1、WB過程中的常見問題及處理方法,WB的簡介,WB 即蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。,基本原理 通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。,應(yīng)用 1.目的蛋白的表達(dá)特性分析 2.目的蛋白與其它蛋白的互作 3.目的蛋白的組織定位 4.目的蛋白的表達(dá)量分析,三、WB的影響因素,步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果 1、電泳分離蛋白 蛋白抽提； 蛋白定量； 樣品制備變性； 上樣量； 電泳（電壓、電流的大小，膠濃度、制膠）,2、轉(zhuǎn)膜 膜的選擇；

2、 膜的確認(rèn)； 特殊處理 ； ,3、封閉 封閉液的選擇； 封閉條件優(yōu)化 ； ,4、漂洗 漂洗液的配制與選擇 漂洗時間及次數(shù),5、抗體孵育 抗體及稀釋液選擇； 抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化 ； 抗體孵育時間； ,6、曝光 曝光時間的掌控,四、注意事項(xiàng),1.蛋白樣品的提取 盡可能新鮮組織或蛋白 避免反復(fù)凍融 對于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF） 盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略） 選擇合適的裂解液 準(zhǔn)確定量（BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白）,2、制膠 根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。,制膠的時候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。 玻璃板底部放平，盡量不能漏膠 灌膠的時候，不

3、能太快，容易產(chǎn)生旋窩 水或異丙醇壓的時候，不能太久,3、轉(zhuǎn)膜 a 泡膜： 轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的 轉(zhuǎn)移液浸泡 20min； 凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜 buffer 中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形 bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化,c膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板，不能放反 d轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻 e具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短 f避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫绊戅D(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。,g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間

4、沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全 h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率 i一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,4、封閉 a 脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼?b如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化 c檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑,5、孵育 a洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景； b注意一抗二抗的匹配 c一抗二抗的效價(jià)問題,五、常見問題及解決,電泳中的問題 條帶呈笑臉狀 凝膠不均勻

5、冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高, 條帶呈皺眉狀 可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全,拖尾 樣品溶解不好,紋理（縱向條紋） 樣品中含有不溶性顆粒,條帶偏斜 電極不平衡或者加樣位置偏斜,條帶兩邊擴(kuò)散 加樣量過多,Western blot 結(jié)果曝光問題,背景過高且不均勻 1、封閉不充分 延長封閉時間； 更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等） 2、一抗?jié)舛冗^高 增加一抗稀釋倍數(shù)； 3、抗體孵育溫度過高 4孵育,4、二抗非特異性結(jié)合 或與封閉劑交叉反應(yīng) 設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?5、洗膜不充分 增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù),沒有陽性條帶

6、或很弱 1、一抗、二抗等不匹配 訂購試劑時認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。 可通過設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級測系統(tǒng)的有效性 更換更好的一抗二抗,2、一抗或/和二抗?jié)舛鹊?增加抗體濃度； 長孵育時間；,3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng) 封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20 更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠）,4、樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過 設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。 后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目,5、轉(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過度 使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉(zhuǎn)