1、專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),.微生物的類群,微生物,原核類:,真核類,非細(xì)胞類：,細(xì)菌、支原體、衣原體、放線菌、藍(lán)藻,個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,顯微藻類、原生生物（如：草履蟲、變形蟲等）,病毒、類病毒、朊病毒,微生物的共同特點(diǎn)：,一.微生物基礎(chǔ)知識,1.細(xì)菌的形態(tài),擬核，大型環(huán)狀DNA,質(zhì)粒(小型環(huán)狀DNA，含抗生素，抗藥性，固氮基因),其成分為肽聚糖,2.細(xì)菌的結(jié)構(gòu),芽孢,有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。（抗逆性極強(qiáng)） 注：不是繁殖體,

2、例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.,細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行增殖（如右圖）,3.細(xì)菌的繁殖,4.細(xì)菌的菌落,.定義：,單個(gè)或者少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，會形成一個(gè)肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。,.特征：,大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。,.功能：,每種細(xì)菌在一定條件下所形成的菌落，可以作為菌種鑒定的重要依據(jù)。,幾種菌落及其形態(tài),幾種菌落及其形態(tài),5.病毒的結(jié)構(gòu),:由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。,病毒的結(jié)構(gòu),吸附,注入,合成,釋放,組裝,6.病毒的繁殖,病毒

3、的增殖一般可分五個(gè)階段，即： 吸附注入核酸合成核酸和蛋白質(zhì)組裝釋放,6.病毒的營養(yǎng)方式,：寄生,微生物需要的五大類營養(yǎng)要素物質(zhì)是：,.微生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)及功能,1.碳源 2.氮源 3.生長因子 4.無機(jī)鹽 5.水,1.碳源：,為微生物提供碳元素。,2.氮源:,N2,NH3等,有機(jī)物中的氮（還有尿素）,無機(jī)氮,牛肉膏、蛋白胨,為微生物提供氮元素。,氨鹽、硝酸鹽等是常用的氮源 氮源主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物,自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是( ) A碳源 B氮源 C無機(jī)鹽 D特殊營養(yǎng)物質(zhì),A,3.生長因子,.常見的生長因子：,.概念：,.作用：,微生物生長不可缺少的

4、微量有機(jī)物。,酶和核酸的組成成分。,維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。 一些天然物質(zhì)如酵母膏、蛋白胨、動(dòng)植物組織提取液等可為微生物提供生長因子,（4）來源：,注意：,最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖 最常用的氮源是銨鹽、硝酸鹽 對異養(yǎng)生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，有時(shí)氮源，如蛋白質(zhì) 之所以補(bǔ)充生長因子，是由于缺少合成這些物質(zhì)的酶或合成能力有限,思考：,C,（三）培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。,1.培養(yǎng)基的類型及用途,按物理性質(zhì)分,是,是,否,分離、計(jì)數(shù)等,觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、 鑒定菌種等,工業(yè)生產(chǎn),固體培養(yǎng)基：菌落,半固體培養(yǎng)基：,

5、無動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散),液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,按化學(xué)成分分,否,是,主要用于 工業(yè)生產(chǎn),分類、鑒定,按培養(yǎng)基的功能（用途）分,加入某種 化學(xué)物質(zhì),加入某種 試劑或化 學(xué)藥品,依據(jù)某些微 生物對某些 物質(zhì)的抗性,依據(jù)微生物的 代謝產(chǎn)物與特 定試劑或化學(xué) 藥品反應(yīng)，產(chǎn) 生明顯的特征 變化,從眾多微生 物中分離所 需的微生物,鑒別不同種 類的微生物,加入青霉素 分離得到酵 母菌和霉菌,伊紅和美藍(lán) 培養(yǎng)基可鑒 別大腸桿菌,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 不加氮源的無氮培養(yǎng)基 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基,分離酵母菌、霉菌等真菌,分離金黃色葡萄球菌,分離固

6、氮菌,分離自養(yǎng)型微生物,（三）培養(yǎng)基,（1）按物理狀態(tài)分： （2）按功能分： （3）按成分分：,總結(jié)：1.培養(yǎng)基的類型,2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方,不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、無機(jī)鹽、碳源和氮源等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求,3.培養(yǎng)基的成分,血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子； 激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,（四）無菌技術(shù),1.無菌技術(shù)的概念,無菌操作

7、泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,3.常用的消毒與滅菌的方法,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。 巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min。 化學(xué)藥劑消毒法：用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒；氯氣消毒水源。 紫外線消毒。,消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,（1）日常生活經(jīng)常用到的是 煮沸 消毒法 ； （2）對一些不耐高溫的液體，則使用 巴氏 消毒法（例如牛奶） ； （3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用 紫外線 進(jìn)行物理消毒。 （4）

8、實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用 酒精 進(jìn)行消毒； （5）飲水水源用 氯氣 進(jìn)行消毒。,消毒的方法,1、灼燒滅菌,滅菌的方法：,接種環(huán)、接種針、試管口等的滅菌,2、干熱滅菌： 160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.,如玻璃器皿、金屬用具等的滅菌,如培養(yǎng)基、無菌水等的滅菌,高壓蒸氣滅菌的原理是（ ） A高壓使細(xì)菌DNA變性 B高壓使細(xì)菌蛋白質(zhì)凝固變性 C高溫燙死細(xì)菌 D高溫使細(xì)菌DNA變性,B,滅菌的方法： 1、灼燒滅菌 2、干熱滅菌 3、高壓蒸氣滅菌 4、紫外線滅菌 如表面滅菌和空氣滅菌等，所 用器械是 紫外燈 。,關(guān)于滅菌和消毒的不正確的理解是

9、 A消毒和滅菌實(shí)質(zhì)上是相同的 B滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物 的細(xì)胞、芽孢和孢子 C接種環(huán)用燒灼的方法滅菌 D常用滅菌方法有加熱法、過濾法、紅外線法、化學(xué)藥品法,A,1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,二、微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)

10、基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,涂布器,接種環(huán),接種針,a.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）,配方：,1計(jì)算、稱量 2溶化 3調(diào)pH：pH76 4過濾：這一步可以省去。 5分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。 6加塞 7包扎,操作步驟,8滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。將培養(yǎng)基用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 9倒平板:

11、 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 10無菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。,倒平板操作,1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 玻棒、試管、燒瓶和吸管 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)

12、，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,問題討論,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)

13、微生物。,b.純化大腸桿菌,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,微生物的接種技術(shù)：,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,平板劃線的操作,1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次. 2.劃線首尾不能相接 3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng),劃線分離法注意事項(xiàng):,其他畫線分離圖：,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種

14、環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨

15、著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。,稀釋涂布平板的操作方法,答：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈拇x產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈黑色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。,例如

16、：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基,大腸桿菌呈黑色中心 ,有或無金屬光澤,菌種的保存,1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法,結(jié)果分析與評價(jià),.培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 .接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 .是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的

17、大小會有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。,本課題知識小結(jié):,【典例解析】,例:關(guān)于微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是( ) A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.無機(jī)氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)

18、型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,D,例2：下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是( ) A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯(cuò)誤的，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種