1、第八章 真核表達系統(tǒng) Chapter 8 Eukaryotic expression system,概述( introduction ) 真核基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控特點( Features of eukaryotic gene structure and regulation) 真核表達系統(tǒng)(eukaryotic gene expression system) 酵母表達系統(tǒng)(yeast expression system) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)(mammalian cell expression) 昆蟲細胞表達系統(tǒng)(insect cell expression ),內(nèi) 容,第一節(jié) 概述,一、真核基

2、因組的復(fù)雜性 二、原核表達系統(tǒng)的局限性 三、真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢,一、真核基因組的復(fù)雜性,1. 真核基因組巨大 大腸桿菌基因組約4106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級 大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因 2. 真核生物遺傳信息復(fù)雜 原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體 真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達調(diào)控的層次和復(fù)雜性。 ,細菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱子，共同開啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA； 真核生物則是一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一

3、條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱子的結(jié)構(gòu)。 真核細胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個基因協(xié)調(diào)表達的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達要比原核生物復(fù)雜得多。,3. 真核生物基因協(xié)調(diào)表達,4. 真核生物基因編碼復(fù)雜,原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實驗表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。 原核生物的基因為蛋白質(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪

4、接(splicing)去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)。 原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復(fù)序列(repetitive sequences)。 真核生物mRNA 5有帽狀結(jié)構(gòu)，3末端有PolyA尾巴,1、沒有轉(zhuǎn)錄后的剪接和加工系統(tǒng) 2、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)：不能進行糖基化、磷酸化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。,二、 原核表達系統(tǒng)的局限性,3、在原核細胞中表達的真核蛋白不穩(wěn)定 易被細菌蛋白酶降解; 難實現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低; 而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割，或不在特異位置上切割。 表達產(chǎn)物常

5、以包涵體的形式存在，后期變性、復(fù)性的效率低 4、內(nèi)毒素的污染 (contamination of endotoxin),1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng): 2. 具翻譯后修飾系統(tǒng) 3. 可實現(xiàn)真正的分泌表達,三、真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢 ( advantages of eukaryotic expression system ),（一）真核基因表達調(diào)控特點 -多層次、多方面 （二）真核基因表達的調(diào)控模式,第二節(jié) 真核基因表達調(diào)控特點Features of Eukaryotic gene structure and expression,真核基因表達的調(diào)控模式 ( The regulating mode

6、l of eukaryotic gene expression),1、轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平) ：gene level 2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控: transcription level 3、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控: post-transcription level 4、翻譯水平的調(diào)控: translation level 5、翻譯后修飾: post-translation modification,1、轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平)： gene level 基因結(jié)構(gòu)的改變、穩(wěn)定持久、不可逆，組蛋白修飾，DNA甲基化等,2. 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 順式調(diào)控元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-

7、acting factor),（1 ）順式調(diào)控元件(cis-acting element) 結(jié)構(gòu)基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而啟動 轉(zhuǎn)錄的DNA序列，主要包括： 起正性調(diào)節(jié)作用：啟動子、增強子 起負性調(diào)節(jié)作用：沉寂子，終止子，加尾信號,啟動子 位于基因5末端與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的核苷酸序列。作用特點是近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定。一般包括 核心啟動子元件（core promoter elements) ： 指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，決定基因轉(zhuǎn)錄的精確起始位點產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，包括：轉(zhuǎn)錄起始點及-30區(qū)的TATA-box 上游啟動子元件（upstream promot

8、er elements) 包括 -70到-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側(cè)的GC盒，協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)效率 組織特異性元件 誘導(dǎo)性啟動子元件,真核啟動子結(jié)構(gòu)模式圖,核心啟動子元件,上游啟動子元件,哺乳類RNA聚合酶啟動子中常見的元件,增強子(enhancer) 是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件 增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性 無方向性（序列、位置） 遠距離作用（1-4kB） 無基因特異性 具組織特異性,構(gòu)建載體,沉寂子（silencer)或衰減子（dehancer) 是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，作用方式 與增強子相同 轉(zhuǎn)錄終止信號： 控制基因轉(zhuǎn)錄的終止，由

9、polyA上游的10-20bp處的加尾信號（AATAA）和poly A下游的G/T簇構(gòu)成,（2）反式作用因子(trans-acting factor),由位于不同或相同染色體上相距較遠的 基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過與順式調(diào)控 元件和RNA聚合酶的相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn) 錄活性。,轉(zhuǎn)錄信號1,P,Trans-acting factor,Trans-acting factor (DNA結(jié)合蛋白）,Cis-acting factor,A gene,mRNA of A,Protein A,B gene,mRNA of B,Protein B,DNA,3、轉(zhuǎn)錄后的修飾 內(nèi)含子的剪接 外顯子的拼接 mRN

10、A的加尾和加帽 mRNA的穩(wěn)定性,4、翻譯水平的調(diào)控 主要是microRNA對mRNA、tRNA 和rRNA的調(diào)控,5、翻譯后的調(diào)控 切除信號肽 糖基化 乙?；?磷酸化 甲基化 蛋白質(zhì)的降解,第三節(jié) 真核表達系統(tǒng),組成： 真核表達載體 受體細胞,真核表達載體,適用于在真核細胞中表達外源基因的載體。 真核載體根據(jù)受體不同，又可分為幾種： 酵母表達載體 哺乳動物細胞表達載體 昆蟲桿狀病毒表達載體,受體細胞,據(jù)受體細胞及表達載體的不同分為3種： 酵母表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 昆蟲細胞表達系統(tǒng),發(fā)酵簡單、快速、便宜 真核生物，有翻譯后修飾功能 可分泌表達，簡化了純化工藝 受體細胞安全,一、酵母表

11、達系統(tǒng),（一）酵母載體: 1、概念： 攜帶外源基因在酵母細胞中復(fù)制、擴增 和表達的載體，包括克隆載體和表達載體。 2、組成元件：遺傳標記 調(diào)控序列,1）遺傳標記：用于重組子的篩選和鑒定 營養(yǎng)標記基因：亮氨酸（Leu） 抗生素選擇標記基因：Zeocin,2）調(diào)控序列 ARS：酵母復(fù)制起始區(qū)(點) 酵母啟動子：常用的有: PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶） ADH1(醇脫氫酶) SUC(蔗糖酶) Apase(堿性磷酸酶) 酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性,3、類型( types) 酵母克隆載體(yeast clone vector) ：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達

12、外源基因，如YIP、YRP、YEP 酵母表達載體(yeast expression vector)：酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列，則成為分泌型載體 酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC) 克隆大片段DNA， 2M質(zhì)粒：酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀DNA，可以獨立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。,（1）酵母克隆載體的構(gòu)建,酵母整合型質(zhì)粒( yeast integrated plasmid. Yip) 細菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。 酵母復(fù)制型質(zhì)粒(Yeast replicable plasmid, YRp) 細

13、菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標記(YIp)+酵母復(fù)制序列(ARS),可自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差 酵母附加子型質(zhì)粒, YEp ：細菌質(zhì)粒DNA+酵母標記基因(YIp)+酵母2M質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復(fù)制,酵母復(fù)制序列,酵母2M質(zhì)粒,（2）酵母表達載體,特點：含酵母啟動子 穿梭載體(shuttle vector)： 既可以攜帶外源基因在原核細胞中復(fù)制，又可以使其在真核細胞中表達的載體。 種類：啤酒酵母表達載體 畢赤酵母表達載體： 分泌型表達載體 非分泌型表達,啤酒酵母表達載體,畢赤酵母表達載體-整合型,(3) 酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC)-克隆大片段D

14、NA 由下列元件組成 酵母染色體 2umDNA的復(fù)制起始區(qū) 著絲粒序列（CEN) 四膜蟲端粒DNA(TEL),YAC: 利用酵母的著絲粒區(qū)段（CEN ）、自動復(fù)制序列（ARS）及四膜蟲端粒DNA(TEL)構(gòu)建的人工染色體 結(jié)構(gòu)： 左臂：TEL、選擇標記、ARS 、CEN 右臂：TEL、選擇標記 特點：容量大（50-1000kb），穩(wěn)定性差 作用：構(gòu)建基因組文庫,二）受體細胞 1.啤酒酵母： 較早使用，了解清楚 安全性高，被FDA確認為安全生物 表達量較低 過量糖基化 轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質(zhì)粒丟失,2. 畢赤酵母：新發(fā)展的酵母受體細胞 高表達（12g/L） 高穩(wěn)定-載體為整合型 高分泌（10g/

15、L）,三）轉(zhuǎn)化,1. 原生質(zhì)體法：去除厚壁 2.電穿孔法：效率較高，整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化 3. LiCl法：做成感受態(tài)細胞,四）外源基因在酵母菌中的表達,1、胞內(nèi)表達：直接表達外源基因， 如：HBsAg的酵母重組疫苗 2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列， pGAPZ,利用因子分泌表達,五）高表達的策略 （1）利用誘導(dǎo)型強啟動子：畢赤酵母表達載體中常用啟動能力強的GAP啟動子 （2）提高整合拷貝數(shù)：可利用載體中提供的抗生素遺傳標記，以抗生素加壓篩選含有多拷貝的轉(zhuǎn)化子。 （3）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值，或在培養(yǎng)基中補加氨基酸或多肽，均可避免產(chǎn)物

16、被降解。 （4）分泌表達：也是一種避免產(chǎn)物被降解的良好策略。,酵母雙雜交系統(tǒng),Yeast Two-Hybrid System,酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到。 1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實驗。,很早就已知道，轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA

17、結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄活化蛋白上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域 (Activation Domain, AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的,這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響, 單獨存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。,基本原理 在利用GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即“誘餌”相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD

18、可以與GAL4 上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨的AD 則不能與GAL UAS 結(jié)合，只有當BD 與AD 分別表達的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BD 與AD 才能與GAL UAS 結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄。,已知蛋白X與BD-fusion -誘餌（bait） 未知蛋白Y與AD-fusion -獵物或靶蛋白（prey or target protein） 報告基因（reporter gene） -Lac Z（編碼-半乳糖苷酶）,LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on

19、 His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA),報告基因,已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域（BD）融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒,將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域(AD)融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒,將

20、這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細胞中,酵母細胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄,酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點,高敏感性。 真實性。檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。 簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細胞質(zhì)、細胞核及膜結(jié)合蛋白。,分析已知蛋白之間的相互作用 對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。 用

21、已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 在藥物設(shè)計中的應(yīng)用,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀,進行完全的翻譯后修飾 可表達產(chǎn)生有功能的膜蛋白 用途：表達大量的外源蛋白 研究基因的功能 基因治療 兩部分： 哺乳動物表達載體 受體：哺乳動物細胞,二、哺乳動物細胞表達系統(tǒng),1、主要元件 2、載體的類型 非病毒性載體 病毒性載體,一）哺乳動物細胞表達載體,(一）主要元件,1）啟動子 病毒來源的： SV40 : 綠猴空泡病毒（Simian vacu

22、olating virus-40） CMV: 巨細胞病毒（Cytomegalovirus ） RSV: 肉瘤病毒（Rous sarcoma virus） ADV: adenovirus （腺病毒） LTR: 逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列（Long terminal repeat from retrovirus） 細胞來源的： HSP：heat shock protein（熱休克蛋白）,(Promoter + ori),(PolyA),ori,2）增強子 許多來源于病毒的增強子在不同種屬細胞中都有極強的促進轉(zhuǎn)錄能力 SV40 enhancer RSV enhancer CMV enhancer LT

23、R enhancer,3）篩選標記 胸苷激酶(tk)基因 Thymidine kinase gene 二氫葉酸還原酶(dhfr)基因 Dihydrofolate reductase ,dhfr 新霉素抗性基因 neomycin resistance gene,胸苷激酶(tk)基因,tk+細胞中：胸苷(T) 胸苷一磷酸,二氫葉酸,二氫葉酸還原酶,四氫葉酸,dCTP dATP dTTP,氨基喋呤(Aminopterin),tk,阻斷,補加次黃嘌呤（Hypoxanthine）,死亡,存活,Dihydrofolate,Thymidine,（1）,（2）,（3）,HAT,二氫葉酸還原酶基因篩選法原理,攜

24、帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達二氫葉酸還原酶 以dhfr-細胞為受體 :CHO細胞 dhfr-細胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活，并表達外源基因。 若在培養(yǎng)基內(nèi)加入甲氨蝶呤，進行加壓篩選，可以提高外源基因表達量,新霉素的類似物G418對原核、真核均有毒 neo編碼的酶可使G418滅活 此種篩選方法對受體細胞無要求，應(yīng)用更簡便,新霉素抗性基因(neo),4）轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸信號 使轉(zhuǎn)錄后的mRNA 能有效進行切割和多聚腺苷酸化,多聚腺苷酸信號,5）復(fù)制元件： 使載體在受體細胞中復(fù)制， 提高外源基因的表達水平 6）原核細胞的部分序列 在原核細胞復(fù)制的復(fù)

25、制起始為點（ori) 在原核細胞復(fù)制篩選的抗生素抗性基因（AMPr）,復(fù)制元件,復(fù)制元件,1）非病毒性載體 2）病毒性載體：腺病毒，慢病毒等,2、 載體的類型,1）非病毒型 (復(fù)制子型, 質(zhì)粒型） 由真核復(fù)制信號、啟動子,轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細胞。 如： pSV系列、pCDNA3等,(二）載體的類型,2）病毒型載體 外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)制 (多需輔助病毒或包裝細胞的存在)。如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等,病毒型載體的類型,整合型 整合入宿主染色體，隨染色體復(fù)制而復(fù)制 可持續(xù)表達外援基因 安全性低：插入誘變 SV40載體、逆轉(zhuǎn)錄

26、病毒載體、慢病毒載體 游離型 不整合 生物安全性高 瞬時表達 腺病毒載體、痘苗病毒載體,1、CHO細胞（中國倉鼠卵巢癌細胞） -可大規(guī)模培養(yǎng) 2、COS細胞（猴腎細胞系）：可合成SV40復(fù)制的大T抗原，可使每個細胞中的SV40載體拷貝數(shù)多達10萬個，適合于大量表達SV40載體上的基因 3、其他動物的細胞： 如Hela細胞（人宮頸癌細胞）、HEK293細胞,二）受體細胞-哺乳動物細胞,三）基因轉(zhuǎn)移技術(shù),轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛞再|(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細胞的方法。 1. 磷酸鈣共沉淀法 2. DEAE-Dextran 3. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法： 4. 電穿孔法 5. 顯微注射法 6. 受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法 轉(zhuǎn)染：將病毒或以病毒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細胞的方法,脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,脂質(zhì)體(Liposome)介導(dǎo)：Lipid/D