1、第七章 免疫組化結(jié)果的分析和判斷 （要求：理解， 熟記， 會(huì)用）,第一節(jié) 免疫組化結(jié)果的判斷原則 免疫組化結(jié)果的判斷原則概括起來(lái)有以下幾點(diǎn)：,必須同時(shí)設(shè)對(duì)照染色。沒有對(duì)照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的。 抗原表達(dá)必須在特定部位。如LCA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi)； PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)；EMA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上，等等。不在抗原所在部位的陽(yáng)性著色，一概不能視為陽(yáng)性。,陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。由于檢測(cè)方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)，判斷時(shí)應(yīng)注意。,盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)，特別是酶免疫標(biāo)記。因?yàn)檫@類陽(yáng)性著

2、色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。,對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對(duì)化，應(yīng)結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析。,第二節(jié) 對(duì)照染色設(shè)計(jì),(一）對(duì)照染色的目的 設(shè)對(duì)照的目的是為了排除假陰性和假陽(yáng)性。假陰性的原因主要有三：組織處理不當(dāng)，抗原丟失過(guò)多或被遮蔽；抗體失活、效價(jià)過(guò)低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；染色步驟遺漏及差錯(cuò)，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強(qiáng)度不當(dāng)?shù)取?假陽(yáng)性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；抗體試劑不純(特別是一抗）；操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當(dāng)?shù)龋籉c受體的干擾，等等。,（二）對(duì)照的種類及其選用目的 對(duì)

3、照染色大致可分為陽(yáng)性組織對(duì)照、陰性組織及陰性試劑對(duì)照和自身對(duì)照四大類：,陽(yáng)性組織對(duì)照 指用已證實(shí)含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢實(shí)驗(yàn)切片同時(shí)作同樣處理和免疫染色的組織對(duì)照。正確的結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性，目的是為了證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。,陰性組織對(duì)照 指用已證實(shí)不含靶抗原的同步處理和免疫標(biāo)記染色的組織對(duì)照。正確的結(jié)果應(yīng)為陰性，目的是除外假陽(yáng)性。,陰性試劑對(duì)照 是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：空白對(duì)照；替代對(duì)照；吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)，等。目的在于除外假陽(yáng)性和證實(shí)所用免疫組化試劑及其技術(shù)

4、方法的有效性和待檢實(shí)驗(yàn)切片免疫標(biāo)記陽(yáng)性結(jié)果的可靠性。,空白對(duì)照 指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時(shí)還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對(duì)照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。,取代對(duì)照 指以所用方法第一抗體同源動(dòng)物的正常血清，或與本實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對(duì)照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。 吸收試驗(yàn) 是指用事先經(jīng)過(guò)量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對(duì)照。結(jié)果應(yīng)是陰性或陽(yáng)性著色明顯減弱（吸收不全時(shí)）。,抑制試驗(yàn) 是指用標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑，其他步驟不變的免

5、疫組化染色試劑對(duì)照，結(jié)果其陽(yáng)性著色應(yīng)成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對(duì)照多用于直接法。,這類陰性試劑對(duì)照的選用原則是：空白對(duì)照不能省，其他對(duì)照在預(yù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量多做，尤其是應(yīng)用新抗體試劑；對(duì)照必需與實(shí)驗(yàn)片同步進(jìn)行染色；對(duì)照的結(jié)果應(yīng)附合要求。,自身對(duì)照 是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對(duì)照。即與靶抗原陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的顯色，結(jié)果應(yīng)為陰性或著色較淺，需與陽(yáng)性著色成分呈鮮明對(duì)比。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽(yáng)性和因抗原彌散移位造成的錯(cuò)誤結(jié)果。,第三節(jié) 非特異染色,非特異染色是指免疫組化染色過(guò)程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽(yáng)性，又稱背景著色，能嚴(yán)重干擾免疫組化染

6、色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)竭力避免或減輕。其原因涉及免疫組化染色流程的各個(gè)環(huán)節(jié)，可來(lái)自：,內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng)，F(xiàn)c受體干擾等)；組織處理不當(dāng)(組織固定不及時(shí)或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導(dǎo)致的游離試劑殘留等)。,糾正的方法視原因而異，可在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用有針對(duì)性的糾正對(duì)策，即對(duì)癥下藥(具體糾正方法不展開講了，同學(xué)們可以自己閱讀講義p123-126) 。,第四節(jié) 陽(yáng)性標(biāo)記的形態(tài)特征和判斷,免疫組化標(biāo)記具有一定形態(tài)特點(diǎn)，若能熟練掌握則有助于對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的正確判斷。特點(diǎn)包括定性、定位和定量三方面。,免疫顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞密度是定

7、性定量指標(biāo)，實(shí)際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)合的方法綜合計(jì)量，與抗原含量有關(guān)；陽(yáng)性細(xì)胞的著色形態(tài)及組織分布特點(diǎn)主要是定位指標(biāo)，與功能有關(guān)。,一、陽(yáng)性標(biāo)記免疫特征：分弱(+)、中(+)、強(qiáng)(+)三級(jí)。免疫熒光法（FITC為例） 則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光；,免疫酶標(biāo)記（HRP- DAB/H2O2）則表現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。一般圖片照像，原則上多取強(qiáng)陽(yáng)性區(qū)域。,二、陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 可分為胞膜型；胞核型；胞質(zhì)(漿)型；微絨毛型和復(fù)合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有，或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽(yáng)性細(xì)胞類型。這

8、與抗原所在部位相關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復(fù)合型圖像。,三、陽(yáng)性標(biāo)記組織學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：局灶型；彌漫型；片塊型；網(wǎng)狀型；腺管型；腔緣型和菊?qǐng)F(tuán)型，等。這主要取決于抗原抗體復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽(yáng)性細(xì)胞在組織內(nèi)的群體分布特點(diǎn)。,四、陽(yáng)性標(biāo)記強(qiáng)度特征 依照細(xì)胞陽(yáng)性著色程度（抗原含量），可分為弱陽(yáng)性（+）1分；中等陽(yáng)性（+）2分；強(qiáng)陽(yáng)性（+）3分。依照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，可分為：弱陽(yáng)性（+ ，指陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)在25%以下）；,中等陽(yáng)性（+,指陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)在25%49%)；強(qiáng)陽(yáng)性（+ ，指陽(yáng)性細(xì)胞

9、總數(shù)在50%以上)。目前多采用積分綜合計(jì)量。計(jì)算公式為：（+）%x1 +（+）%x2+（+）%x3；總數(shù)值1.5者為(+)。至少隨機(jī)觀察5-10個(gè)HPF。,第五節(jié) 染色失敗的可能原因,免疫組化染色的基本要求有二：實(shí)驗(yàn)切片的陽(yáng)性抗原定位準(zhǔn)確，呈色鮮明，背景著色淺或無(wú)，二者的比值應(yīng)大于1（陽(yáng)性/背景）；對(duì)照染色的結(jié)果應(yīng)附合要求。否則，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是錯(cuò)誤的，或?yàn)榧訇?yáng)性或?yàn)榧訇幮浴?假陽(yáng)性是指實(shí)驗(yàn)切片呈陽(yáng)性，陰性組織對(duì)照或陰性試劑對(duì)照也呈陽(yáng)性的結(jié)果，謂之假陽(yáng)性。其原因與內(nèi)源性干擾，試劑不純，交叉反應(yīng)等有關(guān)。,假陰性是指實(shí)驗(yàn)切片呈陰性，陽(yáng)性組織對(duì)照及陰性試劑對(duì)照也均呈陰性的結(jié)果，謂之假陰性。其原因與組織處理不當(dāng)，組織細(xì)胞抗原丟失或試劑錯(cuò)誤(如漏加、錯(cuò)加、失效、變質(zhì)等),操作失誤等有關(guān)。,對(duì)照結(jié)果判斷：,染色失敗原因： 均為陰性 均為弱陽(yáng)性（除陰性對(duì)照） 背景染色過(guò)深 陽(yáng)性對(duì)照好，待檢標(biāo)本弱陽(yáng)性 陽(yáng)性對(duì)照無(wú)背景，待檢標(biāo)本背景深,判斷原則： 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 抗體選擇 抗原定位性 抗原分布不均一性,識(shí)別假陰