1、.,Loading,.,基因組DNA 文庫的構(gòu)建,制作：# 主講： #,.,基因組DNA文庫與cDNA文庫,cDNA文庫： 以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增。 cDNA文庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細(xì)胞特異性。,.,基因組DNA文庫與cDNA文庫,基因組DNA文庫： 指將某生物的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度的DNA片段，再與適合的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落。 其實(shí)質(zhì)就是采用“化整為零”

2、策略，將龐大的基因分解成一段段，每段包含一個(gè)或幾個(gè)基因。,.,為什么要構(gòu)建基因組DNA文庫,對(duì)于高等真核生物，基因數(shù)量龐大且復(fù)雜，單個(gè)目的基因所占比例極其微小，難以直接分離。 為增加成功分離的可能性，需要將這個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，但由于分離的是未知基因，故無法進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只能構(gòu)建該生物材料的基因文庫。,.,構(gòu)建基因組DNA文庫的作用,分離有用的目的基因： 分離特點(diǎn)的基因片段； 分析特點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)； 研究基因表達(dá)調(diào)控。 保存生物的全部基因： 全基因組物理圖譜的構(gòu)建； 全基因組序列測(cè)定。,.,基因組DNA文庫的特點(diǎn),代表性 文庫中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該

3、文庫中分離任何一段 DNA 。 隨機(jī)性 采用機(jī)械切割或酶切法隨機(jī)斷裂DNA，保證克隆的隨機(jī)性。 增加文庫重組克隆的數(shù)目，提高覆蓋基因組的倍數(shù)。,.,Clark 和 Carbon 于1975年提出如下公式：,N：代表一個(gè)完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)數(shù)。 p：表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的概率。 f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組 DNA 大小的比值。,ln(1-p),ln(1-f),N= ,該公式用于預(yù)測(cè)一個(gè)完整基因組文庫應(yīng)該包含的克隆數(shù)目。,.,制作基因組DNA文庫的常用載體,噬菌體：最常用到的載體。 廣泛用于細(xì)菌、真菌等基因組較小的物種研究。 柯斯質(zhì)粒： 穩(wěn)定性較差，大量

4、復(fù)制易缺失。 細(xì)菌人工染色體（BAC）： P1源人工染色體（PAC）： 酵母人工染色體（YAC）： 可以插入大片段DNA，主要用于基因組做圖等。,.,基因組DNA文庫的制作,.,工具的準(zhǔn)備； 載體的制備； HMW DNA的提取 ； HMW DNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離； 載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞； 重組克隆的挑選和保存；,注1：高純度大分子量基因組DNA (High molecular weight DNA, HMW DNA)。 注2：構(gòu)建噬菌體文庫，連接產(chǎn)物不用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化宿主，而是采用包裝蛋白進(jìn)行包裝并侵染宿主。 注3：以下，以 噬菌體為例簡(jiǎn)述DNA文庫的制作過程

5、（P184）。,.,工具準(zhǔn)備,噬菌體載體； 限制性內(nèi)切酶Sau3A、BamH； 瓊脂糖凝膠（或蔗糖）； T4連接酶；,注1：Sau3A與BamH，是一對(duì)同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的粘性末端的一類限制性內(nèi)切酶。,載體的制備,cos L,R cos,BamH 位點(diǎn),載體DNA,cos L,R cos,B,B,可用載體DNA片段,棄去中間片段,HMW DNA的提取 脈沖電泳分級(jí)分離,真核基因組DNA （約3109bp）,Sau3 A做局部消化,被限制酶切開的DNA片段,S,S,瓊脂糖凝膠電泳,純化約20kb片段,體外包裝與轉(zhuǎn)化,cos L,R cos,B,B,S,S,T4連接酶,約20kbDN片段,體外包裝,重組噬菌體,侵染大腸桿菌,大腸桿菌,基因文庫,.,小結(jié),1.