1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗證,China Pharmaceutical University ,中國藥科大學(xué)藥物分析教研室,第四章 藥物定量分析與分析方法驗證,定量分析樣品前處理方法 定量分析方法特點 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證,1,2,3,一、定量分析樣品前處理方法,Pretreatment of sample used in quantitative analysis,定量分析樣品前處理方法,概 述,泛影酸,碘番酸,碘苯酯,概 述,概 述,磺溴酞鈉,三氯叔丁醇,酒石酸銻鉀,富馬酸亞鐵,概 述,概 述,含金屬有機藥物,卡巴胂 金屬有機藥物,定量分析樣品前處理方法,直接測定法含金屬或C-M

2、不牢固的有機金屬 經(jīng)水解后測定法鹵素聯(lián)脂肪碳鏈（溶于適當溶劑再水解） 直接回流后測定 堿化回流后測定 硫酸水解后測定 經(jīng)氧化還原后測定法鹵素聯(lián)芳環(huán)牢固（一般用于測碘） 堿性還原后測定法如泛影酸 酸性還原后測定法如碘番酸 利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量,不經(jīng)有機破壞的分析方法:,經(jīng)有機破壞的分析方法,濕法破壞 HNO3-HClO4 HNO3-H2SO4 H2SO4-MSO4 金屬以高價態(tài)存在 干法破壞：無水碳酸鈉或氧化鎂，注意溫度 氧瓶燃燒法,空心,A.燃燒瓶 B.鉑絲網(wǎng) C.D.盛固體樣品濾紙及其折疊法 E.F.G.稱取液體樣品方法,A,G,F,E,D,C,B,氧瓶燃燒裝置及稱樣方

3、法,氧瓶燃燒法,樣品 吸收液 測定方法 含氟有機藥物 H2O pH4.3 HAc-NaAc Buffer 茜素氟藍 分光光度法 含氯有機藥物 NaOH溶液 銀量法 汞量法 分光法 含溴有機藥物 H2O2-NaOH液 或NaOH液- 銀量法 分光法 硫酸肼飽和液 含碘有機藥物 NaOH液- 銀量法 碘量法 硫酸肼飽和液 汞量法 分光法,碘苯酯含量測定,取本品約20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法進行有機破壞，用NaOH T.S. 2ml與H2O 10ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10 ml，密塞，振搖放置數(shù)分鐘，加甲酸約1ml，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約35min，以除去剩余的溴蒸氣，加

4、KI 2g，密塞，搖勻，用Na2S2O3液 (0.02mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1ml的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L)相當于1.388mg的C19H29IO2,二、藥品質(zhì)量標準分析方法驗證,指導(dǎo)原則 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證 藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則 藥物穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則 緩釋、控釋制劑指導(dǎo)原則 微囊、微球與脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則 細菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則,第三節(jié) 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證,目的： 證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求 效能指標： 評價分析方法的尺度 效能指標包括: 精密度,

5、準確度, 檢測限,定量限,選擇性, 線性與范圍, 耐用性,(1)準確度（accuracy）： 測量值與真實值接近的程度 表 示: 回收率 測定方法：回收試驗 加樣回收試驗,(2)精密度（precision ）：,定 義: 同一樣品多次測量值之間相互接近的程度 表 示：標準偏差(s), 相對標準偏差(RSD) 重復(fù)性: 同一實驗室,同一人多次測定的精密度 中間精密度: 同一實驗室，不同人，不同儀器測定的精密度 重現(xiàn)性: 不同實驗室，不同人測定的精密度,(3)專屬性（specificity）:,指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性)。,(4) 檢測限

6、（limit of detection， LOD）： 藥物能被檢出的最低濃度(g/ml) 測 定: 信噪比法(S:N=3:1) (5) 定量限（1imit of quantitation，LOQ）： 藥物能被定量測出的最低濃度(g/ml) 測 定: 信噪比法(S:N=10:1),第三節(jié) 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證 -性能指標,(6) 線性與范圍（linearity and range）： 待測物濃度與響應(yīng)值成線性關(guān)系的濃度范圍 線性關(guān)系：Y=a+bx （r=0.9999) 線性程度：相關(guān)系數(shù) (7) 耐用性（robustness）: 測定條件稍有變動時，對測定結(jié)果的影響程度 影響因素：被測溶液的

7、穩(wěn)定性，流動相的組成和pH，商品柱的品牌，柱溫等,第三節(jié) 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證 -性能指標,檢驗項目和驗證內(nèi)容：, 已有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度 如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補充 視具體情況予以驗證,第四節(jié) 生物樣品分析的基本步驟,1. 藥物從蛋白結(jié)合或綴合物中釋出 蛋白變性：如應(yīng)用三氯醋酸、HClO4、有機溶劑(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀 鹽酸水解 酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一種細菌性蛋白分解酶，可在pH 7.011.0使肽鍵降解),定量分析方法的驗證 -生物樣品分析,（一）特異性 內(nèi)源性物質(zhì)不得干擾原藥、代謝物 （二）標準曲線 r0.9900，至少5

8、個濃度，不許外延 （三）精密度和準確度 RSD15、20 相對回收率85115（80120）,（四）最低定量限LOQ 35倍t1/2，或1/101/20倍Cmax （五）樣品穩(wěn)定性 室溫、凍融、冰凍長期 （六）提取回收率（絕對回收率） 一般低于100，須穩(wěn)定 （七）質(zhì)控樣品 已知濃度樣品均勻放入待測生物樣品序列中，以確保定量測定的準確度,定量分析方法的驗證 -生物樣品分析,樣品 固相凈化 及 反相高效液相色譜法測定血漿中茶堿,伍朝筼等 藥學(xué)學(xué)報,1989,24(10):769773,血漿樣品 凈化后空白血漿 凈化前空白血漿,Column Zorbax C18 5m 2.5cm4.6mm 254nm Precolumn YWG-ODS 9-11m 54.6mm Mobile Phase:甲醇-醋酸鈉(0.05mol/L pH3.0)5050,50 100 150 200