1、生化藥物常用分析方法,北京市藥品檢驗所生化生檢室 高春,1.生化藥物概念 2.生化藥物的分類 3.蛋白質(zhì)的含量測定 4.電泳法 5. 酶的測定,1生化藥物的概念,生化藥物是運(yùn)用生物化學(xué)的研究成果，把生物體產(chǎn)生的各種基本物質(zhì)用于預(yù)防、診斷和治療疾病的一大類藥物。包括從動物、植物、微生物等生物體中提取分離的天然物質(zhì)及部分化學(xué)合成產(chǎn)物。通常所說的生化藥物是專指在生物體內(nèi)起重要生理作用的生命基本物質(zhì)。如：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其降解物、酶與輔酶、維生素、激素、糖與脂類等一大類藥物。,2. 生化藥物的分類,(1) 按其來源分：生化藥物按其來源不同可分為植物生化藥物、動物生化藥物、微生物生化藥物及合

2、成生化藥物。 (2) 按其化學(xué)性質(zhì)及作用分：可分為氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其降解物、酶與輔酶、激素、維生素、糖、脂、有機(jī)酸等。,3. 蛋白質(zhì)的含量測定,3.1 氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng) 3.2 凱氏定氮法 3.3 福林-酚試劑法 3.4 雙縮脲法 3.5 紫外吸收法,3.1氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng) 3.1.1 茚三酮反應(yīng) 3.1.2 雙縮脲反應(yīng) 3.1.3 與酚試劑的反應(yīng),3.1.1 茚三酮反應(yīng)：蛋白質(zhì)在pH57之間，與茚三酮丙酮溶液加熱煮沸時即出現(xiàn)藍(lán)紫色。此反應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定性與定量。此反應(yīng)的靈敏度為1g。凡具有氨基、能放出氨的化和物幾乎都有此反應(yīng)，故可用于多肽與蛋白質(zhì)及氨基酸的定性與定

3、量分析。,3.1.2 雙縮脲反應(yīng) ： 蛋白質(zhì)溶液加入氫氧化鈉溶液后，逐滴加入0.5%硫酸銅溶液，則出現(xiàn)紫色或紫紅色。 原理 當(dāng)脲（尿素）加熱（約180），兩分子脲縮合，放出一分子氨而形成雙縮脲，然后在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色化合物。蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽分子中，含有多個與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也有雙縮脲反應(yīng)。肽鍵越多反應(yīng)顏色越深。氨基酸無此反應(yīng)。,3.1.3 與酚試劑的反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸 能與含有磷鎢酸磷鉬酸化合物的酚試劑起反應(yīng)。在堿性條件下后者被還原成藍(lán)色物質(zhì)。顏色的深淺與蛋白質(zhì)的量成正比，所以可作為蛋白質(zhì)的比色測定方法。,3.2凱氏定氮法 3.2.1 原理

4、 3.2.2 試劑和儀器 3.2.3 操作步驟 3.2.4 注意事項,3.2凱氏定氮法 3.2.1 原理 每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量一般為1517.6%，平均為16，因此只要測得樣品中的含氮量，就可以通過計算求得樣品的蛋白質(zhì)含量。 定氮法的基本原理是將蛋白質(zhì)用濃硫酸分解，并使其中的氮變成銨鹽狀態(tài)，再與濃堿作用，放出的氨被酸吸收，滴定剩余的酸，計算出含氮量。微量凱氏定氮法最低可測出0.05毫克氮，相當(dāng)于0.3毫克左右蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含氮量100/16 蛋白質(zhì)含氮量6.25,3.2.2. 試劑和儀器 1微量定氮儀器裝置全套：包括蒸汽發(fā)生器、冷凝蒸汽收集器、微量定氮蒸餾瓶、小型冷凝管。

5、 2消化爐（電爐） 3濃硫酸 4. 氫氧化鈉溶液（40%） 5消化劑：硫酸銅及硫酸鉀按1:4（w/w）至1：5比例，研細(xì)充分混勻。 6標(biāo)準(zhǔn)0.010N鹽酸和0.010N氫氧化鈉溶液。 7指示劑0.1%甲基紅乙醇溶液。 82硼酸吸收液,3.2.3 凱氏定氮法一般步驟,消化,蒸餾,滴定,返回,3.2.4.注意事項 1必須仔細(xì)檢查凱氏定氮儀的各個連接處，保證不漏氣。 2消化初期瓶內(nèi)物質(zhì)碳化變黑，并產(chǎn)生泡沫，要特別注意控制火力，微火加熱，不能讓黑色物質(zhì)上升到頸部，否則將嚴(yán)重影響樣品的測定結(jié)果。當(dāng)混合液停止冒泡，氣體逸出也較均勻時，可適當(dāng)加大火焰，使瓶內(nèi)液體微沸而不致跳蕩。硫酸溶液逐步從棕黑色變成澄清。

6、由于消化液澄清并不說明消化一定完成，為保證反應(yīng)充分完成，繼續(xù)沸騰1小時。反應(yīng)終了，溶液應(yīng)呈淡藍(lán)色或無色透明，若帶有黃色表示消化末完全。如果蛋白質(zhì)樣品中含賴氨酸或組氨酸較多，則消化時間要延長1-2倍。,3消化完畢，靜置使冷，仔細(xì)加入少量蒸餾水，洗滌管壁。因?qū)嶒炇抑锌諝馔袠O微量的氨，每次分析時都要另做空白對照，即一切處理與樣品管相同，但不加蛋白質(zhì)樣品。 4蒸餾前要先蒸洗15分鐘以上。 5小心加樣，避免樣品污染凱氏瓶口部和頸部。,6使用凱氏定氮儀時，開關(guān)甲、乙的掌握與實(shí)驗成敗很有關(guān)系，在加樣時，開關(guān)甲一定要開啟著，而且一定要使蒸汽發(fā)生后才能關(guān)閉，否則會發(fā)生樣品倒吸現(xiàn)象。開關(guān)乙也要關(guān)閉及時，防止

7、氨逸出。 7蒸餾時，保持火力穩(wěn)定，否則易發(fā)生倒吸現(xiàn)象。,8氨氣蒸餾時，為了使所有硫酸銨分解為氨，必須加入足量40%氫氧化鈉，加入時要水平緩慢，以免產(chǎn)生劇烈反應(yīng)而導(dǎo)致瓶內(nèi)酸液倒吸和氨的損失，堿加入后，有銅氨離子、氫氧化銅或氧化銅等化合物生成，溶液呈藍(lán)色或褐色。并有膠狀沉淀產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，反之，如果不變，說明堿液可能不夠。,9如果測定的不是純蛋白質(zhì)，可能含有非蛋白氮，必須分別測定蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮的測定可以將樣品制成均漿或抽提液，用三氯醋酸或鎢酸等沉淀劑將蛋白質(zhì)沉淀出來，按總氮法測定上清液的含氮量，便得到非蛋白質(zhì)氮。,3.3 福林-酚試劑法 3.3.1 原理 3.3.2 試劑 3.3.

8、3 操作步驟 3.3.4 注意事項,3.3 福林-酚試劑法 3.3.1.原理： 福林-酚試劑法是測定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法。 福林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)銅復(fù)合物；第二步是蛋白質(zhì)銅復(fù)合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。,本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，靈敏度高。缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)特異性的影響，即不同蛋白質(zhì)的顯色強(qiáng)度稍有不同；標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式。 本法的可測定范圍是每毫升25-250微克蛋白質(zhì)。,3.3.2.試劑 試劑A：（1）4碳酸鈉溶液；（2）0

9、.2mol/L氫氧化鈉溶液；（3）1硫酸銅溶液（4）2酒石酸鉀鈉溶液（或其鉀鹽或鈉鹽）。臨用前將（1）與（2）等體積混合，（3）與（4）等體積混合，然后這兩種試劑按50：1的比例混合，即成福林酚試劑A。,試劑B：在1.5升容積的磨口流瓶中加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸充分混和，接上回流冷凝管小火流10小時?；亓鹘Y(jié)束后，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色，（如仍呈綠色，左須再重復(fù)滴加液體溴 的步驟）稀至1升，過濾，過濾置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，以

10、酚酞為指示劑，然后適當(dāng)稀釋（約加水1倍）使最終的酸濃度為1mol/L。,3.3.3 操作步驟 （1）1ml待測樣品溶液（適當(dāng)稀至約含25-250微克蛋白質(zhì)），加5ml試劑A混合，室溫下放置10分鐘后加0.5ml試劑B，立即混和均勻，30分鐘后，以不含蛋白質(zhì)試劑空白對照比色。可選用波長650nm或660nm。,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備： 在各試管中分別加牛血清白蛋白溶液（250微克/毫升）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0毫升，并分別加蒸餾水補(bǔ)充到1毫升（即各管中分別含蛋白質(zhì)量0、50、100、150、200和250微克）。以后加試劑及比色等操作步驟與樣品操作相同。,3.3.4.注意事項 (1

11、)牛血清白蛋白的含量明確。 (2)福林酚試劑B在酸性條件下比較穩(wěn)定，而福林酚試劑A在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅蛋白質(zhì)溶液。所以加入福林酚試劑B這一步混和速度要快，使還原反應(yīng)產(chǎn)生在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前，否則會使顯色程度減弱 。 (3)反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度嚴(yán)格控制。 (4)按照化學(xué)實(shí)驗的要求精密操作。,3.4 雙縮脲法 3.4.1 原理 3.4.2 試劑 3.4.3 操作步驟 3.4.4 注意事項,3.4.雙縮脲法 3.4.1原理 雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一分子氨后所得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有

12、兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或通過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。,雙縮脲法是測定蛋白質(zhì)濃度常用方法之一，它除了操作簡便、迅速外，最大的優(yōu)點(diǎn)是受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，但靈敏度差，所需樣品量大。利用銅復(fù)合物有紫外吸收的特性，使雙縮脲方法能在數(shù)十微克水平進(jìn)行測定。,3.4.2試劑 堿性銅試劑 0.175克硫酸銅溶解于約15毫升水中，置于一100毫升容量瓶中，加入30毫升濃氨水，30毫升冷的蒸餾水及20毫升飽和氫氧化鈉溶液，混勻后，放置至使溶液溫度與室溫相同，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。此試劑在室溫下可以放置3-4個月不影響顯色。,3.4.3操作步驟 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 每組

13、取7支試管，依次加入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分別補(bǔ)足蒸餾水至3毫升，混勻后各管加2毫升堿性銅試劑，充分混和后，呈現(xiàn)紫色，立即于540nm下測定光吸收（以第一管作空白對照）。 (2)供試品測定 取3毫升樣品溶液，加入堿性銅試劑2毫升，充分混勻后，于540nm下測定吸收值，操作條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線。,3.4.4.注意事項 樣品溶液與試劑混合后，有時約30分鐘后有霧狀沉淀 產(chǎn)生。這種現(xiàn)象對含脂肪類物質(zhì)的蛋白質(zhì)抽提液較易發(fā)生，而對于純蛋白質(zhì)溶液不明顯?？朔姆椒ㄓ腥N：（1）加入試劑后立即比色，至少應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成；（2）如沉淀已經(jīng)產(chǎn)生，則可以放置二小時或更多

14、時間，離心去沉淀后取上清液比色；（3）加1.5毫升乙醇或石油醚，離心后比色。,3.5 紫外吸收法 原理 蛋白質(zhì)分子中所含有的酪氨酸和色氨酸殘基使蛋白質(zhì)在280nm下具有最大吸收值；蛋白質(zhì)溶液在238nm下的光吸收值，其吸收強(qiáng)度與肽鍵量成正比。利用在一定波長范圍內(nèi)吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。,4.電泳分析法 4.1 電泳的基本概念 4.2 電泳的分類 4.3 醋酸纖維膜電泳法 4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,4.1 電泳的基本概念 電泳：帶電顆粒在電場作用下向著與其電 性相反的電極移動，稱為電泳。,4.2. 電泳的分類 按分離原理分類可分為區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電

15、泳和聚焦電泳4種。 （1） 區(qū)帶電泳 電泳過程中，不同的離子成分在均一的緩沖液體系中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。 （2） 移界電泳 是在U形管中進(jìn)行的，由于分離效果較差，已為其他電泳技術(shù)所取代。,（3 ） 等速電泳 需專用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相隨分成清晰的界面，并以等速移動。 （4 ）等電聚焦電泳 由于具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)載體在電場中，自動形成pH梯度，使被分離物移動至各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶，且分辨率較高。從表面上看與區(qū)帶電泳相似，但原理不同。,4.3.醋酸纖維膜電泳法 4.3.1 基本概念 什么是醋酸纖維膜電泳 以醋酸纖維膜為支持介質(zhì)的一種區(qū)

16、帶電泳技術(shù)。 4.3.2 原理 蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，具有兩性游離特性。人血白蛋白為一種蛋白質(zhì)，因而其具有兩性化合物的性質(zhì)，在堿性緩沖液中，即pH質(zhì)大于等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極遷移，如果人血白蛋白中含有其他雜蛋白，其帶電荷的量會不同于人血白蛋白，在電場中遷移的速度就不同，帶負(fù)電荷越多的蛋白質(zhì)其遷移速度越快。這樣就會在醋酸纖維薄膜留下不同的區(qū)帶，經(jīng)染色后，脫色，掃描后，即可測得人血白蛋白的純度。,4.3.3 特點(diǎn)：微量，快速，簡便，分辨力高，對樣品無拖尾及吸附現(xiàn)象等。目前，國內(nèi)有醋酸纖維薄膜商品出售，不同廠家生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜主要在乙酰化、厚度、孔徑、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等方面有所不同，但分

17、離效果基本一致，一般多采用浙江黃巖化工廠生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜。,4.3.4 酸纖維薄膜與濾紙比較 酸纖維薄膜與濾紙比較有以下優(yōu)點(diǎn) （1） 酸纖維薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸收極少，無“拖尾”現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了定量的精確性。 （2） 快速省時, 由于醋酸纖維薄膜親水性較濾紙小，薄膜中所容納的緩沖液也較小，電滲作用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快，電泳時間短，一般電泳45-60分鐘即可，加上染色，脫色，整個電泳完成僅需90分鐘左右。,（3） 靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2l血清，甚至加樣體積少至0.1l，臨床醫(yī)學(xué)檢驗利用這一特點(diǎn)，檢測在

18、病理情況下微量異常蛋白的改變。 （4）應(yīng)用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如，胎兒甲種球蛋白，溶菌酶，胰島素，組蛋白等用醋酸纖維薄膜電泳能較好地分離。 （5） 醋酸纖維薄膜電泳染色后，經(jīng)冰醋酸，乙醇混合或其他溶液浸泡后制成干板，有利于掃描定量及長期保存。,由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡單，快速，價廉。目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白，脂蛋白，糖蛋白，胎兒甲種球蛋白，體液，脊髓液，脫氫酶，多肽，核酸及其他生物大分子，為心血管疾病，肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗的常規(guī)技術(shù)。,4.3.5 酸纖維薄膜電泳操作步驟,儀器與薄膜的準(zhǔn)備,點(diǎn)樣,電泳,染色與漂洗,透明,返回,4

19、.3.6 注意事項 1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理 2、緩沖液的選擇 3、加樣量 4、電量的選擇 5、染色液的選擇 6、透明及保存,4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 4.4.1原理 以紙，醋酸纖維素薄膜，瓊脂（糖）及均一聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷，分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除凈電荷對遷移率的影響，可采用聚丙烯酰胺濃度剃度電泳，利用它所形成孔徑不同引起的分子篩效應(yīng)，可將蛋白質(zhì)分子分開。也可在整個電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（SDS），則電泳遷移率主要依賴于分子量，而與所帶凈電荷和形狀無關(guān)。這種電泳方法為SDS-PAGE。,4.4.2用SDS-PAGE測定

20、蛋白質(zhì)分子量的原理 SDS是陰離子去污劑，它在水溶液中，以單體和分子團(tuán)混合物的形式存在，蛋白質(zhì)在巰基乙醇作用下，還原成單鏈，再進(jìn)一步與SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所,帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開。測定未知蛋白質(zhì)分子量時，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，同時進(jìn)行SDS-PAGE，則可根據(jù)已知蛋白質(zhì)的電泳遷移率和分子量的對數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得分子量。,優(yōu)點(diǎn) 用此法測定蛋白質(zhì)分子量具有

21、儀器設(shè)備簡單，操作方便，樣品用量少，耗時少（僅需一天），分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì)分子量的測定，還可用于蛋白 混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序，酶解圖譜及抗還原性質(zhì)等方面的研究。,缺點(diǎn) 在蛋白質(zhì)所帶電荷異?；驑?gòu)象異常時，帶有較大輔基的蛋白（如糖蛋白）及一些結(jié)構(gòu)蛋白等測出的分子量不太可靠。如組蛋白F1，本身帶有大量的正電荷，雖然結(jié)合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原由正電荷，故用SDS-PAGE測得的分子量為35000，而用其他方法測定的分子量為210

22、00。因此要確定某種蛋白質(zhì)的分子量時，最好用2種測定方法相互驗證，則更可靠。尤其是對一些由亞基或2條以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)，由于,SDS巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開，解理成亞基或單個肽鏈，因此測定結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量，還需用其他方法測定其分子量中肽鏈的數(shù)目。,4.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟,安裝夾心式垂直板電泳槽,配膠及凝膠板的制備,分離膠和濃縮膠的制備,樣品的處理與加樣,電泳,返回,4.4.4 注意事項 1. SDS的純度 2. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合量 3. 凝膠濃度 4. 對樣品的要求 5. 凝膠成像,5.酶的測定,5.1 酶的概念： 5.2 酶的特點(diǎn)： 5

23、.3 酶的專一性： 5.4 酶的分類與命名 5.5 酶的化學(xué)組成 5.6 酶促反應(yīng)的影響因素 5.7 酶活力的測定方法,5.1 酶的概念 酶是生物體內(nèi)一類具有催化活性和特定空間構(gòu)象的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。,5.2 酶的特點(diǎn) 5.2.1 酶作用一般都要求比較溫和的條件，如常溫，常壓，接近中性的酸堿度等。 5.2.2 酶的催化效應(yīng)非常高酶促反應(yīng)比相應(yīng)的非酶促反應(yīng)要快1031017倍。 5.2.3 酶具有高度的專一性酶對所作用的物質(zhì)（稱為底物）有嚴(yán)格的選擇性，,通常一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)，這也說明酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有高度嚴(yán)格要求。 5.2.4 酶的催化活性是受到調(diào)節(jié)和控制

24、的。他的調(diào)控方式很多，包括反饋調(diào)節(jié)、抑制劑調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。 5.2.5 酶可催化某些特異的化學(xué)反應(yīng)，體內(nèi)某些物質(zhì)的合成只能由酶促反應(yīng)完成。如某些蛋白質(zhì)、多肽、核酸以及其他一些生物活性物質(zhì)的合成都要通過酶促反應(yīng)進(jìn)行。,5.3 酶作用的專一性 一種酶只作用于一類化合物或一定的化學(xué)鍵，以促進(jìn)一定的化學(xué)變化，生成一定的產(chǎn)物。受酶催化的化合物稱為該酶的底物或作用物。酶對底物的專一性通常分為以下幾種。 5.3.1立體化學(xué)專一性 是從底物的立體化學(xué)性質(zhì)來考慮的一種專一性?？煞譃閮深悾?）立體異構(gòu)專一性（2）幾何異構(gòu)專一性。,5.3.2非立體異構(gòu)專一性 如果一種酶不具有立體化學(xué)專一性

25、，則可從底物的化學(xué)鍵及組成該鍵的基團(tuán)來考慮其專一性。如以A-B為底物，可認(rèn)為它是由三部分組成，即A、B與連接它們的鍵。非立體化學(xué)專一性可依據(jù)酶對這三種組成部分選擇程度的不同分為三類（1）鍵專一性 （2）基團(tuán)專一性 （3）絕對專一性 。,5.4 酶的分類與命名 5.4.1 酶的分類 依據(jù)國際酶學(xué)委員會的規(guī)定，按催化反應(yīng)的類型可分為六大類。 （1）氧化還原酶類 催化氧化還原反應(yīng)。 （2）轉(zhuǎn)移酶類 催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。 （3）水解酶類 催化水解的反應(yīng) （4）裂合酶類 催化水、氨或二氧化碳的去除或加入。 （5）異構(gòu)酶類 催化各種類型的異構(gòu)作用。 （6）合成酶類 催化消耗ATP的成鍵反應(yīng),5.5 酶的化

26、學(xué)組成 酶和其他蛋白質(zhì)一樣，根據(jù)其組成成分可分為簡單蛋白酶和結(jié)合蛋白酶兩種。 單純酶 酶的活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如水解酶類（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶及尿酶等），這些酶的結(jié)構(gòu)由簡單蛋白質(zhì)構(gòu)成，故稱為單純酶。,結(jié)合酶 其結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子外，還含有非蛋白質(zhì)部分，如大多數(shù)氧化還原酶類，這些酶由結(jié)合蛋白質(zhì)構(gòu)成，因而稱為結(jié)合酶。在結(jié)合酶中，蛋白質(zhì)部分稱為酶蛋白，非蛋白質(zhì)部分統(tǒng)稱為輔因子。輔因子又可分成輔酶和輔基兩類。酶蛋白與輔因子結(jié)合成的完整分子成為全酶，即全酶=酶蛋白+輔因子（輔酶或輔基）。只有全酶才有催化活性，將酶蛋白與輔因子分開后均無催化作用。,根據(jù)蛋白的特點(diǎn)和分子大小又把酶分成三類

27、 （1） 單體酶 只有一條多肽鏈 （2） 寡聚酶 由幾條至幾十條多肽鏈亞基組成。 （3） 多酶體系 是由幾種酶彼此嵌合形成的復(fù)合體。他有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。,5.6 酶促反應(yīng)的影響因素 5.6.1 底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響 5.6.2 pH的影響與最適pH 5.6.3 溫度的影響與最適溫度 5.6.4 酶濃度的影響 5.6.5 激活劑的影響 5.6.6 抑制劑的影響 5.6.7 酶活力的測定方法,5.6.1 底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響 酶促反應(yīng)中，酶先與底物形成中間復(fù)合物，再轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，并重新釋放出游離的酶。在酶濃度恒定的條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛群苄r，酶未被底物飽和，這時反應(yīng)速度取決于底物

28、的濃度，底物濃度越大，單位時間內(nèi)ES生成的越多，而反應(yīng)速度取決于ES的濃度，故反應(yīng)速度也隨之增高。當(dāng)?shù)孜餄舛燃哟蠛?，酶逐漸被底物所飽和，反應(yīng)速度的增加和底物的濃度就不成正比，續(xù)而底物增加至極大值，所有酶分子均被底物飽和，所有的E均轉(zhuǎn)變成ES，此時的反應(yīng)速度不會進(jìn)一步增高。,5.6.2 pH的影響與最適pH 大多數(shù)酶的活性受pH影響較大。在一定pH下酶表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，活力均降低。酶表現(xiàn)最大活力時的pH稱為酶的最適pH。PH對酶反應(yīng)速度的影響，主要有下列原因 （1） 影響酶和底物的解離 酶的活性基團(tuán)的解離受pH的影響，有的酶必須處于解離狀態(tài)方能很好的與底物結(jié)合，在這種情況下，酶和底

29、物解離最大的pH有利于酶促反應(yīng)的加速。 (2） 影響酶分子的構(gòu)象 過高過低的pH會改變酶的活性中心的構(gòu)象，甚至?xí)淖冋麄€酶分子的結(jié)構(gòu)使其變性。,5.6.3 溫度的影響與最適溫度 化學(xué)反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但酶是蛋白質(zhì)，可隨溫度的升高而變性。 5.6.4 酶濃度的影響 在一定條件下，酶的濃度與反應(yīng)初速度成正比。因為酶催化反應(yīng)時，酶先要與底物形成中間物，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶濃度時，反應(yīng)達(dá)到最大速度，這時增加酶濃度可增加反應(yīng)速度，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系。這也是酶活力測定常用的方法。,5.7 酶活力的測定方法 酶的定量一般指測定酶的活力，由于酶不易提純，一些酶制劑中常含有很多雜質(zhì)，所以酶含量

30、不能象化學(xué)藥品用重量表示，而是用單位時間內(nèi)催化某一特定反應(yīng)的能力，即酶促反應(yīng)速度大小，間接測得酶活力。一般用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在實(shí)際測定過程中底物均過量，少量底物的減少難以準(zhǔn)確測定，而產(chǎn)物從無到有，測定起來比較容易，所以中國藥典上收載的品種大部分采用測定產(chǎn)物的方法。 酶活力的測定的三要素:溫度;pH;時間,5.8 酶活力測定舉例 胰蛋白酶的效價測定 5.8.1 原理：胰蛋白酶可以催化酪蛋白水解產(chǎn)生不被三氯醋酸所沉淀的肽及氨基酸、色氨酸和苯丙氨酸，在275nm處有較強(qiáng)的吸收，以酪氨酸為對照品進(jìn)行定量測定，即：每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生成三氯醋酸不沉淀物（肽及氨基酸）275nm

31、波長處與1umol酪氨酸相當(dāng)?shù)拿噶?，?個活力單位。 試液：,5.8.2 操作步驟 1 對照品溶液的制備： 2 供試品原液的制備： 3 供試品溶液的制備： 4 空白溶液的制備： 5 在275nm處測定吸收值。,5.8.3 注意事項： 1. 供試品原液的制備中氯化鈣溶液的溫度一定要控制在5以下，防止胰蛋白酶的降解。 2研磨一定要快速、均勻。 3. 溫度恒定，采用恒溫水浴，要求溫度恒定在正負(fù)0.1以內(nèi)（對恒溫水浴箱的要求較高）。 4時間準(zhǔn)確，要求用秒表計時。 5反應(yīng)過程中及反應(yīng)完成，在全程中要嚴(yán)格控制溶液的pH，不得任意增加底物溶液、終止劑的量，避免改變?nèi)芤旱膒H，因為底物溶液和終止劑，已經(jīng)是過量

32、的。三氯醋酸易吸濕，但不要因此而多稱三氯醋酸的固體，提高其濃度，否則會造成測定結(jié)果偏低。,小結(jié),1.生化藥物概念 2.生化藥物的分類 3.蛋白質(zhì)的含量測定 4.電泳法 5. 酶的測定,前3節(jié)簡單介紹了有關(guān)生化藥物的常識，什么是生化藥物，生化藥物的分類等。 重點(diǎn)介紹了蛋白質(zhì)的含量測定方法。 主要有：（1）凱氏定氮法：應(yīng)用每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量一般為1517.6%，平均為16，只要測得樣品中的含氮量，就可以通過計算求得樣品的蛋白質(zhì)含量。,（2）福林-酚試劑法：也是測定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法。福林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)銅復(fù)合物；第二步是蛋白質(zhì)銅復(fù)合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，靈敏度高。缺點(diǎn)本方法只與蛋白質(zhì)中個別的氨基酸反應(yīng)而受蛋白質(zhì)中氨基酸組成的特異影響，即不同蛋白質(zhì)所含酪氨酸和色氨酸量的不同而顯色強(qiáng)度有所差異，這就要求作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)其顯色氨基酸的量應(yīng)與樣品接近，減少誤差。,（3）雙縮脲法：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩分子脲經(jīng)18