1、非水介質(zhì)的酶促反應(yīng),生物工程學(xué)院常雅寧,第四章 非水介質(zhì)中的酶反應(yīng),第一節(jié) 有機介質(zhì)中的酶促反應(yīng)概述 第二節(jié) 有機介質(zhì)中酶促反應(yīng)的條件 第三節(jié) 有機介質(zhì)對酶性質(zhì)的影響 第四節(jié) 有機介質(zhì)中酶促反應(yīng)應(yīng)用（生物能源） 第五節(jié) 超臨界流體中的酶促反應(yīng),有機相酶催化歷史,古代： Hill.A.C(1898)J.Chem.Soc,73,634-658 Kastlc,J.C.and LocvCnhart,A.a.(1900)Am Chem,J,24,491-525 Sym,E,A(1933)Biochem,Z,258,304-324 Sym,E,A(1936)Enzymologia 1,156-160,失敗

2、的原因？,有機相酶催化歷史,近代有機相酶催化研究再次起飛的里程碑 Zaks,A.and Kilbanov,A.M(1984),Science224,1249-1251 ZoKs,A. and Kilbanov,A.M.(1985),Proc.Natl,Acad,Sci.u.s.a.82,3192-3196,成功的 原因？,Klibanov 的實驗,非水介質(zhì)的組成,有機溶劑 超臨界流體 氣相介質(zhì) 低共熔混合體系：兩種或多種固體化合物混合而得到的具有一個最低共熔點的狀態(tài)。 熱點：介質(zhì)工程、溶劑工程 改變反應(yīng)介質(zhì)來改變酶催化反應(yīng)的選擇性，從而達(dá)到人為的改變和控制酶的立體專一性。,第一節(jié) 有機介質(zhì)中的

3、酶促反應(yīng)概述,一有機介質(zhì)酶反應(yīng)的應(yīng)用現(xiàn)狀 二. 有機介質(zhì)酶反應(yīng)的優(yōu)點 三. 有機介質(zhì)酶研究熱點 四. 有機介質(zhì)酶反應(yīng)具備條件,一 有機介質(zhì)酶反應(yīng)的應(yīng)用現(xiàn)狀,酶催化反應(yīng) 應(yīng)用 蛋白酶肽合成合成多肽 ?；穷愼；?羥基化酶氧化甾體轉(zhuǎn)化 過氧化物酶聚合 酚類、胺類化合物的聚合 膽固醇氧化酶氧化膽固醇測定 醇脫氫酶酯化有機硅醇的酯化,一 有機介質(zhì)中酶催化的應(yīng)用,酶 催化反應(yīng) 應(yīng)用 脂肪酶 肽合成 青霉素G前體肽合成 酯合成 醇與有機酸合成酯類 轉(zhuǎn)酯 各類酯類生產(chǎn) 聚合 二酯的選擇性聚合 ?；蚀嫉孽；?二 有機相酶反應(yīng)的優(yōu)點：,1 有利于疏水性底物的反應(yīng)，能催化在水中不能進行 的反應(yīng) 2 可提

4、高酶的熱穩(wěn)定性. 3 可改變反應(yīng)平衡移動方向 4. 可控制底物專一性 5. 酶和產(chǎn)物易于回收。 6. 可避免微生物污染。,三. 研究熱點,仿水溶劑和印跡技術(shù) （1） 仿水溶劑體系 （2） 分子印跡技術(shù),（1） 仿水溶劑體系,思路：水在酶催化反應(yīng)中的作用（具有高介電常數(shù)和形成氫鍵的能力） 結(jié)論：有機溶劑可以替代部分水,（1） 仿水溶劑體系,概念 可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等極性添加劑部分或全部替代系統(tǒng)中的輔助溶劑水，從而影響酶的活性和立體選擇性。稱為仿水溶劑體系。,極性添加劑對體系的影響,a. 對反應(yīng)體系內(nèi)水的分配影響 b. 與蛋白質(zhì)的直接作用 c. 對產(chǎn)物分配的影響 結(jié)論：作為

5、輔助溶劑應(yīng)該具有高介電常數(shù)和多點形成氫鍵的能力。,有機相生物印跡酶,枯草桿菌蛋白酶溶液含N-Ac-Tyr-NH2,凍干,除去抑制劑,枯草桿菌蛋白酶,枯草桿菌蛋白酶溶液不含N-Ac-Tyr-NH2,凍干,枯草桿菌蛋白酶,（1）,（2）,在辛烷中催化酯化反應(yīng)的速度比較：,反應(yīng)（1）中得到的酶比反應(yīng)（2）中得到的酶高100倍,在水溶液中其活性 ：,相同,有機相生物印跡酶,酶的水解活力與溶解酶的緩沖液pH值有很大關(guān)系,酶具有“記憶”pH值的能力,有機相生物印跡酶,概念： 酶在含有其配體的緩沖液中，肽鏈與配體之間的氫鍵等相互作用使酶的構(gòu)象改變，這種新構(gòu)象除去配體后在無水有機溶劑中仍可保持，并且酶通過氫鍵

6、能特異地結(jié)合該配體，這種方法叫生物印跡。 利用酶與配體的相互作用，誘導(dǎo)、改變酶的構(gòu)象，制備具有結(jié)合該配體及其類似物能力的新酶稱為生物印跡酶,有機相生物印跡酶,為什么在有機相中會產(chǎn)生印跡現(xiàn)象？,水,剛性,有機相生物印跡酶,水在酶催化反應(yīng)中的作用 水直接或間接參與了酶天然構(gòu)象中所有的非共價相互作用 水充當(dāng)了酶結(jié)構(gòu)的“潤滑劑”，使酶分子的柔性增強,有機相生物印跡酶,有機相中剛性增強原因？,四 有機相酶反應(yīng)具備條件,1 保證必需水含量。 2 選擇合適的酶及酶形式。 3 選擇合適的溶劑及反應(yīng)體系。 4 選擇合適pH值。,第二節(jié) 有機介質(zhì)中酶促反應(yīng)的條件,1 保證必需水含量 2 選擇合適的酶及酶形式 3

7、選擇合適的溶劑及反應(yīng)體系 4 選擇最佳pH值和離子強度,一 必需水,豬胰脂肪催化甘油三丁酸酯和正庚醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng),必需水,一 必需水,1 概念： 緊緊吸附在酶分子表面，維持酶催化活性所必需的最少量水稱為必需水,2 干燥的酶水合過程：,溶菌酶為例： （1） 結(jié)合水量在0-7%g/g（水/酶）， （2）結(jié)合水量在7-25%g/g（水/酶）， （3）結(jié)合水量在25-38%g/g（水/酶）， （4） 酶分子表面完全水化，被一層水分子覆蓋,2 酶活與水的關(guān)系：,酶活最大時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性（柔性）之間達(dá)到最佳平衡點。 “剛?cè)岵?3影響酶必需水含量的因素（酶和溶劑）,a不同酶需水量不同

8、 在辛烷中糜蛋白酶催化僅需吸附50個水分子，而脂肪酶僅需幾個水分子就可顯示出活性。,3影響酶必需水含量的因素,b.同一種酶在不同有機溶劑中最適反應(yīng)需水量不同 溶劑疏水性越強，需水量越少。,4表征必需水作用的參數(shù)-熱力學(xué)水活度,水活度（water activity)： 指特定的溫度和壓力條件下，反應(yīng)體系中水的摩爾分?jǐn)?shù) Xw與水活度系數(shù)w的乘積： w =w* Xw 水活度系數(shù)w是溶劑疏水性的函數(shù)，溶劑疏水性越大， w越大。 w 是一個強質(zhì)性質(zhì)的物理量，在平衡狀態(tài)時，反應(yīng)體系中各組分（酶、溶劑、底物和產(chǎn)物）的 w 是相同的。,研究水活度的意義：,1 最佳水活度與溶劑的極性幾乎無關(guān)，大約在0.55左右

9、 2 可以排除溶劑對最適含水量的影響 3 水活度可由反應(yīng)體系中水的蒸汽壓除以在相同條件下純水的蒸汽壓而測得。,獲得恒定水活度的方法：,1 用一個飽和鹽水溶液分別預(yù)平衡底物溶液和酶制劑。 2 向反應(yīng)體系中直接加一種水合鹽 3 向每一溶劑中加入不同量的水,水活度緩沖體系,二 酶的選擇,1 酶參加的反應(yīng)：合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)移反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)、異構(gòu)反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、裂合反應(yīng) 參加反應(yīng)酶的種類選擇除與反應(yīng)類型有關(guān)，還與酶-底物、產(chǎn)物-溶劑間關(guān)系有關(guān)。,常用酶的分類,（1） 氧化還原酶類： （2 ）水解酶類 （3 ）異構(gòu)酶,2酶形式的選擇,兩大類： 第一類是固態(tài)酶，冷凍干燥的酶粉和固定化酶，結(jié)晶酶 第

10、二類是可溶解酶，共價修飾酶和非共價修飾的高分子-酶復(fù)合物、表面活性劑復(fù)合物以微乳液中的酶,2酶形式的選擇,（1）酶粉：-酶蛋白分子骨架的構(gòu)象與水中無明顯變化 例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在水含量不變的前提下酶催化活性加入酶粉量有最佳值，不是越多越好。,2酶形式的選擇,（） 化學(xué)修飾酶：,2酶形式的選擇,（） 固定化酶： 把酶吸附在不溶性載體上（如硅膠、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其對抗有機介質(zhì)變性的能力、反應(yīng)速度、熱穩(wěn)定性等都可提高。,2酶形式的選擇,（） 固定化酶：,有機相中固定化后載體對酶的影響,A.載體能通過分配效應(yīng)劇烈地改變酶微環(huán)境中底物和產(chǎn)物的局部濃度。,

11、有機相中固定化后載體對酶的影響,B.載體影響酶分子上的結(jié)合水 通過選擇合適的載體可使體系中的水進行有利分配。,有機相中固定化后載體對酶的影響,C.通過載體與酶之間形成的多點結(jié)合作用，可穩(wěn)定酶的催化活性構(gòu)象。,有機相中固定化后載體對酶的影響,D.酶動力學(xué)影響一個酶同時催化的兩個反應(yīng)的相對速度。,3 溶劑和反應(yīng)體系的選擇,3 溶劑和反應(yīng)體系的選擇,酶促反應(yīng)有機介質(zhì)體系 （1） 單相共溶劑體系（水/水溶性有機熔劑） （） 兩相體系（水/水不溶性有機溶劑） （） 低水有機溶劑體系（有機溶劑體系） （） 反膠束體系,A.反膠束體系概念,A.反膠束體系概念,反膠束體系： 是表面活性劑分散于連續(xù)有機相中自發(fā)

12、形成的納米尺度的一種聚集體。反膠束溶液是透明的熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。,概念表面活性劑,表面活性劑：表面活性劑是由親水憎油的極性基團和親油憎水的非極性基團兩部分組成的兩性分子。 在有機相酶反應(yīng)中用得最多的是陰離子表面活性劑： AOT(AerosolOT)，其化學(xué)名為丁二酸-2-乙基酯磺酸鈉。,概念臨膠束濃度,臨膠束濃度：是膠束形成時所需表面活性劑的最低濃度，用CMC來表示。 CMC的數(shù)值可通過測定各種物理性質(zhì)的突變（如表面張力、滲透壓等）來確定。,微團形成示意圖,概念,正常微團：極性頭部向外，與水結(jié)合；疏水尾部向內(nèi)，形成一個非極性的核心。 反向微團：疏水尾部向外，與非極性的有機溶劑接觸；極性頭部向內(nèi)

13、，形成一個極性核。,B.反膠束體系的制備,將表面活性劑溶于非極性的有機溶劑中，并使其濃度超過臨界膠束濃度（CMC），便會在有機溶劑內(nèi)形成聚集體，這種聚集體則為反膠束。,反膠束體系的制備,影響因素,反膠束的尺寸和形狀隨表面活性劑-溶劑系統(tǒng)的變化而變化，同時也受溫度、壓力、離子強度的影響。 反膠束的大小取決于反膠束的含水量Wo。Wo的定義為反膠束中水分子數(shù)與表面活性劑分子數(shù)之比，也即有機溶劑中水的摩爾濃度與表面活性劑的摩爾濃度之比。,反膠束體系中的含水量,C基本原理：“水殼”模型,反膠束系統(tǒng)中的水通?？煞譃榻Y(jié)合水和自由水。 結(jié)合水是指位于反膠束內(nèi)部形成水池的那部分水 自由水即為存在于水相中的那部分

14、水,“水殼”模型,水殼模型很好地解釋了蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)的狀況，其間接證據(jù)較多。 1.從彈性光散射的研究證實在蛋白質(zhì)分子周圍至少存在一個單分子的水層。 2.-糜蛋白酶在反膠束中的熒光特性與在主體水中的特性很相象。 3.反膠束中酶顯示的動力學(xué)特性接近于在主體水中的特性。,構(gòu)建雙水相體系實現(xiàn)在線產(chǎn)物分離,Aquous Two Phase System-ATPS,雙水相體系將頭孢立新得率提高3倍,Biochemical Engineering Journal, 2002,11(2-3):95-100. J. Microbiology and Biotechnology, 2004 , 14(1):62

15、-67.,雙相體系與水相體系中產(chǎn)物純度的比較,雙相體系中，由于乙酸丁酯對產(chǎn)物苯乙酸的萃取，促進了酶反應(yīng)的平衡，使得L-型底物的轉(zhuǎn)化率為99.95，而這樣得到的D-叔亮氨酸的純度也提高到99.5。,2 有機溶劑影響酶催化的方式,(1） 有機溶劑能通過直接與酶相互作用引起抑制或失活,A 增大酶反應(yīng)的活化能來降低酶反應(yīng)速度 B 降低中心內(nèi)部極性并加強底物與酶之間形成的氫鍵，使酶活 性下降。 C 酶三級結(jié)構(gòu)變化，間接改變酶活性中心結(jié)構(gòu)影響失活。,2 有機溶劑影響酶催化的方式,（2） 有機溶劑與擴散的底物或產(chǎn)物相互作用而影響酶活,2 有機溶劑影響酶催化的方式,（3） 有機溶劑直接與酶附近的必需水相互作用

16、。,3選擇有機溶劑必須考慮因素,(1). 有機溶劑與反應(yīng)的匹配性（即相容性）（包括反應(yīng)產(chǎn)物與溶劑的匹配性，極性產(chǎn)物傾向于保留在酶附近，可能引起產(chǎn)物抑制或不必要的副反應(yīng)發(fā)生。),相容性,例：對于酶促糖改性而言，使用疏水性的，與水不互溶的溶劑是不現(xiàn)實的，因為不溶性底物和不溶性的酶之間無相互作用，必須用親水性的溶劑（如吡啶或二甲基甲酰胺）,(2). 溶劑必須對于該主反應(yīng)是惰性的制劑。,例：酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)涉及到醇對于酯的親核攻擊而產(chǎn)生另一種酯，如果溶劑也是酯，就會生成以溶劑為基礎(chǔ)的酯，如果溶劑是醇，也會得到類似結(jié)果。,(3)必須考慮的其他因素,溶劑的密度、黏度、表面張力、毒性、廢物處理和成本等（溶劑因底

17、物而宜） 溶劑參數(shù)lgP：即一種溶劑在辛醇/水兩相間分配系數(shù)的常用對數(shù)值，它能直接反映溶劑的疏水性。,生物催化劑的環(huán)境調(diào)控技術(shù),通過“環(huán)境調(diào)控”技術(shù)，實現(xiàn) 生物催化劑活性、選擇性的人為控制,生物催化劑環(huán)境的改變：會導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變進而酶的活性、選擇性改變,四PH選擇和離子強度的影響,（1） pH選擇： 酶在水相的pH值可在有機相中保持. 同一種酶不同來源，對pH值敏感程度大不相同。,氧化葡萄糖桿菌催化制備二羥基丙酮(DHA),二羥基丙酮(DHA) 廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng)，是一個重要的化學(xué)合成中間體。工業(yè)上利用二羥基丙酮做為中間體的代表性的示例（資料來源 Merck KGaA

18、,Darmstadt,Germany)。,環(huán)境pH的改變導(dǎo)致酶的選擇性的改變,Tetrahedron: Asymmetry, 2004, 15(8):1275-1277.,氧化葡萄糖桿菌催化D乳酸轉(zhuǎn)化,（2）離子強度影響,隨著凍干時用的緩沖溶液的離子強度增大，酶活會增大。,山梨醇改變水活度改變底物的離子化程度,頭孢氨芐合成中助溶劑的影響,第二節(jié)結(jié)束,必需水 酶的選擇 溶劑及反應(yīng)體系 pH選擇和離子強度,反膠束體系,酶種類的選擇 酶形式的選擇,概念,正常微團 反向微團 “水殼”模型,第二節(jié)結(jié)束,點擊返回,第三節(jié) 有機介質(zhì)對酶性質(zhì)的影響,一、穩(wěn)定性 二、活性 三、專一性 四、反應(yīng)平衡方向,一、穩(wěn)定

19、性,（）熱穩(wěn)定性提高 （）儲存穩(wěn)定性提高,一、穩(wěn)定性,例：丹麥Nove公司生產(chǎn)的脂肪酶Lipozyme TM，在水溶液中60保溫1小時后剩余的酶活只有10%，而在橄欖油中同樣條件下脂肪酶的剩余酶活仍近100%。 60對烏桕脂和硬脂酸甲酯的轉(zhuǎn)化反應(yīng)24小時后，酶仍保持82%。,一、穩(wěn)定性,結(jié)論,在低水有機溶劑體系中，酶的穩(wěn)定性與含水量密切相關(guān)；一般在低于臨界含水量范圍內(nèi)，酶很穩(wěn)定；含水量超出臨界含水量后酶穩(wěn)定性隨含水量的增加而急劇下降。,二 活性,剛-柔并存 剛性：生物大分子結(jié)構(gòu)的精確性 柔性：生物大分子局部區(qū)域具有一定的可運動性。,苯乙酸復(fù)合物模型中活性位點示意圖,圖 1.5 苯乙酸復(fù)合物模型

20、中活性位點示意圖 Scheme 1.5 Environment of the active site in the phenylacetic acid complex. （Jing, H. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2000, (11):45-53.） The phenylacetic acid ligand is shown as a ball and stick representation, with the important residues in the binding site highlighted as liquorice. The mesh repr

21、esents a solvent-accessibility surface for the protein calculated using a 1-radius probe.,PGSO結(jié)合活性位點的電子云密度圖,圖 1.6 PGSO結(jié)合活性位點的電子云密度圖 Scheme 1.6 Stereoview of the electron density map of PGSO bound in the active site of WT-PGSO. （Ren, L.G. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2002, (18):3-11）,酶活性喪失的可能原因：,二、活性,1、單

22、相共溶劑體系中，有機溶劑對酶活性影響 （1） 有機溶劑直接作用于酶，破壞維持酶活性構(gòu)象的氫鍵和疏水作用力，或破壞酶周圍水化層，使酶失活或變性。 （2） 有些酶的活性會隨著某些有機溶劑濃度升高而增大，在某一濃度（最適濃度）達(dá)到最大值；若濃度再升高，則活性下降。,二、活性,2、低水有機溶劑體系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦變化,二、活性,3、在反向微團體系中，微團效應(yīng)使某些酶活性增加 特點： 酶活力依賴微團的水化程度，即取決于水與表面活性劑的摩爾比（R） 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性稱為超活性（Super-activity）。 認(rèn)為：超活性是由圍繞在酶分子外面的表面活性

23、劑這一外殼之較大剛性所引起。,超活性產(chǎn)生機理,根據(jù) ：,（1）微團水化程度（W）（W=H2O/表面活性劑）的最佳值和酶活性的最大值呈正相關(guān) （）W值最佳時，微團內(nèi)徑總是相當(dāng)于被包裹的酶分子直徑。,三、專一性,某一些有機介質(zhì)可能使某些酶的專一性發(fā)生變化，這是酶活性中心構(gòu)象剛性增強的結(jié)果。,三、專一性,例：醇脫氫酶催化烷醇氧化為醛，在水溶液中辛烷是最佳底物，再反向微團包裹后則丁醇更快被氧化。,三、專一性,有些在水中不能實現(xiàn)的反應(yīng)途徑，在有機介質(zhì)中卻成為主導(dǎo)反應(yīng)。,四、反應(yīng)平衡方向,四、反應(yīng)平衡方向,有機介質(zhì)能改變某些酶的反應(yīng)平衡方向。 例：水解酶，水濃度高達(dá)55.5mol/L，水解酶在有機介質(zhì)中，

24、熱力學(xué)平衡催化合成反應(yīng)。,第四節(jié) 超臨界流體中的酶反應(yīng),超臨界流體的概念: 指溫度和壓力均在本身的臨界點以上的高密度流體，具有和液體同樣的凝聚力、溶解力。然而其擴散系數(shù)又接近于氣體，是通常液體的近百倍，因此超臨界流體萃取具有很高的萃取速度。,超臨界流體的有關(guān)性質(zhì),（1）超臨界流體的P-V-T性質(zhì),超臨界流體的有關(guān)性質(zhì),（2）所謂超臨界CO2是指純凈的CO2被加熱或壓縮到高于其臨界點。其密度和液體相近，粘度和氣體相近，自擴散系數(shù)比液體大100倍左右。完成傳質(zhì)達(dá)到平衡快，分離效果好。,超臨界流體的有關(guān)性質(zhì),（3）提高溶劑選擇性的基本原則是： 第一：操作溫度和超臨界流體的臨界溫度接近； 第二：超臨界

25、流體的化學(xué)選擇和待分離溶質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)接近。,有機介質(zhì)中酶催化的應(yīng)用,手性藥物的拆分 手性高分子聚合物的制備 酚樹脂的合成 導(dǎo)電有機聚合物的合成 發(fā)光有機聚合物的合成,有機介質(zhì)中酶催化的應(yīng)用,食品添加劑的生產(chǎn) 多肽的合成 甾體轉(zhuǎn)化 生物能源,一手性藥物的拆分,概念： 手性化合物：是指化學(xué)組成相同，而其立體結(jié)構(gòu)互為對映體的兩種異構(gòu)體化合物,1 手性藥物兩種對映體的藥效差異,一種有顯著療效，另一種有療效弱或無效 一種有顯著療效，另一種有毒副作用 兩種對映體的藥效相反 兩種對映體具有各自不同的藥效 兩種消旋體的作用具有互補性,2 手性藥物的拆分方法,分為：非生物法、生物法 非生物法（機械分離法、 形成

26、和分離對映體異構(gòu)法、 色譜分離法、 動力學(xué)拆分）,生物拆分法原理,實質(zhì)即兩個對映體競爭酶的同一個活性中心位置，兩者的反應(yīng)速率不同，產(chǎn)生選擇性，從而使反應(yīng)產(chǎn)物具有光學(xué)活性。,生物拆分法,快：E+AE+P 慢：E+BE+Q 對映體選擇率：底物中一對異構(gòu)體（同一個酶的兩種競爭性底物）的Vm/Km之比為酶的選擇性。,生物拆分法,E:反映某一拆分過程的效果，也表征酶選擇性的大小，是酶反應(yīng)的特征參數(shù)。 光學(xué)純度op.(%)=a/a純品,對映體過量值，殘余底物: 生成底物: 一般認(rèn)為比旋光度與組成之間成直線關(guān)系，因此在實驗無誤差時，o.p與ee所表示的數(shù)值應(yīng)是相同的。,生物拆分法,青霉素?；讣捌浯呋饔?

27、利用其底物專一性及對映體的選擇性進行光學(xué)異構(gòu)體的合成與拆分。,TW Wang, DZ Wei* et al., Structure-Based Stabilization of an Enzyme: The Case of PenicillinAcylase from Alcaligenes faecalis, Protein & Peptide Letters, 2006 (In press).,Shu-Lai Liu，Dongzhi Wei*, et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006(In press). Shu-Lai Liu，Dongzhi Wei*, et al.