1、DNA的損傷和修復(fù),南華大學(xué)心血管疾病研究所 動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,1,DNA 的損傷和修復(fù),Mutagen (誘變劑）,完全修復(fù),DNA 損傷,堿基的化學(xué)反應(yīng),損傷的修復(fù),不能有效修復(fù),不完全修復(fù),凋亡,畸變,回復(fù)正常,2,誘發(fā)DNA損傷的因素： 環(huán)境因素：輻射、化學(xué)毒物、藥物、病毒感染、植物和微生物代謝產(chǎn)物等。 生理因素：機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)、DNA復(fù)制錯(cuò)配、DNA本身的熱不穩(wěn)定性。,第一節(jié) 多種因素可引起DNA損傷并具有各自的機(jī)制,3,（一）輻射致DNA損傷 根據(jù)作用原理的不同： 電離輻射（粒子，粒子，射線，射線等） 直接作用：能量直接傳遞給大分子而引起結(jié)構(gòu)的破壞 間接作用

2、：輻射先作用于溶劑分子而產(chǎn)生活性物質(zhì)從 而導(dǎo)致細(xì)胞損傷 非電離輻射（紫外線以及能量低于紫外線的電磁輻射）,一、DNA損傷的因素及其機(jī)制,4,返回目錄,返回主頁(yè),5,紫外線的致?lián)p傷作用,6,（二）自由基致DNA損傷,自由基：指能夠獨(dú)立存在，核外帶有未配對(duì)電子的原子和分子。 自由基的產(chǎn)生可以是外界因素與體內(nèi)物質(zhì)共同作用的結(jié)果。 自由基可導(dǎo)致堿基、核糖、磷酸基的損傷，引起DNA的結(jié)構(gòu)和功能異常。,7,（三）化學(xué)毒物致DNA損傷,按其作用原理可分為： 堿基類似物 堿基修飾物 嵌入染料,8,1、堿基類似物（Base analog）,2-氨基嘌呤 2-Amino purine,5-溴尿嘧啶 5-Bromi

3、ne Uracil,是指與DNA正常堿基結(jié)構(gòu)類似的化合物,在DNA復(fù)制時(shí)摻入并與互補(bǔ)鏈上堿基配對(duì),從而引起堿基對(duì)的置換.,9,5-BrU,: G,: A,ATGC 轉(zhuǎn)變,烯醇式滲入為 GCAT 轉(zhuǎn)變,10,2、 堿基的化學(xué)修飾劑,又稱化學(xué)突變劑：指對(duì)DNA鏈中的堿基的修飾,改變其配對(duì)性質(zhì),進(jìn)而改變DNA結(jié)構(gòu)的化合物. 亞硝酸（nitrous acid HNO2） 羥氨（hydroxylamine HA） 甲磺酸乙酯（ethyl mathanesulfonate EMS） N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍 （N-mathyl-N-nitro-N-nitrosoguanidion NNG）,11,

4、（a）亞硝酸修飾G、C、A；（b）羥基修飾C；（c）甲基磺酸乙酯修飾T（引自Russell,1992）.,12,3、嵌入染料對(duì)DNA的損傷作用,吖啶橙 (Acridine Orange AO),扁平染料分子,溴化乙錠 (Ethidium Bromide EB ),-ATTTTTCG - -TAAAAAGC-,-AT EB TTTTCG- -TA,分子插入,X,AAAAGC-,結(jié)果產(chǎn)生移框突變,13,二、DNA損傷的類型,DNA分子中的堿基、核糖和磷酸二酯鍵等均是DNA損傷作用的靶點(diǎn)。 常見(jiàn)的損傷有:堿基脫落、堿基破壞、嘧啶二聚體形成、單鏈和雙鏈DNA斷裂、DNA交聯(lián)、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等。,1

5、4,（一） 堿基和核糖的破壞,由于堿基或者核糖的損傷，在DNA鏈上形成不穩(wěn)定位點(diǎn)，最終可導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。,15,16,DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(point mutation)。,發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1. 轉(zhuǎn)換,發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。,2. 顛換,（二）錯(cuò)配,17,鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb (HbS) 亞基,正常成人Hb (HbA)亞基,18,（三） DNA鏈斷裂,磷酸二酯鍵的斷裂和脫氧戊糖的破壞是引起DNA鏈斷裂的直接原因。 堿基的破壞和脫落在DNA鏈上形成的不穩(wěn)定位點(diǎn)是DNA鏈斷裂的間接原因。 單鏈斷裂（SSB）：一條

6、鏈斷裂的DNA雙股螺旋 雙鏈斷裂（DSB）：兩條鏈于同一處或緊密相鄰處同時(shí)斷裂。,19,（四）DNA交聯(lián),鏈間交聯(lián)：DNA雙螺旋鏈上一條鏈上的堿基和另一條鏈上的堿基以共價(jià)鍵結(jié)合 鏈內(nèi)交聯(lián)：DNA分子中同一條鏈內(nèi)的兩個(gè)堿基以共價(jià)鍵結(jié)合 DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)：DNA和蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合,20,第二節(jié) DNA損傷的修復(fù),DNA損傷的修復(fù)：指糾正錯(cuò)配的堿基，清除DNA鏈上的損傷，恢復(fù)DNA正常結(jié)構(gòu)的過(guò)程。 常見(jiàn)的DNA修復(fù)方式：直接修復(fù)、切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和重組修復(fù),21,(一）直接修復(fù),直接修復(fù) 細(xì)胞對(duì)DNA的某些損傷可以用很簡(jiǎn)單的方式加以修復(fù)在單一基因產(chǎn)物的催化下，一步反應(yīng)就可以完成。這種修復(fù)方式叫直

7、接修復(fù)。 包括：酶光學(xué)復(fù)活、嘌呤的直接插入、O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移、單鏈斷裂重接等。,22,1）、酶學(xué)光復(fù)活（photo reactivation ）,23,烷基化堿基可以直接修復(fù),24,2）嘌呤的直接插入 嘌呤插入酶 受損嘌呤APS 插入嘌呤（糖苷鍵）,嘌呤插入酶,K+,25,3）DNA單鏈斷裂重接 DNA單鏈斷裂中有一部分是通過(guò)簡(jiǎn)單的重接而修復(fù)的，只需要一種酶DNA連接酶(ligase)參加，因此也屬于直接修復(fù)。 DNA連接酶能催化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈缺口處的5磷酸根與相鄰的一個(gè)3羥基形成磷酸二酯健。連接所需的能量ATP(如動(dòng)物細(xì)胞)。,26,27,將損傷的部位（或連同其附近的一

8、定部位）切除，然后用正確配對(duì)的、完好的堿基替代修復(fù)。有多種酶和基因參與 過(guò)程：識(shí)別（損傷位點(diǎn)）切除修復(fù)（補(bǔ)）連接,酶和蛋白質(zhì),DNA聚合酶,DNA連接酶,(二)、切除修復(fù),按照產(chǎn)物的不同可以分：堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù),28,1)堿基切除： 特點(diǎn)是切除受損傷的堿基。主要過(guò)程是水解受損傷的堿基與脫氧核糖磷酸鏈之間的N糖苷鍵。反應(yīng)由一類糖基化酶催化。 也即：糖基化酶APS內(nèi)、外切酶去除殘基以對(duì)側(cè)鏈為模板修補(bǔ)DNA連接酶連接 整個(gè)修復(fù)過(guò)程可分以下幾步。,29,DNA糖苷酶識(shí)別切除改變的堿基 核酸內(nèi)切酶切除磷酸二酯鍵 DNA聚合酶填補(bǔ) DNA連接酶連接,30,2.識(shí)別的酶： （1）一類DNA糖苷酶

9、，各具特異性 e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶識(shí)別DNA中的U （由C突變而來(lái)） （2）作用： 識(shí)別-DNA中改變的堿基 水解-受損的堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵 使受損的堿基脫落,31,32,Ecoli的核苷酸切除修復(fù)機(jī)理。 在Ecoli中，UvrA，UvrB，UvrC三種蛋白必須同時(shí)存在才能發(fā)揮作用，所以也叫UvrABC切除核酸酶。 UvrA是一種腺苷三磷酸酶，是損傷識(shí)別蛋白。它與UvrB 結(jié)合成A2B1復(fù)合物，結(jié)合在損傷區(qū)，使DNA解旋、扭曲，并引起UvrB構(gòu)象改變，與損傷部位形成緊密的結(jié)合。 然后UvrA與UvrBDNA復(fù)合物解離，后者成為UvrC特異結(jié)合靶。 UvrB 在損傷的3側(cè)作一內(nèi)切，隨

10、而復(fù)合物構(gòu)象改變， UvrC 得以在5側(cè)作第二個(gè)切口。 解旋酶 (UvrD)使寡聚核苷酸片段及UvrC從DNA鏈上釋放，然后DNA聚合酶取代UvrB。修補(bǔ)缺損區(qū)；最后由連接酶連接補(bǔ)片。,2）. 核苷酸切除,33,34,35,當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)需要另一種機(jī)理來(lái)完成正確的修復(fù)。 一種情況是兩條鏈同時(shí)受到損傷；另一種情況是單鏈損傷尚未修復(fù)時(shí)發(fā)生了復(fù)制，造成對(duì)應(yīng)于損傷位置的新鏈缺乏正確模板；此時(shí)需要重組酶系將另一段未受損傷的雙鏈DNA移到損傷位置附近，提供正確的模板，進(jìn)行重組。這便是重組修復(fù)。,（三） 重組修復(fù),36,重組修復(fù) (鏈轉(zhuǎn)移修復(fù)),復(fù)制后修復(fù) 容易出錯(cuò),RecA, DNApolym

11、erae ligase,二聚體后起始,RecA,聚合酶、連接酶,重組修復(fù)后的損傷位點(diǎn)可 由其它機(jī)制進(jìn)一步修復(fù),37,DNApol (= 10-8) 經(jīng)第二次校正= 10-11,錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MRS Mismatch Repair System),錯(cuò)配修復(fù):堿基切除修復(fù)的一種特殊形式. 使復(fù)制的保真性提高102103倍,（四）、錯(cuò)配修復(fù),38,錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（Mismatch repair system）,DNA polymerase Helicase SSB 外切核酸酶 (和) 連接酶,MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S,（1）

12、組成,39, DNA合成過(guò)程中的甲基化變化,DNA中的GATC(palindromic seq.) 為m6A甲基化敏感位點(diǎn),平均每2kb左右有一GATC seq.,錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)受甲基化的引導(dǎo),40,甲基化程度的差異,a、MutH/MutS 掃描識(shí)別錯(cuò)配 堿基和鄰近的GATC序列 切點(diǎn)甲基化GATC中 G的5側(cè),DNA helicase II, SSB, exonuclease I去除包括錯(cuò) 配堿基的片段,DNA polymerase III 和 DNA ligase 填充缺口,昂貴的代價(jià)用于保證DNA的準(zhǔn)確性,（2） 修復(fù)過(guò)程,41,（五）. 易錯(cuò)修復(fù)（SOS修復(fù) SOS repair）,“S

13、OS”是國(guó)際上通用的緊急呼救信號(hào)。SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯(cuò)誤較多，故又稱為錯(cuò)誤傾向修復(fù)(errorprone repair)，使細(xì)胞有較高的突變率。 此系統(tǒng)由十幾個(gè)修復(fù)蛋白組成。調(diào)控蛋白LexA參與此 系統(tǒng)的啟動(dòng)。,42,（2） SOS 修復(fù)機(jī)制,SOS 修復(fù)無(wú)模板指導(dǎo)的DNA復(fù)制,大劑量的紫外線照射，大量的二聚體產(chǎn)生,SOS系統(tǒng)誘導(dǎo)，錯(cuò)誤潛伏的復(fù)制超越二聚體而進(jìn)行,43,SOS 修復(fù)只是SOS反應(yīng)的一部分,RecA在SOS反應(yīng) 反應(yīng)中起核心作用,RecA與LexA組成調(diào)控環(huán)路,RecA受LexA的部分抑制,44,RecA-P; 三種功能,45,當(dāng)DNA復(fù)制受阻/ DNA damaged,46,當(dāng)DNA復(fù)制度過(guò)難關(guān)后,47,二、參與DNA修復(fù)的主要基因,DNA修復(fù)相關(guān)基因： 直接參與DNA修復(fù)的基因 DNA修復(fù)調(diào)控相關(guān)的基因,48,第三節(jié) 生物標(biāo)記物可作為DNA損傷和修復(fù)的參考標(biāo)記,1. 甲基化損傷修復(fù)相關(guān)基因的突變可作為甲基化損傷的基因型標(biāo)記物。MGMT突變可以作為甲基化損傷的基因型標(biāo)記物。 2.切除修復(fù)相關(guān)的酶和基因可作為切除修復(fù)的生物標(biāo)記物。大腸桿菌Uvr基因家族，人ecrr基因。 3.錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因可作為檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)功能的標(biāo)記物。