能出來(lái)。Ter的功能主要是由Ter-Tus復(fù)合物（ter utilization substance）來(lái)完成的。第三節(jié) 復(fù)制的方式一、線狀DNA的復(fù)制方式1中間起始：如前所述.2末端起始：腺病毒的形態(tài)是特征性的二十面體病毒殼體，腺病毒基因組是一個(gè)線性的雙鏈DNA，其5端與一種末端蛋白（TP）共價(jià)結(jié)合（Rekosh et al., 1977），5端上

36、還具有末端反向重復(fù)序列（ITRs）。在腺病毒的每個(gè)5末端都共價(jià)連接一個(gè)55Kda的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)稱為末端蛋白質(zhì)（terminal protein TP），以其絲氨酸羥基通過(guò)磷酸二酯鍵與5端的胞嘧啶共價(jià)連接。TPC核苷酸的自由末端3-OH通過(guò)DNA聚合酶引導(dǎo)延伸反應(yīng)。這就產(chǎn)生了一條新鏈，其5末端與起始核苷酸C共價(jià)相連。二、環(huán)狀DNA的復(fù)制方式1q復(fù)制：具有雙鏈環(huán)狀DNA分子的細(xì)菌和病毒所采用的復(fù)制方式。DNA在復(fù)制原點(diǎn)解開(kāi)成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈，則出現(xiàn)兩個(gè)叉子狀的生長(zhǎng)點(diǎn)，叫做復(fù)制叉，因此也稱為復(fù)制叉式復(fù)制。可雙向or單向，若是雙向，可等速or不等速。2滾環(huán)復(fù)制：隨后缺口產(chǎn)生的自

37、由3-OH末端被聚合酶延伸。新合成的鏈取代原母鏈。 這種結(jié)構(gòu)被稱為滾環(huán)，因?yàn)檠由禳c(diǎn)圍繞環(huán)形模板鏈滾動(dòng)，形成一個(gè)多聚單鏈的尾巴。當(dāng)這條鏈甩到一定程度時(shí)開(kāi)始以半不連續(xù)的方式合成其互補(bǔ)鏈。滾環(huán)復(fù)制在噬菌體中普遍存在。例如：噬菌體X174含有單鏈環(huán)形DNA，稱為正（+）鏈。在復(fù)制前首要合成其互補(bǔ)鏈即負(fù)（-）鏈，產(chǎn)生了雙鏈環(huán)形DNA分子，以滾環(huán)方式復(fù)制。噬菌體的基因組編碼的A蛋白結(jié)合在復(fù)制原點(diǎn)，在正鏈上產(chǎn)生切斷磷酸二酯鍵。切割后A蛋白仍然與5末端相連，而3末端則在DNA聚合酶的作用下延伸。SSB蛋白不斷地結(jié)合到甩出的單鏈上，并改變其構(gòu)型，趨向環(huán)化。當(dāng)被置換鏈達(dá)到一個(gè)單位長(zhǎng)度時(shí)，A蛋白可識(shí)別復(fù)制原點(diǎn)，將鏈

38、切斷，進(jìn)一步將切下的單位的長(zhǎng)度的DNA環(huán)化。A蛋白釋放，開(kāi)始另一循環(huán)。環(huán)化后被取代的正（）鏈可以作為模板合成互補(bǔ)負(fù)（）鏈或被包裹到病毒體中。另外，滾環(huán)復(fù)制為基因擴(kuò)增提供了一種方式。見(jiàn)分子遺傳學(xué)P109-110。3D環(huán)復(fù)制：真核生物線粒體DNA的復(fù)制方式。線粒體的H和L鏈上各有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，在復(fù)制開(kāi)始時(shí)，H鏈起始位點(diǎn)的復(fù)制像通常一樣通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出的RNA可作為引物，再由DNA聚合酶在引物的3末端進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)。隨著鏈的延伸，新合成的L鏈取代了親本L鏈，而產(chǎn)生一個(gè)替換環(huán)，稱為D環(huán)。D環(huán)不斷伸展，當(dāng)伸展到環(huán)三分之二處時(shí)，被取代的L鏈上的復(fù)制起始點(diǎn)暴露出來(lái)，隨后由特異的引發(fā)酶

39、在該位點(diǎn)合成一段RNA引物，開(kāi)始H鏈的復(fù)制。由于啟動(dòng)的延遲，當(dāng)新L鏈合成結(jié)束時(shí)，新H鏈合成僅繞環(huán)三分之一圈。這樣就釋放出一個(gè)完整的雙鏈環(huán)和一個(gè)開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)。第四節(jié) 復(fù)制的調(diào)控一、原核生物復(fù)制的調(diào)控原核生物復(fù)制的起始主要是由起始位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)來(lái)控制的。起始位點(diǎn)的A可被Dam甲基化酶所甲基化。在復(fù)制之前，起始位點(diǎn)的兩條鏈都被甲基化，而復(fù)制后產(chǎn)生的DNA是半甲基化的。半甲基化的子鏈起始點(diǎn)只有在它們重新全部甲基化后才有起始功能。二、真核生物復(fù)制的調(diào)控 在真核生物中，DNA的復(fù)制同樣受到細(xì)胞周期的嚴(yán)格控制。在每一個(gè)起始點(diǎn)都需要執(zhí)照因子來(lái)起始復(fù)制。執(zhí)照因子是一種特殊的蛋白質(zhì)，不能隨意的穿越核膜。它在復(fù)制之前

40、就已存在于細(xì)胞核中，一輪復(fù)制就會(huì)將這個(gè)因子失活或破壞。而細(xì)胞質(zhì)中的執(zhí)照因子也不能進(jìn)入，因此DNA的復(fù)制不會(huì)被重復(fù)起始。只有在細(xì)胞發(fā)生有絲分裂期間，核膜發(fā)生破裂，執(zhí)照因子才趁機(jī)進(jìn)入核內(nèi)，DNA的復(fù)制才可被起始。這樣，就保證了復(fù)制的起始必須在經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞分裂過(guò)程之后才能重新發(fā)生。第五節(jié)DNA的修復(fù)系統(tǒng)一、復(fù)制修復(fù)1、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)：錯(cuò)配矯正酶、 Pol 、DNA連接酶2、尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)：尿嘧啶N糖基酶、AP內(nèi)切酶、Pol 、DNA連接酶 二、損傷修復(fù)1、光復(fù)活：在可見(jiàn)光的活化之下由光復(fù)活酶催化胸腺嘧啶二聚體分解成單體的過(guò)程。2、切除修復(fù)：修復(fù)內(nèi)切酶能識(shí)別引起DNA雙螺旋變性的損傷，由UvrA、Uv

41、rB和UvrC三種亞基構(gòu)成 3、重組修復(fù)：RecA具有催化DNA分子之間同源聯(lián)會(huì)和交換單鏈的功能。4、SOS修復(fù)：允許新生的DNA鏈越過(guò)TT二聚體而生長(zhǎng)，其代價(jià)時(shí)保真度極大降低。SOS修復(fù)是導(dǎo)致突變的修復(fù),它的介入時(shí)紫外線誘導(dǎo)突變的主要原因。第五章 轉(zhuǎn)錄教學(xué)目的：使學(xué)生掌握RNA合成的酶學(xué)特征、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的過(guò)程、轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程及逆轉(zhuǎn)錄。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子結(jié)構(gòu)；RNA的剪接；核酶。課時(shí)安排：6學(xué)時(shí)教學(xué)內(nèi)容：第一節(jié)RNA合成的酶學(xué)執(zhí)行生命功能、表現(xiàn)生命特征的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)分子。DNA貯存著決定生物特征的遺傳信息，只有通過(guò)蛋白質(zhì)才能表達(dá)出它的生命意義，直接決定蛋白質(zhì)合成及蛋白質(zhì)特征的不

42、是RNA而是DNA，因而人們確定DNA是遺傳信息貯存者后就推測(cè)DNA是通過(guò)RNA去決定蛋白質(zhì)合成的。50年代末RNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)開(kāi)始證實(shí)了這一推測(cè)。以DNA為模板合成RNA的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription），由RNA聚合酶催化完成。一、RNA合成的基本特征RNA的轉(zhuǎn)錄合成從化學(xué)角度來(lái)講類似于DNA的復(fù)制，多核苷酸鏈的合成都是以53的方向，在3-OH末端與加入的核苷酸磷酸二酯鍵，但是，由于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的目的不同，轉(zhuǎn)錄又具有其特點(diǎn)：（1）對(duì)于一個(gè)基因組來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因，而且每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄都受到相對(duì)獨(dú)立的控制；（2）轉(zhuǎn)錄是不對(duì)稱的；（3）轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續(xù)

43、的；（4）都以四種三磷酸核苷的底物；（4）RNA聚合酶缺乏35外切酶活性，所以沒(méi)有校正功能。二、原核生物的RNA聚合酶大腸桿菌RNA聚合酶的研究得比較透徹的，這是一個(gè)分子量達(dá)50多萬(wàn)，全酶由五咱亞基組成，去掉亞基的部分稱為核心酶，核心酶本身就能催化苷酸間磷酸二酸鍵形成。利福平和利福霉素能結(jié)合在亞基上而對(duì)此酶發(fā)生強(qiáng)烈的抑制作用。亞基似乎是酶和核苷酸底物結(jié)合的部位。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄是在DNA特定的起始點(diǎn)上開(kāi)始的，亞基的功能是辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的。亞基是酶與DNA模板結(jié)合的主要成分。亞基可能與轉(zhuǎn)錄基因的類型和種類有關(guān)。二、真核生物的RNA聚合酶真核生物中已發(fā)現(xiàn)有四種RNA聚合酶，分別稱為RNA聚合酶、和線粒體

44、RNA聚合酶，分子量大致都在50萬(wàn)道爾頓左右，它們專一性地轉(zhuǎn)錄不同的基因，因此由它們催化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也各不相同。RNA聚合成RNA的活性最顯著，它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因。而細(xì)胞內(nèi)絕大部分RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶，位于核質(zhì)中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不勻一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前體。RNA聚合酶負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶特異性抑制劑，三種真核生物RNA聚合酶對(duì)鵝膏蕈堿的反應(yīng)不同。原核生物靠RNA聚合酶就可完成從起始、延長(zhǎng)、終止的轉(zhuǎn)錄全過(guò)程，真核生物轉(zhuǎn)錄除RNA聚合酶外還需另一此叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子參與轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程，第二節(jié)

45、 控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)一、原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)Pribnow框：在起始點(diǎn)上游，幾乎在所有啟動(dòng)子都存在一個(gè)6 bp富含A/T區(qū)域TATAAT。通常位于18位到9位，稱為Pribnow框。該區(qū)域是RNA聚合酶牢固結(jié)合位點(diǎn)，RNA聚合酶結(jié)合后，這一富含A/T的DNA雙鏈解開(kāi)。Sextama框：位于35區(qū)附近有一TTGACA序列，是RNA聚合酶中的因子識(shí)別位點(diǎn)。以上這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始都是非常重要的。因子識(shí)別35區(qū)并與之結(jié)合。由于RNA聚合酶分子覆蓋面積能達(dá)到70bp，因此酶分子上的一個(gè)合適部位能接觸10區(qū)。酶分子一旦與10區(qū)結(jié)合以后，就從識(shí)別位點(diǎn)上解離下來(lái)。此外，35序列的重要性還

46、在于在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度。在35區(qū)和10區(qū)之間的堿基序列不特別重要，但是這兩個(gè)序列之間的距離卻十分重要，是決定啟動(dòng)子強(qiáng)度的因素之一大多為15 bp20 bp。二、真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)有三種類型的啟動(dòng)子，其中類啟動(dòng)子最為復(fù)雜。類啟動(dòng)子由核心元件（core element）和上游啟動(dòng)子元件（upstream promoter element，UPE）組成。核心元件包括TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。mRNA的第一個(gè)堿基傾向A，另一側(cè)翼由Py組成。TATA框合又稱Hogness框，Goldberg-Hogness框，其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位點(diǎn)的上游-2

47、5左右，相當(dāng)于原核的-10序列。上游元件包括CAAT box、GC box、等。如CAAT box一般位于上游-75bp左右，緊靠-80，其功能是控制轉(zhuǎn)錄起始活性。遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)較常見(jiàn)的是增強(qiáng)子。啟動(dòng)子位于起始位點(diǎn)的下游的轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，因此稱為下游啟動(dòng)子（downstream promoter）或基因內(nèi)啟動(dòng)子（intragenenic promoter）。轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子TFA、B和C的參與。三、鑒定啟動(dòng)子的方法1、足跡法：是一種測(cè)定結(jié)合蛋白在上的結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法，其根據(jù)是的這些區(qū)域在結(jié)合有蛋白質(zhì)時(shí)可被保護(hù)而免受核酸內(nèi)切酶的作用酶切后產(chǎn)生片段與對(duì)照的酶切片段經(jīng)凝膠電泳分離后進(jìn)行比較，即找出與蛋白質(zhì)結(jié)

48、合的位點(diǎn)。2、缺失分析和點(diǎn)突變：對(duì)以上所獲得的DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)一步做缺失分析和點(diǎn)突變。第三節(jié) 轉(zhuǎn)錄的過(guò)程 一、轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄是從DNA分子的特定部位開(kāi)始的，這個(gè)部位也是RNA聚合酶全酶結(jié)合的部信這就是啟動(dòng)子。為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動(dòng)子處結(jié)合呢？顯然啟動(dòng)子處的核苷酸序列具有特殊性，為了方便，人們將在DNA上開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基定為+1，沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用負(fù)值表示。在原核生物中，當(dāng)RNA聚合酶的亞基發(fā)現(xiàn)其識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，全酶就與啟動(dòng)子的-35區(qū)序列結(jié)合形成一個(gè)封閉的啟動(dòng)子復(fù)合物。由于全酶分子較大，其另一端可在到-10區(qū)的序列，在某種作用下

49、，整個(gè)酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，在此處發(fā)生局部DNA12-17r 的解鏈形成全酶和啟動(dòng)子的開(kāi)放性復(fù)合物。在開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物中起始位點(diǎn)和延長(zhǎng)位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體充滿，在RNA聚合酶亞基催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酸鍵。RNA合成的第一個(gè)核苷酸總有GTP或ATP，以GTP常見(jiàn)，此時(shí)因子從全酶解離下來(lái)，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動(dòng)，而脫落的因子與另一個(gè)核心酶結(jié)合成全酶反復(fù)利用。真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，已經(jīng)知道，在所有的細(xì)胞中有一類叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。真核生物基因中，有專門為蛋白質(zhì)編碼

50、的基因，這些基因由RNA聚合酶負(fù)責(zé)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可大致分為二類；第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子它們與RNA聚合酶共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置上開(kāi)始。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有至成一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子D。TFD再與RNA聚合酶結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。除TFD以外，在細(xì)胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFA，TFF，TFE，TFH等，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用。從中也不難看出真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因的表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子

51、DNA調(diào)控?zé)o件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的復(fù)雜體系。第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這些TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類固醇激素，生長(zhǎng)因子或其它刺激后，開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)，才需要的一類轉(zhuǎn)錄因子。二、轉(zhuǎn)錄延伸RNA鏈的延長(zhǎng)靠核心酶的催化，在起始復(fù)合物上第一個(gè)GTP的核糖3-OH上與DNA模板能配對(duì)的第二個(gè)三磷酸核苷起反應(yīng)形成磷酸二酯鍵。聚合進(jìn)去的核苷酸又有核糖3-OH游離，這樣就可按模板DNA的指引，一個(gè)接一個(gè)地延長(zhǎng)下去。因此RNA鏈的合成方面也是53。由于DNA鏈與合成的RNA鏈具有反平行關(guān)系，所以RNA聚合酶是沿著DNA鏈35方向移動(dòng)。整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)

52、程是由同一個(gè)RNA聚合酶來(lái)完成的一個(gè)連續(xù)下斷的反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄本RNA生成后，暫時(shí)與DNA模板鏈形成DNARNA雜交體，長(zhǎng)度約為12個(gè)堿基對(duì)，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄泡（見(jiàn)圖）。轉(zhuǎn)錄速度大允是每秒鐘30-50個(gè)核苷酸，但并不是以恒定速度進(jìn)行的。三、轉(zhuǎn)錄終止提供終止信號(hào)的序列稱為終止子（terminator）。內(nèi)源性終止子的回文結(jié)構(gòu)中富含GC，且回文結(jié)構(gòu)的下游有連續(xù)68個(gè)AT堿基對(duì)；弱終止子有回文結(jié)構(gòu)，但不具有強(qiáng)終止子的兩點(diǎn)特征，需要依賴于因子實(shí)現(xiàn)終止作用。因子（終止因子） ：是協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子，屬于ATP依賴的解旋酶家族，具有一個(gè)RNA結(jié)合域和ATP水解域。第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工是指將各種前體RNA分子加工成各種成熟RNA的過(guò)程。一、 真核生物mRNA的5Cap真核生物細(xì)胞mRNA的5 端加帽是在鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶的催化下通過(guò)5 5鍵把一個(gè)G加到轉(zhuǎn)錄物的末端堿基形成的，