1、PPT,限制性核酸內(nèi)切酶切割原理、方法、結(jié)果分析及應(yīng)用,1,學(xué)習(xí)交流PPT,課堂內(nèi)容回顧：,1、定義： 1、定義：限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。,2、分類： （根據(jù)酶的基因、蛋白質(zhì)結(jié)果、依賴的輔助因子及DNA裂解的特異性，將限制性內(nèi)切酶分為三種類型）,型酶：具有DNA修飾的作用在非特異位點(diǎn)處切割DNA。型酶：是最重要的工具酶能在DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別和切割DNA雙鏈，所 以通常所說的限制性內(nèi)切酶就指這一類酶。型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè),2,學(xué)習(xí)交流PPT,型酶：具有D

2、NA修飾的作用在非特異位點(diǎn)處切割DNA。型酶：是最重要的工具酶能在DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別和切割DNA雙鏈，所 以通常所說的限制性內(nèi)切酶就指這一類酶。型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)。,3、命名： 規(guī)則： 第一個(gè)字母（大寫）：取自該酶的細(xì)胞屬名 第二、三個(gè)字母（小寫）：該細(xì)胞的種名 第四個(gè)字母（羅馬數(shù)字）：代表同一菌株中 不同限制性內(nèi)切酶的編號(hào) 例如：EcoR、Hind 等等,3,學(xué)習(xí)交流PPT,限制性核酸內(nèi)切酶切割原理,1、類和類酶： 在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在

3、識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。 2、類由兩種酶組成： 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列，產(chǎn)生5或3黏性末端（也有一些產(chǎn)生平端或鈍端）,4,學(xué)習(xí)交流PPT,幾種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn),例如：,3、同工異源酶：來源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。如：BamH和Bst，Xho和Pae R7等可以相互代替使用。 4、同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。如：BamH和

4、Sau3A等由此產(chǎn)生的DNA片段可借黏性末端相互連接，操作是具有更大的靈活性。,5,學(xué)習(xí)交流PPT,通過 使 用 (15 種 )限 制 性 內(nèi) 切 酶 酶 切 重 組質(zhì)粒，說明限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析的方法o,6,學(xué)習(xí)交流PPT,方法：,1.質(zhì)粒的構(gòu)建 采用聚合酶鏈反應(yīng)chainreaction，PCR)方法擴(kuò)增出 MLCKcDNA 片段，插入質(zhì)粒 pBKrsv中，構(gòu)建成 pBKrsv-MLCK 重組質(zhì)粒 2.酶切、構(gòu)建、片段的純化和連接 按Maniatis等方法進(jìn)行。 3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化采用“熱休克”法。 4.重組質(zhì)粒的提取 挑取陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿

5、裂解法提取重組質(zhì)粒。 5.定量 取5LDNA溶液用4.5l去離子水稀釋，用紫外分光光度計(jì)比色，讀取AZ60和AZ80吸光度值，計(jì)算出AZ60/AZ80比值，按下列公式計(jì)算質(zhì)粒DNA濃度,本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA濃度為1.0g/L。 質(zhì)粒 DNA 濃度(g/L)=AZ60X稀釋度/Z0=AZ60X5,7,學(xué)習(xí)交流PPT,6.重組質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶酶切 取0.5ml離心管15只，分別加入質(zhì)粒 2l(2g)，依 次 加 入 限 制性內(nèi) 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hin

6、d皿、EcoR I各0.5微升及相 應(yīng)的 NEBuffer2L、BSAL、去離子水 13.5L、 混勻、點(diǎn)動(dòng)離心，37 水浴孵育2小時(shí)。 7、配置1.5的瓊脂糖凝膠 稱取瓊脂糖0.6g,加入 1XTAE 緩 沖 液 40 ml置 微 波 爐 中,中 火120s，熔化后冷卻至60，加入3L10g/l溴化乙錠，混勻，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入電泳槽中。電泳槽中加入1TAE緩沖液。 8、電泳 取酶切產(chǎn)物8l與DNA上樣緩沖液2l混勻，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可觀察到橘紅色DNA條帶，結(jié)果如圖,8,學(xué)習(xí)交流PPT,Lorem ipsum dolor sit amet, consectetu

7、r adipisicing elit.,9,學(xué)習(xí)交流PPT,結(jié)果 重組質(zhì)粒pBKrsv-MLCK 全長(zhǎng)7378bp，通過 DNAstar軟件分析獲得各酶酶切位點(diǎn)的信息，選擇在插入片段中單獨(dú)存在和在插入片段與質(zhì)粒序列中均含有的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，計(jì)算酶切后片段大小的理論值經(jīng)各種限制性內(nèi)切酶酶切后，獲得不同大小的片段，經(jīng)電泳分析與理論設(shè)計(jì)完全一致。,10,學(xué)習(xí)交流PPT,結(jié)果分析 限制性內(nèi)切酶酶譜分析往往用于對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行初分析所獲得的信息將有助于確定構(gòu)建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在選擇限制性內(nèi)切酶時(shí),應(yīng)選擇在插入片段中單獨(dú)存在和在插入片段與質(zhì)粒序列中均含有的限

8、制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),這樣可保證酶切片段大小能滿足進(jìn)一步分析的需要。 在進(jìn)行限制性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)時(shí)首先應(yīng)進(jìn)行 DNA的定量，1U 酶的限制性內(nèi)切酶活性指在一定時(shí)間內(nèi)(60min)適當(dāng)溫度下和建議使用的緩沖液中,在50l反應(yīng)體系中,將1g底物 DNA 完全消化所需要的酶量l單位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物時(shí),應(yīng)根據(jù)情況確定所用酶量l根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn),1g底物 DNA 加入 5 U 的限制性內(nèi)切酶在2h時(shí)間內(nèi)可以酶切完全，通常延長(zhǎng)消化。,11,學(xué)習(xí)交流PPT,實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題及其討論,12,學(xué)習(xí)交流PPT,解決方法 1.標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性 2.將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA 3.檢查

9、反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳 4.換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同類酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-,dam-基因型的細(xì)菌菌株 5.換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同類酶消化DNA，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+,dam+菌株中擴(kuò)增 6.將DNA底物與DNA混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證 7.換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證,一.如果DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割？,1.內(nèi)切酶失活 2.DNA不純，含有SDS，酚，EDAT等內(nèi)切酶抑制因子 3.條件不適（試劑、溫度） 4.DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化 5.DNA酶切位點(diǎn)沒有甲基化(如Dpn1) 6.DNA位點(diǎn)上存在其它修飾 7.DNA不存在該酶識(shí)別順序,13,學(xué)習(xí)交流PPT

10、,解決方法,二.如果DNA切割不完全？,1.內(nèi)切酶活性下降 2.內(nèi)切酶稀釋方法不正確 3.DNA不純，反應(yīng)條件不佳 4.內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn) 7.酶切后DNA粘性末端退火 8.由于反應(yīng)溶液、溫度使內(nèi)切酶變性 9.過度稀釋使酶活性降低 10.反應(yīng)條件不適 11.識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序,1.用5-10倍量過量消化 2.用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 3.同上 4.同上 5.反應(yīng)前離心數(shù)秒 6.將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 7.電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 8.使用標(biāo)

11、準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度 9.適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏 10.使用最佳反應(yīng)體系 11.加大酶量5-10倍,14,學(xué)習(xí)交流PPT,1.用DNA作底物檢查酶切結(jié)果 2.電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段,三.如果DNA片段數(shù)目多于理論值？,1.其它內(nèi)切酶污染 2.底物中含其它DNA雜質(zhì),解決方法,15,學(xué)習(xí)交流PPT,限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用,16,學(xué)習(xí)交流PPT,用于DNA基因組物理圖譜的組建,基因的定位和基因分離,DNA分子堿基序列分析,比較相關(guān)的DNA分子和遺傳工程,17,學(xué)習(xí)交流PPT,將水稻葉綠體的DNA，用EcoR1限制性核酸內(nèi)切酶消化后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中做電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.8-2.5kb之間的DNA片段，再與同樣經(jīng)過EcoR1限制性核制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶做了脫磷酸化處理的pBR322質(zhì)粒連接，然后將混合物轉(zhuǎn)移到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由EcoR 限制性核酸內(nèi)切酶切割的水稻DNA基因組庫。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標(biāo)記的psbA DNA探針做菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質(zhì)粒DNA，經(jīng)進(jìn)一步的分析，就能測(cè)出水稻葉綠體基因psbA的序列。,應(yīng)用一,18,學(xué)習(xí)交流PPT