1、實(shí)驗四 RT-PCR及瓊脂糖凝膠電 泳原理與技術(shù),實(shí)驗?zāi)康?了解RT-PCR的基本原理。 熟悉RT-PCR的常規(guī)步驟。 掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。,實(shí)驗要求,掌握PCR技術(shù)。 學(xué)會操作PCR儀。 熟悉瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。,實(shí)驗原理,聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去

2、幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。,實(shí)驗原理,PCR是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，其特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中，用兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物。一般情況下，這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)；而這兩段模板序列又分別位于待擴(kuò)增DNA區(qū)段的兩側(cè)。反應(yīng)時，首先是在摩爾數(shù)過量的兩段寡核苷酸及4種dNTP存在下，將模板進(jìn)行加熱變性。隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，使引物與它的靶序列進(jìn)行配對，稱為退火。然后，退火引物可在DNA聚合酶作

3、用下進(jìn)行延伸。上述過程是由溫度控制的。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。,實(shí)驗原理,PCR是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。PCR按照底物（即模板DNA）的來源和引物的特點(diǎn)可分為經(jīng)典PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中，RT-PCR較常用。在這個反應(yīng)體系中，被檢物為RNA，如mRNA，需借助逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄作用，轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的互補(bǔ)鏈DNA（cDNA）才能進(jìn)行PCR。為此，逆轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進(jìn)行，先作逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以此為模板作PCR。,注意事項,PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：

4、引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。（引物設(shè)計原則見下張幻燈） 酶及其濃度：催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 dNTP的質(zhì)量與濃度：分裝后-20冰凍保存，多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200mol/L，注意4種dNTP的濃度要相等，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。,設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：,引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴(kuò)增跨度： 以200

5、-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。,注意事項,

6、模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。要防止RNase降解RNA。 Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200mol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 PCR反應(yīng)條件的選擇：溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。 溫度：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4

7、0 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。,注意事項,變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。 退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。 Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(510) 復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。,注意事項,延伸溫度與時間：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段

8、，延伸時間1min是足夠的。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。 循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。,實(shí)驗器材及試劑,1.實(shí)驗器材：PCR儀、水平電泳槽、灌膠架，梳子、電泳儀、掃描儀、微波爐、移液槍（ 20l-200l、0.2-2l、2-20l）、吸頭（200l、10l）、吸頭臺、200l PCR管、試管架、紙巾、廢液缸等。 2.試劑：PCR試劑盒、GeneFinder、Marker（100bp）、瓊脂糖、無水乙醇、冰醋酸、Tris

9、堿等。,實(shí)驗步驟,RNA的提?。?組織100mg（細(xì)胞1107） 加1mlTRIzol（細(xì)胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細(xì)胞團(tuán)塊） 勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管） （組織勻漿量100mg時分裝1ml/每EP管） 顛倒混勻10下，室溫5分鐘 加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）變性作用 顛倒混勻10下，室溫5分鐘 4，離心12000g，15分鐘 轉(zhuǎn)上層水相（約400l）于另一1.5mlEP管中,RNA的提取, 加等體積異丙醇（約400l），混勻室溫10分鐘 4，離心12000g，10分鐘 棄上清 加冰預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml 4離心7500g，5分鐘 棄上清，空

10、氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥） 溶于DEPC水中至20l（10l-20l） （可在55-60水中，10分鐘助溶）,注意事項,處理RNA樣品時必需仔細(xì)小心,其程度取決于樣品的用途和來源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞,因此建立一個無RNA酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要.對于制備mRNA來說這些預(yù)防措施尤其重要. 方案: 1）工作區(qū)域應(yīng)與進(jìn)行普通微生物實(shí)驗的區(qū)域分離開,特別是那些用于細(xì)菌接種,培養(yǎng)基和試劑配制的區(qū)域,那些培養(yǎng)基和試劑用于從細(xì)菌和動物細(xì)胞中進(jìn)行DNA的制備和操作.通常認(rèn)為這些區(qū)域富含RNA酶.2）如有可能,使用標(biāo)有“無RNA酶”的商品試管,吸頭

11、,溶液和水.通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無RNA酶。,注意事項,3)雙蒸水(ddH2O)和溶液應(yīng)該用RNA酶的抑制劑DEPC(焦碳酸二乙酯)進(jìn)行處理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在搖床上充分混勻并在37下作用數(shù)小時.然后將溶液高壓滅菌15min使DEPC失活. 4)用分子級的試劑和DEPC處理過的水配制的溶液通常沒有RNA酶.5)分離RNA以前,將一些實(shí)驗室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以滅活核酶.如有可能,將其他設(shè)備也滅菌處理. 從組織中提取RNA則要注意:動物器官的解剖器械 存放組織塊的玻璃器皿 凍存組織塊所用的器皿組織器官的沖洗液人汗含有RNA酶,故在

12、所有步驟中均應(yīng)戴橡膠手套并經(jīng)常更換.,注意事項,記住我們的周圍環(huán)境含有大量的微生物和氣霧,它們來自吸液操作或來自我們自己的呼吸.這些可能造成RNA酶的污染。 一些組織像脾臟可能比其它組織含有更多的RNA酶.細(xì)菌比哺乳動物細(xì)胞中有更多的RNA酶.因此從這些細(xì)胞中制備RNA應(yīng)采取更嚴(yán)格的預(yù)防措施. 分離后的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳再經(jīng)溴化乙錠染色后便可檢查其是否完整.rRNA(18s和28s) 條帶模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.,注意事項,1、RNA若用于核酸轉(zhuǎn)移應(yīng)溶解于樣本緩沖液中，否則用DEPC溶解 2、細(xì)胞組織加TRIzol勻漿后，可在-60放置至少一個月（甚至可一年以上） 3、

13、RNA在75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年,第一步：RT反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（總體積10l） MgCL2 2l 10RT buffer 1l RNase free H2O 3.75l dNTP 1l RNase Inhibitor 0.25l AMV Reverse Transpase 0.5l Random 9 mers 0.5l RNA樣品 1l 反應(yīng)條件：30 10min，42 30min， 99 5min， 5 5min。,第二步：PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)體系（總體50l） 5PCR buffer 4l ddH2O 7.9l Taq酶 0.1l Primer F 2

14、l Primer R 2l cDNA 4l 反應(yīng)條件：94 2min, 94 30s, 50 30s, 72 2min. 35cycles(),第三步：電泳,將5l PCR產(chǎn)物，加入點(diǎn)在parafilm上的預(yù)染buffer中（產(chǎn)物：buffer5：1），反復(fù)吸打混勻后進(jìn)行電泳，一般電流為10mA，電源100-150V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結(jié)果掃描打印。 注：凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。,瓊脂糖凝

15、膠電泳步驟,1.移取適量的瓊脂糖(如制備1.5%的瓊脂糖膠液，就移0.45g的瓊脂糖溶于30ml TAE緩沖液中)微波爐加熱使其溶于TAE緩沖液中。然后將2lgenefinder加到膠中，再將瓊脂糖在微波爐加熱至完全融化，然后冷卻至50。 2.緩慢地將瓊脂糖膠液注入一個帶有“梳子”的膠床中(避免氣泡產(chǎn)生)，若有氣泡產(chǎn)生用塑料移液管移去。現(xiàn)在許多種膠床都可方便買到并且根據(jù)其說明書而得以應(yīng)用。 3.根據(jù)膠的大小讓膠凝固20-60min.,瓊脂糖凝膠電泳步驟,4.當(dāng)膠正凝固時，準(zhǔn)備DNA樣品并取適量的DNA（如5l）加1l加樣緩沖液(genefinder:6loading buffer=1:9)混合

16、，加樣液中包含染料如溴酚藍(lán)（BPB）。 5.膠凝之后，輕輕移去梳子。將膠床放在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑末端），注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。 6.加DNA樣品及進(jìn)行電泳：使吸管與加樣孔垂直，使吸管尖端剛好在加樣孔開口之下，緩慢將DNA樣品加入加樣孔中。,瓊脂糖凝膠電泳步驟,7.加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源（黑的連陰極，紅的連陽極）在打開電源之前，設(shè)定好電壓和時間（電壓100mV, 時間30min.） 8.通過檢查加樣孔附近的鉑線來檢測接線柱是否連接良好。若連接良好，負(fù)極附近的鉑絲會有氣泡產(chǎn)生。 9.電泳過程要進(jìn)行一個合適的霎時間。電泳時間的選擇取決于膠的長度和電

17、壓的大小。膠越長，電壓越低，所需時間越長。然而，使用高電壓時，大的DNA片段的分辨率很低。 10.凝膠攝影,注意事項,1.TAE和TBE都是常用的緩沖液，TBE相對于TAE而言有較高的緩沖量。 2.電泳中，溴酚藍(lán)和0.5Kb大小的DNA一起移動，這可給泳動最快的DNA片段提供一個指征。 3.DNA的遷移依賴如下因素： DNA分子越小，遷移越快。瓊脂糖其濃度越低，遷移越快。DNA的構(gòu)象，環(huán)狀切口DNA比線狀DNA遷移快。兩電極間每厘米的電壓，電壓越高，遷移越快。,注意事項,4.引物：1個OD260值相當(dāng)于33g,2個OD260值相當(dāng)于66g 引物的貯存液濃度為100mol.L-1 ；工作液濃度為20mol.L-1。故2個OD260值的引物稀釋為100mol.L-1的工作液時所需的加水量：（66g/分子量）104所需加水的l數(shù).一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.21.0mol.L-1. Xmol.L-1=OD260/A(16000)