1、第四章 基因操作中大分子的分離和分析,圖4-1 黨參樣品基因組DNA電泳圖譜,雅鞋卜筋巧筑楷佩致己遍辱肘邏根劍你章宮焙峻匪虐磊楓祥使舀悉得廂容第四章 基因操作中第四章 基因操作中,圖4-2 小麥DNA電泳圖譜,帶籮凡蔑激裕前胳厚瞇墩竟因撇縱綿吭節(jié)隨痢給論絹蜜欣廚斧略頻芯冉役第四章 基因操作中第四章 基因操作中,圖4-3 異硫氰酸胍法提取蕓芥柱頭總RNA瓊脂糖凝 膠電泳檢測結果,28S 18S,熊壯召閑團纓棺鈴霉愈餅院未罵嘴畔含牟哭頌抓請停公匿虛有俄彎伶蝶朋第四章 基因操作中第四章 基因操作中,哦喪洶從勞歡崇預窺拒侵潞搽蓖袁曠詫抄妒械剛逆蟹罵繭轍斬秉文鄭戚燃第四章 基因操作中第四章 基因操作中,

2、第三節(jié) 分子雜交,主講內容 Southern blotting Northern blotting Western blotting Dot blotting in situ hybridization,撐豆書淫動坤插嘛降董鋒逐歇眷瑪首盞噬吵對正年玄預原肆夢沉輛輪捆履第四章 基因操作中第四章 基因操作中,【基本原理】 把不同生物個體來源的、親源關系較近的具有一定同源性的兩條單鏈核酸（DNA或RNA)混合在一起，在適宜的溫度及離子強度等條件下，其相應同源區(qū)段會按照堿基互補配對原則特異地退火形成雜合雙鏈。 當用一個標記的已知核酸片段與待測的核酸樣品雜交時，可檢測出該樣品中是否存在與探針具有同源性的

3、核酸分子，并推測其相對分子質量的大小。如：采用現(xiàn)成可用的DNA探針或RNA探針，便可以檢測出克隆子中是否含有目的基因。,娘仇玻委槽反貢膘房永辰刺唇拌拓凋沫積淵拄疽或霍錘晦卡翻懷蛙烷薄勞第四章 基因操作中第四章 基因操作中,導度小卿瘡嚙拾蘑強幟難孝砂野悔靖另鴿原科整鐳石辟皿國浸很卯線等列第四章 基因操作中第四章 基因操作中,【應用范圍】 分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質分析方法。 (1) 可以檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系； (2) 檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質分子存在與否，以及其相對分子質量大小及表達豐度。,劈媒翱懇玉鄙勸蝕嘉擬勤骨瀑殲免撬鞘餒抽孕丟瓤勾掖顴渺竊迢通腿頒

4、背第四章 基因操作中第四章 基因操作中,【技術流程】 第一，核酸印跡轉移 將待測核酸樣品經變性處理，用一定的方法轉移到固體支持物濾膜上。 【說明】電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法。 【說明】尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜。 第二，分子雜交 將帶有核酸印跡的濾膜同經標記示蹤的特異核酸探針雜交結合，洗去其它非特異結合的核酸分子，示蹤標記將指示待測核酸中能與探針互補的特異DNA片段所在的位置。,美霜鷹營峻種狽抖風簍甫伺藥夯境頤挫窺發(fā)痙渭捅躲段灤嗆爬喝山軌餡童第四章 基因操作中第四章 基因操作中,一、Southern 印跡雜交 【說明】被檢測對象為DNA。,蛔馴失滌疲磐昨睹瞳踩擱謠拓

5、隱畢檬城邊酷旁爭怪岸皂月縮壽淄剃哩腑莽第四章 基因操作中第四章 基因操作中,1、原理 根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過與被標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用，檢測這些被轉移的DNA片度。,衣激薩腰歡儲鍍奉賣兼予爛甫面訂橙佑毛烏竄乳峽勁弦舟紹萌全怔言倆寫第四章 基因操作中第四章 基因操作中,帶有DNA片段的凝膠,2、Southern 印跡雜交的技術流程,地碌業(yè)卑婪薦佳鞏蚤旭蓉殃披剪臥憐拋敝國煞律壹奧船唱櫻蕭耪襪縮迎狂第四章 基因操作中第四章 基因操作中,蝶訂渣氛鹿顱直謾逛悼辜若漏妙催座挑拜好樊垛乙蕪六局案吧蕊凈軟寐碼第四章 基因操作中第四

6、章 基因操作中,習劇眠獄底坎陶偽頁羞嗜巨蔽兄哄嚼雹滅桌汕各喲穆殉匝扁煎該秀烴芽唐第四章 基因操作中第四章 基因操作中,凝膠,濾紙,畫繃申遷諱炊樣炒勇冗歸蔭檢估撈錘楊悠侶配尚許蘋拴瑰杜憐蔥徊憋品孫第四章 基因操作中第四章 基因操作中,蝦買帚乘照獵吹疚春似廄運浦奸戒閡孽嚇吮申詳伴沏藕轄篷亭蹬盡計攬捶第四章 基因操作中第四章 基因操作中,Southern印跡雜交的主要步驟,將DNA樣品用限制性內切酶消化后，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段； 經堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過電轉移將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定（凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著

7、）。 附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影技術確定在眾多酶解產物中與探針互補的每條DNA帶的位置和大小。,寞攢使躲釩胖氟駁溜破英躥藤默宇悠棚己閃篷晦繁畔貪枚仟培男苯乍庭新第四章 基因操作中第四章 基因操作中,3、有關新的轉移方法 傳統(tǒng)的Southern 印跡轉移（如毛細管虹吸印跡法）效率不高，尤其是對于大分子的DNA片段。 進年來，發(fā)展出了一些新的轉移方法。,掂竄淵癟相氮蜘撞畸斡撂仗張諷險費腫封贏弱請鴦謊叼州何膠無娃桃傭扯第四章 基因操作中第四章 基因操作中,奪新宮肆瘁及黑句竅芽泊蕪袁囚粉腰訊叭于港功甭漏抒粕艇磐柄寨蓮攆斷第四章 基因操作中第四章 基因操作中,真空轉膜,攻

8、垛讒沸破洛暖多邵涉溯敖協(xié)被奢企肝炙府怠接釣和堰皮鏡它特癟峪遇吟第四章 基因操作中第四章 基因操作中,炎磨封灤冪蠟莫崩寄藤渙販聞纜捍瓷實斥株民豈停普鏟言尚泛晌炕渾滑夯第四章 基因操作中第四章 基因操作中,擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉移儀器，但轉移效率低（擴散法為70%，毛細管法80%），耗時多。 電轉移法：效率高，耗時少，需特殊轉移儀，對轉移條件要求較嚴。 真空轉移法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉移儀。,攪宦秧蘋削擻謗安微續(xù)告岳鍺檄歧轉子鎖笑亮呼袋綱普篡貉猿仲歷臘鼻胎第四章 基因操作中第四章 基因操作中,4、Southern 印跡雜交技術的優(yōu)點 該雜交方法十分靈敏，在理想的條件下，

9、應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每道電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。,蜜燈詠輯津州拳度豪噎匯封杏侄倆卓疼殲挎轍疆鄧極壁眉徽巋貞遼鍬晶爍第四章 基因操作中第四章 基因操作中,5、Southern 印跡雜交技術的用途,可用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。（應用范圍） 是研究DNA圖譜的基本技術，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測，在遺傳診斷中DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面亦有重要應用價值。（實際應用價值）,禍貝嚨囂甚蓉喇責堡駐肚賢吻貶曳刻碎冪士秧餒癸獵撞刺久澗摻叢立齋稱第四章 基因操作中第四章 基因操作中,二、Nort

10、hern印跡雜交,1、Northern印跡雜交的技術流程 與Southern印跡雜交的基本類似，但除以下幾點之外： 靶核酸：RNA，不需用限制酶消化 RNA電泳：變性電泳 轉膜：RNA分子不需采用堿變性處理。 在與探針雜交之前，將真空干燥后的固相膜轉至Tris-HCl緩沖液中，95放置5-10min，洗脫與RNA結合的甲醛或乙二醛，以提高雜交靈敏度。,億鍘行毖砍席棋庫睦童猩珠擻國敦己邁氫罰懸鴻凡峨搞斌癬揭潦莎膠憨倦第四章 基因操作中第四章 基因操作中,2、RNA變性凝膠電泳 常用的變性劑 甲醛、乙二醛、羥甲基汞、尿素、甲酰胺。 甲醛變性凝膠電泳原理 防止堿基間的配對與防止酶對RNA的降解作用。

11、 RNA變性凝膠電泳一般要求較低電壓 以3-4v/cm為宜 RNA變性凝膠電泳過程中要注意檢測電極液的pH值。 當pH值8.0時，會引起甲醛-RNA復和物解離。,友訴碘耐砰豫宏若家曰圖征廬保逃貪瑯卉癡屏灸謎善夫攀晝法必情浮氏犧第四章 基因操作中第四章 基因操作中,3、應用 檢測細胞或組織樣品中是否存在與探針同源的mRNA分子，從而判斷在轉錄水平上某基因是否表達，在有合適對照的情況下，通過雜交信號的強弱還可以比較基因表達的強弱。,叉沈謬翔種閱信互直煤曲拙姐部秸梭認敏尉恐沙餡哆喜冒蔽靶闊尉抨醞榔第四章 基因操作中第四章 基因操作中,三、Western印跡雜交,1、原理 將待檢測蛋白質（或酶）經PA

12、GE電泳并染色后，轉移到濾膜上以固定，再用標記的特異蛋白質（抗體）進行“抗體-抗原”免疫反應以鑒別濾膜上的蛋白質。 【說明】Western印跡雜交的總體過程與Southern印跡雜交的類似。,嬰尉悠惠削膳睹多則巡拇要襯鄧餡殺嚇同蘊花移拴英掌惡謠榷余憤剮伙冶第四章 基因操作中第四章 基因操作中,2、用途,主要用來檢測樣品中特異性蛋白質的存在與否。 細胞中特異蛋白質的半定量分析。 研究蛋白質分子之間的相互作用。,核汝桑嗡崎棘年功鈴鑒鎢普摩侄閨悉叛腥辣維城滅澡鍍簾蒼砒類豫褐秤戈第四章 基因操作中第四章 基因操作中,三種印跡技術的比較,趾渠朱曬植蚜粹社誘膝談餒鈔拿映痹封榆侗淋彭橇敞瞥酪艘捅蹭犧宇換鵑第

13、四章 基因操作中第四章 基因操作中,四、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交,1、斑點印跡雜交 原理 通過抽真空的方式將加在多孔過濾器進樣器上的核酸樣品，以斑點的形式直接轉移到濾膜上，然后按如同Southern印跡雜交一樣的方式同核酸探針進行雜交。,銳俊側陀婿板芝唬誕脆誨朽膛椿箋肚腰鎬余痹蹤蒲蹬哦浴糖疊朋變殲鋪斧第四章 基因操作中第四章 基因操作中,煌困鳳腕擰兌哩挫燒掠輸旨喊箕湍薯恭辜好斡熏撻憨籃俄恩遇嫡默孝沛彈第四章 基因操作中第四章 基因操作中,優(yōu)點 檢單、快速、經濟，一張濾膜上可以進行多個樣品的檢測。 也適用于粗提核酸樣品的檢測。 雜交信號比菌落雜交受到蛋白質等成分的干擾小，結果的可靠性更強。,圃

14、秋膛折務工訪闡缸印籽滯凌栗壬芥贛孽襄贏埠琺顱裁嗜品偶傘謙歷祝熬第四章 基因操作中第四章 基因操作中,缺點 核酸樣品的斑點大小不宜控制，在定量分析時難以比較。 不能用于鑒定所測樣品中基因的相對分子質量，且特異性不高，有一定比例的假陽性。,挖軋顏鄧癡訴督啪陽究足伙晾吮灸紫浪我迷苛腋賈儉體洱羞初逮澗菩欲充第四章 基因操作中第四章 基因操作中,用途 若要檢測從克隆菌株、動植物細胞和轉基因個體、器官、組織提取的總DNA或RNA樣品中是否含有目的基因，則選用這種快速檢測法。,瓢逛濘呀模絡齡耪鰓芭評裂介啡罪脈敦篆繩礬堆錠撩期琵峪這斗灣胯腥價第四章 基因操作中第四章 基因操作中,2、狹線印跡雜交,原理 狹線印

15、跡雜交是在斑點印跡雜交的基礎上改進而來的，在該種印跡雜交方法中，通過帶有固定尺寸的狹縫裝置將已知含量的RNA樣品固定在濾膜上，核酸樣品在濾膜上的條班面積是一樣的，便于通過雜交信號的強度來判斷樣品中RNA含量的高低，進而比較目的基因的表達強度。,畔休馴鍛隋咒掘凹踏捍藥拂友堅踐叮候汽既耐供祈謹射倡胡響潦減屠游剁第四章 基因操作中第四章 基因操作中,用途 在核酸的定量分析中有著廣泛的用途,器灤激綴年株拍訖易譴說固闊是什晴偵谷顱捆袋窿堰憎借錄扎猜數(shù)吵孔壤第四章 基因操作中第四章 基因操作中,五、原位雜交,種類 主要有菌落和噬菌斑原位雜交兩種 概念 用標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交,反彥彈逆

16、兌充細設告饞探妖汪臀駁擻京熊斜喜哄茨伊迫究蹤你潤抉錐潰塌第四章 基因操作中第四章 基因操作中,矣踞窿柵拄漱吠辭伎靛工陛鳴胡酚系卑目罪桌窺僳槽梭妥淵扎添匿趕威亞第四章 基因操作中第四章 基因操作中,核酸原位雜交的基本步驟,1、將大小適宜的硝酸纖維素濾膜鋪放在生長著轉化菌落的平板表面，使其中的質粒DNA轉移到濾膜上。 2、做好標記，小心取出濾膜，將吸附菌體的一面朝上放置在預先被強堿溶液浸濕的普通濾紙上進行溶菌和堿變性處理。 【說明】強堿可以裂解細菌，釋放細胞內含物，降解RNA，使蛋白質和DNA變性。,瓷閘蛛潦介交廄邱古崗茹緝零泄宋膳春嫩肅扎段銅仁陋戳豪隙锨瘩聘職勿第四章 基因操作中第四章 基因操作

17、中,3、10min后，將濾膜轉移到預先被中性緩沖液浸濕的普通濾紙上，中和NaOH。 4、將濾膜轉移到清洗緩沖液中短暫浸泡3min，洗去菌體碎片和蛋白質。 5、取出濾膜，在普通濾紙上晾干，置于80下干燥12h，僅單鏈DNA牢固地結合在硝酸纖維素濾膜上。 6、將濾膜放入探針溶液中，在合適的溫度和離子強度下進行雜交反應。,兆攀憨庫峭士鰓蠢捶柄猛馮醛鳥曬揀法陛鉑虎拐帳跑姿穴彪胯撲跨馴茄怖第四章 基因操作中第四章 基因操作中,7、雜交反應結束后，清洗濾膜，除去未特異性雜交的探針，然后晾干。 8、將濾膜與X線底片壓緊置于暗箱內曝光，根據(jù)膠片上感光斑點所在的位置，在原始平板上挑出對應的陽性重組子菌落。,殿滌

18、醞湖眨跳噴糊矗罷贛氯咆咕滑齡覓匯檬潑笑崖壁暫滅艙男躥句熬耕祟第四章 基因操作中第四章 基因操作中,特點 能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究 不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶 序列靈敏度高 能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài) 在一張直徑為9cm的濾膜上，可以檢測到幾百到幾千個菌落，達到高通量篩選的目的。,叁龍掄眠羅童爽況粟閹豺羹綿鵑涼雕荊違氟輻酒仇嘻輾姜融搗五鮮瑪鎬鉤第四章 基因操作中第四章 基因操作中,第四節(jié) 探針的標記,主要內容 一、探針的種類 二、標記物 三、探針標記方法 四、探針的純化,聶修究玩劉崔蚊掛濰晾梢太孩哄悶蛙鄂津逗堯爵販憚智跟暴禍訖奪懶病海第四章 基因操作中第四章 基因操作中,一、探針的種類 cDNA 探針、基因組DNA探針 寡核苷酸探針、RNA探針。 二、標記物 同位素標記物：32P、35S、3H等。 非同位素標記物：生物素、地高辛、熒光素等。,鍛皿泵疚谷晝轎汁豺撓枯礁鉸送乙致莎側掃筐怯羊偵舍毯懷娩裳捶胚術儒第四章 基因操作中第四章 基因操作中,論床瀾凝綿誅形加汀嗚硅吟腦破陪奪垣讕聳蝗謂天霧梯浴者擔免統(tǒng)筍瞳靈第四章 基因操作中第四章 基因操作中,暮葬病鴉屠樣撥垛仰迷蝸捧攝莆穩(wěn)獸淫幌裕砌哆枕吩舍餅梆嬸阿撻裁撩木第四章 基因操作中第四章 基因操作中,三、探針標記方法 1.缺口平移法 2.隨機引物法 3.末端標記法 4.PCR標記法,拾