1、常見分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,company logo,1，分子生物學(xué)技術(shù)在目前醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中占主導(dǎo)地位，幾乎所有基礎(chǔ)類sci文章都涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，掌握分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的理論和方法有助于讀懂基礎(chǔ)類sci文章； 2，對(duì)許多醫(yī)學(xué)研究生來說，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是他們完成實(shí)驗(yàn)研究最為常用的一種工具和達(dá)到目的的一種手段。,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要性,company logo,核酸實(shí)驗(yàn)： 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá) 蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)： 蛋白質(zhì)相互作用研究的常用方法,原核質(zhì)粒,真核質(zhì)粒,gst pull-down,免疫共沉淀,本課程主要內(nèi)容,company logo,實(shí)驗(yàn)一 重組質(zhì)粒的構(gòu)建,1，分子生物學(xué)最基本、最重要的實(shí)

2、驗(yàn)技術(shù) 2，目前重組質(zhì)粒的獲取方法,公司合成服務(wù),同行饋贈(zèng),自己構(gòu)建（低成本，可靠）,company logo,選擇載體 獲得目的基因 目的基因與載體的重組 重組載體的轉(zhuǎn)化 重組子的篩選與鑒定,重組質(zhì)粒構(gòu)建的基本過程,company logo,重組質(zhì)粒構(gòu)建的簡單流程,基因組dna,pcr產(chǎn)物, cdna (插入子),質(zhì)粒dna (載體),限制性酶切 (修飾 dna 末端),連接載體與插入片段,轉(zhuǎn)化 (將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞),鑒定重組子,company logo,質(zhì)粒載體的選擇,載體：用于攜帶重組dna，并且能夠使外源dna一起復(fù)制與表達(dá)的運(yùn)載工具?；蚬こ讨杏玫米疃嗟氖莗lasmid載體。

3、質(zhì)粒：獨(dú)立于宿主細(xì)胞（如細(xì)菌）染色體之外的可進(jìn)行復(fù)制和遺傳的遺傳單位-雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋dna分子。是一種環(huán)狀的雙鏈dna分子，大小從1k-200kb。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中所用載體為人工合成的。,company logo,人工構(gòu)建質(zhì)粒的基本元件,啟始復(fù)制子：使質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制 抗性基因：用于篩選陽性克隆。 多克隆位點(diǎn)：插入外源基因。 對(duì)于表達(dá)載體還需要啟動(dòng)子、多聚a尾等。 易于操作：包括宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。,company logo,pbr322 plasmid 是一個(gè)克隆載體，作為一個(gè)克隆載體最基本的要求都具備： 復(fù)制起點(diǎn):origin 克隆位點(diǎn):ecor i; h

4、ind iii; bamh i; sal i 篩選標(biāo)記:ampr。,company logo,克隆載體 原核生物表達(dá)載體 真核生物表達(dá)載體,質(zhì)粒載體根據(jù)用途分類,質(zhì)粒載體分類,company logo,t-vector是一種高效克隆pcr產(chǎn)物 (ta cloning) 的專用載體，由puc18載體改建而成的。在puc18載體的多克隆位點(diǎn)處的xba i 和sal i 識(shí)別位點(diǎn)之間插入了ecor v 識(shí)別位點(diǎn)，用ecor v 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3 端添加“t”而成。因大部分耐熱性dna聚合酶反應(yīng)時(shí)都有在pcr產(chǎn)物的3末端添加一個(gè)“a”的特性,所以用本制品可大大提高pcr產(chǎn)物的連接、克隆效率

5、。,克隆載體（t-載體）,company logo,t-vector 克隆pcr產(chǎn)物時(shí)用高效連接液ligation solution i 可以在極短的時(shí)間內(nèi) (30分鐘1小時(shí)) 完成連接反應(yīng)，大大地方便了實(shí)驗(yàn)操作。 用途：克隆pcr產(chǎn)物。 對(duì)克隆后的pcr產(chǎn)物使用m13 primers進(jìn)行dna測序。,company logo,t-vector pcr產(chǎn)物亞克隆載體,company logo,company logo,原核生物表達(dá)載體,原核生物表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)單元包括： 復(fù)制起點(diǎn) 克隆位點(diǎn) 篩選標(biāo)記 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄終止序列 核糖體結(jié)和位點(diǎn)：起始密碼子atg和sd序列（翻譯識(shí)別）,company

6、 logo,pet-28a,company logo,company logo,真核生物表達(dá)載體,真核生物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)單元： 復(fù)制起點(diǎn)（真核和原核） 克隆位點(diǎn) 篩選標(biāo)記(原核和真核標(biāo)記） 增強(qiáng)子/啟動(dòng)子 polya 終止信號(hào),company logo,目的基因的獲得,目的基因的獲取方法,公司合成 同行饋贈(zèng) rt-pcr,company logo,rt-pcr 實(shí)驗(yàn)原理,rt-pcr是將rna的反轉(zhuǎn)錄（rt）和cdna的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（pcr）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從rna合成 cdna，再以cdna為模板，擴(kuò)增合成目的片段。 rt-pcr可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法rt

7、-pcr中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。,company logo,company logo,操作步驟,1、rna的提?。?2、反轉(zhuǎn)錄合成cdna； 3、pcr擴(kuò)增； 4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。,company logo,rna的提取,rt-pcr中從細(xì)胞分離的rna的質(zhì)量至關(guān)重要，包括rna的純度和完整性。rna分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少rna酶的污染。但rna酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性rna酶外，環(huán)境中也存在大量rna酶。因此在提取rna時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無rna酶的環(huán)境，包括去除外源性rna酶污染和抑制內(nèi)源性rna酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（depc）去除外源性rna酶，

8、通過rna酶的阻抑蛋白rnasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性rna酶。,company logo,反轉(zhuǎn)錄合成cdna,在冰上加入：,1、混勻，42，60min; 2、95 ，5min，終止反應(yīng)。,company logo,pcr擴(kuò)增,取1支0.2ml的pcr管，在冰上加入：,company logo,pcr反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置,company logo,pcr條件的優(yōu)化,引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下2 變化尋找最佳退火溫度。 mg2濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2mm左右。 引物和模板的量等。,company logo,產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定,根據(jù)產(chǎn)物長

9、度制作適宜 濃度的瓊脂糖凝膠: 取適量pcr產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10v/cm電泳4560min。成像系統(tǒng)成像分析。,company logo,注意事項(xiàng),所提取的rna不能有降解，要達(dá)到最佳擴(kuò)增，所需的總rna的量是必需的。 taq酶、rnasin等-20保存，操作時(shí)置于冰上；dntp保存在 4度即可，勿反復(fù)凍融。 在操作過程中實(shí)驗(yàn)者必須戴消毒手套，并經(jīng)常更換，確保無rnase的污染。,company logo,在pcr過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染：使用抗氣霧劑移液管阻止氣霧劑進(jìn)入 eppendorf 管內(nèi)；為pcr樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離

10、的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套；總是使用不含有模板的陰性對(duì)照檢測污染；使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。,company logo,目的基因與載體的重組(酶切與連接),核酸酶：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。 核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來； 核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3，5磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。,company logo,限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）能特異地結(jié)合于一段

11、被稱為限制性酶識(shí)別序列的dna序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈dna。,限制性酶切的原理,company logo,限制性核酸內(nèi)切酶的類型和主要特征,company logo,識(shí)別序列,限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn),識(shí)別 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶識(shí)別 6 bp 發(fā)生的概率為 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp),高度特異性 商業(yè)化生產(chǎn) 反應(yīng)需要mg2+ 不同的內(nèi)切酶可能產(chǎn)生相同的末端,5 gaattc 3 3 cttaag 5,如 ecori 識(shí)別序列:,company logo,影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素,（1）dna 純度 （2）dn

12、a甲基化的程度 （3）酶切消化反應(yīng)溫度 （4）dna的分子結(jié)構(gòu) （5）限制性內(nèi)切酶的緩沖液,company logo,dna連接酶與dna分子的體外連接,dna連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉dna鏈上缺口酶，借助atp或nad水解提供的能量催化dna鏈的5-po4與另一dna鏈的3-oh生成磷酸二酯鍵。 常用的dna連接酶有兩種： 來自大腸桿菌的dna連接酶 來自噬菌體的t4dna連接酶。 二者的作用機(jī)理類似,company logo,t4連接酶作用分三步： （1）t4dna連接酶與輔助因子atp形成酶amp復(fù)合物。 （2） 酶amp復(fù)合物結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口

13、的dna上，使dna腺苷化。 （3） 產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。 t4dna連接酶可連接dna- dna，dna-rna，rna-rna和雙鏈dna粘性末端或平頭末端。,company logo,a atp 濃度 b 連接酶濃度 c 反應(yīng)時(shí)間 d insert和vector的比值（載體dna和外源dna的分子數(shù)比（濃度比）為1：31：10） e 連接溫度 其中連接溫度是影響連接效率的最重要的因素。,影響連接效率的因素,company logo,感受態(tài)細(xì)胞 (competent cells): 經(jīng)過 cacl溶液處理的e. coli 細(xì)胞對(duì)外源dna的吸收變得非常敏感，其細(xì)胞內(nèi)的酶限

14、制-修飾系統(tǒng)被抑制，有利于外源基因的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和繁殖，這種細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞. 轉(zhuǎn)化 (transformation): 感受態(tài)細(xì)胞吸收外源dna的過程. 熱激 (heat-shock): 將 dna 與宿主細(xì)胞混合后，將宿主細(xì)胞放入42c 的溫水中保溫 1.5 分鐘以增加轉(zhuǎn)化效率的過程.,重組載體的轉(zhuǎn)化,company logo,重組子的篩選與鑒定,外源dna,載體dna,重組分子,原核細(xì)胞,真核細(xì)胞,擴(kuò)增或表達(dá),表達(dá),連接,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)染,受體細(xì)胞,company logo,在dna體外重組實(shí)驗(yàn)中，外源dna片段與載體dna的連接反應(yīng)物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，再加上重組率和轉(zhuǎn)化率的不理想，

15、因此必須通過篩選和鑒定來區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子。 轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 非轉(zhuǎn)化子：為接納載體或重組分子的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 重組子：含有重組dna分子的轉(zhuǎn)化子。 非重組子：僅含有空載載體分子的轉(zhuǎn)化子。,company logo,轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定方法,基于載體遺傳標(biāo)記的篩選與鑒定 利用載體dna分子上所攜帶的選擇性遺傳標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子或重組子 基于克隆片段序列的篩選與鑒定 由于基于載體遺傳的篩選與鑒定程序不能區(qū)分期望重組子與非期望重組子。在大多數(shù)情況下，待克隆的目的基因或dna片段的序列至少部分是已知的，因此根據(jù)克隆片段序列設(shè)計(jì)的篩選與鑒定程序具有廣泛的實(shí)

16、用性 基于外源基因表達(dá)產(chǎn)物的篩選與鑒定 如果克隆在受體細(xì)胞中的外源基因編碼產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，則可通過檢測這種蛋白質(zhì)的生物功能或結(jié)構(gòu)來篩選和鑒定期望重組子,company logo,基于載體遺傳標(biāo)記的篩選與鑒定,抗藥性篩選法,營養(yǎng)缺陷性篩選法,顯色模板篩選法,噬菌斑篩選法,company logo,可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子。,非重組子：apr、tcr,重組子：aps、tcs,抗藥性篩選法,將外源dna片段插入bamh i、sal i位點(diǎn),company logo,基本操作,company logo,company logo,營養(yǎng)缺陷性篩選法,基本原理,營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與

17、非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子 。,company logo,lys,lys+,lys,lys+,基本原理圖示,company logo,用于大腸桿菌的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型,company logo,基于克隆片段序列的篩選與鑒定,pcr鑒定法,菌落原位雜交法,限制性酶切圖譜法,亞克隆法,dna序列測定法,company l

18、ogo,pcr鑒定法,pcr技術(shù)的兩大主要用途為目的基因的獲得和dna特定序列的檢測。根據(jù)引物互補(bǔ)區(qū)域的不同，pcr技術(shù)即可用于區(qū)分重組子與非重組子，也能鑒定期望重組子與非期望重組子，甚至還能探測目的基因或dna片段是否整合在受體細(xì)胞的基因組上。上述pcr鑒定程序一般需要將篩選平板上的單菌落分別挑出進(jìn)一步培養(yǎng)，因此不太適用于成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)化子的鑒定。,company logo,原理: pcr能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期dna片斷。,pcr鑒定法,過程:（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或dna）。 （2）用外源dna插入片斷作pcr引物。 （3）電泳pcr產(chǎn)物。 （4）檢查是否有pcr產(chǎn)物。 （5）pcr

19、產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。,company logo,company logo,dna序列測定法,dna序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國際上流行采用sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定dna序列，其工作原理是在dna聚合反應(yīng)的進(jìn)程中，通過位點(diǎn)特異性終止測定。,company logo,實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)相互作用研究方法,protein-protein interactions- a common theme in cell biology 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的普遍主題,兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，發(fā)生相互作用。,company logo,

20、interaction domain - structural basis for protein interaction 相互作用區(qū)域是蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用和識(shí)別在諸如生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程起著重要的作用。,company logo,western blot,western免疫印跡（western blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。 western blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過page分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜或pvd

21、f膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。,company logo,western blot 特點(diǎn),蛋白質(zhì)的western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。,company logo,western blot 應(yīng)用,目的蛋白的表達(dá)特性分析 目的蛋白與其它蛋白的互作 目的蛋白的組織定位

22、目的蛋白的表達(dá)量分析,company logo,western blot 流程,company logo,電泳,常用sds-page：單一亞基組成的蛋白質(zhì) 非變性page：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì) tris-tricine膠中電泳：用于分子量小于10kda的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果 聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套,company logo,轉(zhuǎn)膜,戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 以適量的轉(zhuǎn)移buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜1530min，如果是pvdf膜，必須先用甲醇激活后浸泡。 方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極

23、 排去濾紙、膠和膜間的氣泡。 電轉(zhuǎn)時(shí)間：100v 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率 膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置,company logo,濕轉(zhuǎn)系統(tǒng),company logo,半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng),company logo,封閉,用5脫脂奶粉或3bsa （含0.1tween20 tbs或pbs配制） 時(shí)間：室溫2h或4c過夜,company logo,一抗、二抗孵育,把nc膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4過夜。 回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3次，每

24、次10min。 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4過夜。 回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3次，每次10min。 最后用tbs漂洗膜2次，每次10min。,company logo,顯色 辣根過氧化物酶：底物為dab 堿性磷酸酶：底物為bcip/nbt 化學(xué)發(fā)光顯影 最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品） 注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含tween20的tbs或pbs洗滌一次 曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定,二抗與底物反應(yīng)顯色,company logo,流程圖,company logo,western blot常見問題分析,company

25、 logo,sds-page電泳,膠不平？ 凝膠漏液？,膠板洗刷干凈 加入ap和temed的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對(duì)齊,company logo,條帶比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”條帶？,凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 樣品鹽濃度過高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適,sds-page電泳,company logo,轉(zhuǎn)膜及抗體檢測,凝膠腫脹或卷曲？

26、 條帶歪斜或漂移？ 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？,可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min 電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫,company logo,轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少,company logo,背景太高,company logo,雜交信號(hào)很弱,company logo,出現(xiàn)非特異帶,company logo,gst融合蛋白進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn),原理 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（gst）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將gs

27、t融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀gst融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用gst沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。,company logo,方法： 1） gst融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cdna表達(dá)得到的未知蛋白） 2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4c 2h 3）離心棄上清 4）沉淀加入2 蛋白loading buffer煮沸，離心 5）取上清進(jìn)行sds-page電泳， 6）考

28、馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做western blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：該實(shí)驗(yàn)設(shè)立gst對(duì)照，反應(yīng)均在4c進(jìn)行,gst-pulldown assay,company logo,company logo,原理： 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的結(jié)合蛋白。 優(yōu)點(diǎn)：生理?xiàng)l件下的結(jié)合 缺點(diǎn)：可能檢測不到低親和力和瞬間的

29、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用,免疫共沉淀,company logo,1）細(xì)胞裂解 采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（np40或triton x-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2sds)，細(xì)胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。 2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。 3) 對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。,注意事項(xiàng),company logo,實(shí)驗(yàn)基本流程,1.提取蛋白 2.在細(xì)胞裂解液中加入抗x的抗體 3.孵育后再加入protein a或g(于agarose bead上)若細(xì)胞中有

30、與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復(fù)合物：“yx抗x抗體protein a或g 4.經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。（xy抗原、x抗體）,company logo,co-ip特征,優(yōu)點(diǎn) 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài) 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物,company logo,co-ip特征,局限性 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用； 必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。,company logo,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,sds-page western blotting分析 質(zhì)譜分析檢測目的蛋白,company logo,實(shí)