1、.,1,MSI診斷檢測(cè)的方法和應(yīng)用,.,2,主 要 內(nèi) 容,微衛(wèi)星不穩(wěn)定的相關(guān)背景,MSI的檢測(cè)意義,MSI檢測(cè)方法,MSI檢測(cè)試劑盒,.,3,背 景 介 紹,微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長(zhǎng)度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。 主要機(jī)制： DNA多聚酶的滑動(dòng)導(dǎo)致重復(fù)序列中1個(gè)或多個(gè)堿基的錯(cuò)配 MS同源重組導(dǎo)致堿基對(duì)的丟失和插入,.,4,1993年，Altonen等首次發(fā)現(xiàn)，在HNPCC細(xì)胞中存在高頻率的MSI。目前已發(fā)現(xiàn)MSI的腫瘤主要有3類(lèi)： 一類(lèi)為HNPCC

2、病人發(fā)生的結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌,這一類(lèi)腫瘤幾乎都表現(xiàn)為MSI； 另一類(lèi)為散發(fā)性結(jié)直腸癌,這一類(lèi)腫瘤發(fā)生MSI概率約15 30； 第三類(lèi)為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內(nèi)的其它腫瘤,這一類(lèi)腫瘤MSI發(fā)生頻率相對(duì)較低。,背 景 介 紹,.,5,結(jié)直腸癌是是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，我們每年有13萬(wàn)-16萬(wàn)人罹患結(jié)直腸癌，其發(fā)病率占腫瘤發(fā)病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌。 HNPCC是常見(jiàn)的遺傳性腫瘤綜合癥，遺傳性結(jié)直腸癌是一個(gè)常染色體遺傳疾病,目前研究表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可能是遺傳性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制。,背 景 介 紹,.,6,具有MSI的散發(fā)性結(jié)直腸癌,具有不同的臨床病理、分子生物學(xué)特征,表現(xiàn)

3、為:發(fā)病年齡較??；對(duì)某些化療藥物(如5-FU、順鉑等)有原發(fā)性耐藥; 生物學(xué)行為較好。 MSI-H是期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個(gè)標(biāo)志物，也是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。,背 景 介 紹,.,7,微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)的意義,1. 檢測(cè)MSI可以用于檢測(cè)是否為L(zhǎng)ynch綜合征 結(jié)直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性綜合征，例如Lynch綜合征（又稱(chēng)之為遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌，HNPCC）和家族性息肉?。‵AP）。在HNPCC 和散發(fā)性直腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是遍布整個(gè)基因組的現(xiàn)象，并且可能是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的普遍機(jī)制。,.,8,專(zhuān)家組推薦， MMR蛋白檢測(cè)應(yīng)強(qiáng)烈建議在所有50歲以

4、下的結(jié)腸癌患者中開(kāi)展，原因在于該群體中患Lynch綜合征的可能性增加。而且，在一些中心，現(xiàn)在對(duì)所有的結(jié)直腸腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)（有時(shí)分析MSI）以來(lái)決定哪些患者需要進(jìn)行Lynch綜合征相關(guān)的基因檢測(cè).,微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)的意義,.,9,2. 檢測(cè)MSI可以用于判斷患者預(yù)后 高危期患者，定義為預(yù)后較差者，包括：T4（B、C期）、組織學(xué)分化差（3/4級(jí)，不包括MSI-H者），已經(jīng)有大量證據(jù)表明MMR蛋白表達(dá)缺失或MSI-H是期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個(gè)標(biāo)志物。具有MSI-H腫瘤的期結(jié)腸癌患者，3/4級(jí)分化（低分化）不再認(rèn)為是高危因素。,微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)的意義,.,10,3. 檢測(cè)MSI以判斷是否需要輔

5、助化療 對(duì)于期結(jié)腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決策時(shí)需要考量的一個(gè)重要信息就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）。 研究認(rèn)為MMR 基因?yàn)镸SI-H（高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定）會(huì)對(duì)順鉑、卡培他濱及5-FU 產(chǎn)生耐藥性，相反MSI-L、MSS 的患者不會(huì)產(chǎn)生耐藥。,微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)的意義,.,11,一項(xiàng)研究長(zhǎng)期隨訪了/期結(jié)腸癌患者后發(fā)現(xiàn)，MSI-L或MSS者通過(guò)5-FU輔助化療確實(shí)改善了預(yù)后；然而，MSI-H者卻不能從術(shù)后5-FU輔助化療中顯著獲益，與單純手術(shù)相比，5-年生存率反而更低。,微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)的意義,.,12,MSI 檢 測(cè) 方 法,1. 免疫組化方法(IHC) 免疫組化方法僅用于與腫瘤細(xì)胞中的MLH

6、1, MSH2, MSH6和PMS2蛋白結(jié)合。如果沒(méi)有結(jié)合任何的蛋白，就證明發(fā)生了MSI。 2. 直接測(cè)序法 對(duì)MMR基因各區(qū)域（MLH1、MSH2、MSH6等）的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序。 3. 多重?zé)晒釶CR 采用多重?zé)晒釶CR的方法對(duì)NCI建議的位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，以確定MSI狀態(tài)。,.,13,檢 測(cè) MSI 方 法 比 較,.,14,Microread MSI 檢 測(cè) 試 劑 盒,閱微基因根據(jù)NCCN指南，針對(duì)結(jié)直腸癌基因診斷領(lǐng)域研發(fā)了MSI檢測(cè)的試劑盒。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）檢測(cè)試劑盒是一款以多重?zé)晒釶CR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)，一次擴(kuò)

7、增檢測(cè)6個(gè)MSI位點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、快速。,.,15,擴(kuò) 增 檢 測(cè) 位 點(diǎn),.,16,MSI 檢 測(cè) 送 樣 要 求,若客戶提供石蠟切片，則要求厚度5-20m的石蠟切片（切片中確保含有9mm2以上大小的組織塊）10片或以上，注明石蠟包埋組織的保存年限，組織類(lèi)型和包埋前處理方式等。 若客戶提供DNA樣品，則從新鮮組織提取的DNA最佳，20ng/l以上的DNA 20l即可（需提供DNA濃度）；若為石蠟包埋組織提取的DNA，除了提供DNA的濃度（20ng/l以上的DNA至少20l）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖,.,17,MSI 檢 測(cè) 試 劑 盒 使 用 方 法,DNA提?。焊鶕?jù)樣本不同，采用二甲苯或

8、Chelex 100的方法提取DNA； PCR擴(kuò)增： 毛細(xì)管電泳檢測(cè)：按照（0.5lROX500）樣品數(shù)+（8.5l甲酰胺）樣品數(shù)制備好樣品，RUN 3130 xl遺傳分析儀。,.,18,操 作 流 程 示 意 圖,.,19,數(shù) 據(jù) 分 析,目的峰： A. 單核苷酸標(biāo)記的位點(diǎn)NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均為類(lèi)似五指的手掌峰，見(jiàn)圖2； 圖2 單核苷酸標(biāo)記位點(diǎn)峰型示意圖,.,20,B. 五核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)Penta C、Penta D和性別位點(diǎn)Amelogenin的峰型均為單峰型，見(jiàn)圖3。 圖3 五核苷酸標(biāo)記和性別位點(diǎn)峰型示意圖 非目的峰：pull-up

9、峰、stutter峰、染料峰、加A不完全峰等。,數(shù) 據(jù) 分 析,.,21,MSI 判 定 結(jié) 果,微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI-H型,根據(jù)NCI建議，與正常樣本比較，有2個(gè)發(fā)生改變可稱(chēng)定為MSI-H型，只有1個(gè)出現(xiàn)不穩(wěn)定的為MSI-L型，沒(méi)有出現(xiàn)突變的情況為MSS型。,.,22,微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI-L型,MSI 判 定 結(jié) 果,.,23,微衛(wèi)星穩(wěn)定MSS型,MSI 判 定 結(jié) 果,.,24,MSI 檢 測(cè) 試 劑 盒 優(yōu) 點(diǎn),基于MSI的NCI panel標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)發(fā)了適合中國(guó)人群的MSI檢測(cè)系統(tǒng)； 采用多重?zé)晒釶CR技術(shù)，一次擴(kuò)增和檢測(cè)6個(gè)準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸微衛(wèi)星基因座，其中5個(gè)與國(guó)外檢測(cè)相吻合，另外增加了

10、一個(gè)適合中國(guó)人群的位點(diǎn)； 基于測(cè)序儀的基因分型研究領(lǐng)域擁有多年的經(jīng)驗(yàn)和多項(xiàng)成果，已經(jīng)做了超過(guò)1000例病例樣本，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。,.,25,MSI 檢 測(cè) 案 例,XBH-X,XBH-1,* 接收委托方兩份樣本，正常組織XBH-X和腫瘤組織XBH-1，要求鑒定腫瘤組織的MSI狀態(tài)，正常對(duì)照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和MONO-27等5個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰。該腫瘤組織為MSI-H型。,.,26,13MS6E,13MS6C,* 接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織13MS6C和正常組織13MS6E，要求檢測(cè)該腫瘤組織的MSI狀態(tài)，6個(gè)單核苷酸位點(diǎn)均未出現(xiàn)MSI，鑒定結(jié)果為MSS穩(wěn)定狀態(tài)。,MSI 檢 測(cè) 案 例,.,27,閱 微 基 因 診 斷 試 劑 簡(jiǎn) 介,脆性X綜合征檢測(cè)試劑盒 五種特性檢測(cè)脆性X綜合征：準(zhǔn)確計(jì)算CGG重復(fù)數(shù)、靈敏度高于Southern雜交、可識(shí)別女性純合子及雜合子、檢測(cè)AGG插入、結(jié)果100%可重復(fù)。 白血病BCR-ABL1檢測(cè)試劑盒 檢測(cè)三種最常見(jiàn)BCR-ABL1變體；可進(jìn)行絕對(duì)定量；靈敏度達(dá)10-5；整合ARQ技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確；成本較低。,.,28,Y微缺失檢測(cè)試劑盒 操作簡(jiǎn)便；8小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果；模版需要量