1、生物工程下游技術(shù),第二章 細胞分離與破碎 3 學(xué)時,學(xué)習(xí)目的和要求,掌握解細胞分離和目標產(chǎn)物的釋放的原理和方法，熟知各種方法的優(yōu)缺點和應(yīng)用范圍。,目錄,一、細胞分離 （一）、重力沉降 （二）、離心沉降 （三）、過濾 二、細胞破碎與胞內(nèi)物釋放,細胞分離學(xué)習(xí)要點,識記：重力沉降、離心沉降和過濾的概念。 理解：重力沉降、離心分離與過濾原理、理論；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式 。 應(yīng)用：常用離心方法及優(yōu)缺點；利用掌握的提高分離效率的方法分析決實際問題,（一）、重力沉淀,1、重力沉淀的定義 2、重力沉淀的理論 3、提高重力沉降的途徑,1、重力沉降定義,重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有固體顆粒

2、的流體中將顆粒分離出來的操作。 重力沉降是利用流體與顆粒間的密度差，在重力的作用下使顆粒與流體之間產(chǎn)生相對運動，從而實現(xiàn)兩者的分離。 在生物分離過程中，定義中顆粒為細胞、細胞碎片等有形物,千姿百態(tài)的微生物世界,Bacterial morphology diagram,High-density cell culture,2、重力沉降理論,理論假設(shè) 細胞或細胞碎片按照球形顆粒處理； 顆粒在無限稀釋的溶液中進行沉降，顆粒之間無相互干擾 受力分析 球形顆粒重力fg 液體的浮力fb 顆粒運動方向相反的阻力 fs,F,b,F,g,Fs,d=2R,球形顆粒沉降的受力情況,重力沉降理論,重力：,浮力：,阻力：

3、,d,Ps分別指顆粒的直徑（m）和密度（kg.m-3）,重力沉降理論,當球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力達到平衡時，,則,重力沉降理論,當球形顆粒處于滯流區(qū)（ ）時,當球形顆粒處于過渡區(qū)（ ）時,當球形顆粒處于湍流區(qū)（ ）時,千姿百態(tài)的微生物世界,Bacterial morphology diagram,High-density cell culture,球形顆粒？,無限稀釋溶液？,3、提高重力沉降的途徑,加入中性鹽：雙電層排斥電位降低 加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝圖 引入外力,（二）、離心沉淀,1、離心沉淀的定義 2、離心沉淀的理論 3、離心分離方法 4、離心分離設(shè)備,1、離心

4、沉降定義,離心沉降是利用沉降設(shè)備使流體和顆粒旋轉(zhuǎn)，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產(chǎn)生相對運動，從而使顆粒和流體分離。,2、離心沉降理論,離心沉降速度,令：,3、離心分離方法,差速離心分級 區(qū)帶離心 差速區(qū)帶離心 平衡區(qū)帶離心,差速離心分離,差速離心是以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離方法，應(yīng)用某一特定顆粒沉淀的離心力在預(yù)定的離心時間內(nèi)得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒的上清液。,差速離心分離應(yīng)用實例,600g,10 min,15000g,10 min,100000g,60 min,300000g,120 min,nuclei,Mitochondria

5、 lysosomes,Plasma membrane,Riosomal subunits,homogenate,Filtered homogenate,Soluble part of cytoplasm,Sedimentation,區(qū)帶離心分離前提,在離心管內(nèi)的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同濃度（密度）的梯度介質(zhì)（蔗糖等），按照濃度從大到小的原則，依次層層加入。加入離心管中的梯度介質(zhì)經(jīng)高速離心或靜置后可形成連續(xù)的密度梯度。,操作過程,區(qū)帶離心種類,差速區(qū)帶離心(速度區(qū)帶離心） 平衡區(qū)帶離心（等密度離心）,差速區(qū)帶離心,差速區(qū)帶離心,基于顆粒的大小、形狀的分離 梯度液的最大密度不能超過所分

6、離顆粒的最大密度 離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等 動態(tài)離心分離方法,平衡區(qū)帶離心,平衡區(qū)帶離心,梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度 離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等 平衡離心分離方法,梯度液的種類和應(yīng)用,細胞分離區(qū)帶離心異同,離心方法新進展具體表現(xiàn)在哪幾個方面？,1.固定角轉(zhuǎn)子垂直管離心法的進展 使用垂直管轉(zhuǎn)子的成功之例是1980年由B. H. Chung等提高的血清脂蛋r白分離的SVs方法(即Single Vertical Spin法,一單次垂直管離心法)，它使對臨床診斷意義很大的這一分離在實用上成為可能.傳統(tǒng)的血清脂蛋白分離用“順序浮選法”(即S

7、F法)，一次分離需時3天，用去驅(qū)動壽命1億轉(zhuǎn)以上?，F(xiàn)用垂直管轉(zhuǎn)子作SVS方法，不連續(xù)NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5萬一6.5萬轉(zhuǎn)/分，0.75-2.5 i)時，一次分離成功。,3.短液柱離心法(Short-Column method) 由美國的0. M. Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平轉(zhuǎn)子中人為地使用不加滿的離心管來降低液柱高。此法不僅降低液柱高以減少離心時間，更重要的是使處千液面的樣品受到更大的離心力從而進一步縮短了離心時間，在不減少樣品量和樣品濃度的條件下，可把離心時間縮短為常規(guī)滿管離心時的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它們

8、在不加滿離心時也不會變形。,4.細絕(或細菌)的離心洗脫(Flutriator) 技術(shù) 這是美國Beckman公司近年發(fā)展的一種低速連續(xù)洗脫技術(shù)，特別適用于培養(yǎng)液的連續(xù)收集。使用的是帶小容量連續(xù)離心池的JE-6B轉(zhuǎn)子.其洗脫原理不是在一般轉(zhuǎn)子中的沉降，而是被分離物在離心中的“浮選”。用4. 2ml的離心池可在1小時內(nèi)從100-1 000m!的原液中回收10-10，個細胞。,2.超速連續(xù)離心法 超速連續(xù)離心轉(zhuǎn)子是由美國Beckman公司開發(fā)的，最適用于病毒的純化，從大量的組織勻漿中分離亞細胞組織、培養(yǎng)液中細菌的收集，以及污水研究。,4、離心設(shè)備分類,常用離心設(shè)備,Solids-ejecting

9、disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation,Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation,常用離心設(shè)備,Decanter centrifuge,Multichamber bowl, vertical cut,管式離心設(shè)備,A disposable cell separation insert,PowerfugeTM one-chamber with scraper,Tub

10、ular bowl,碟片離心設(shè)備,(a) Solids-retaining disk bowl, (b) Radial solids-ejecting disk bowl, top feed. (c) Radial solids-ejecting disk bowl, hermetic feed. (d) Axial solids-ejecting disk bowl. (e) Nozzle bowl with pressurized solids discharge. (f) Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.,離心設(shè)備比較,離心機處

11、理能力,粒子在徑向上的沉降速度,軸向移動速度,完全沉降的邊界條件,離心機處理能力,影響因素,處理樣品的特性，如密度、粒徑等 溶液的特性，如密度、粘度等 離心機機械結(jié)構(gòu)，如r1和r2 操作條件，,（三）、過濾,1、過濾的定義 2、過濾的受力分析 3、提高過濾速度的途徑,1、過濾定義,過濾是利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法。,過濾本身是一種膜分離技術(shù)。在分離細胞、菌體或它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術(shù)也是一種常備的分離方法。,2、過濾過程受力分析,推動力：過濾操作以壓力差為主要推動力； 阻 力：過濾過程的阻力來自多孔性過濾介 質(zhì)和介質(zhì)表面不斷堆積形

12、成的濾餅,過濾速率,Q：液體的流量 A:面積 Rm表示介質(zhì)的阻力； Rc表示濾餅的阻力； L為濾液的粘度,恒壓過濾方程,Ruth恒壓過濾方程,其中，K為Ruth恒壓過濾系數(shù)，表示為,3、提高過濾速度的途徑,采用絮凝或凝聚的方法預(yù)處理改變料液的性質(zhì)，降低濾餅阻力 加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，提高過濾速度,濾餅,傳統(tǒng)的過濾,cake,Conventional filtration,二、細胞破碎與胞內(nèi)物釋放,1、概述 2、細胞破碎技術(shù)的分類 3、常用破碎方法的介紹,學(xué)習(xí)要點,理解：各種細胞破碎方法原理、優(yōu)缺點及其適用范圍。 應(yīng)用：采用不同的細胞破碎方法對不同細胞進行不同程度的破碎。,1、概述,

13、（1）細胞結(jié)構(gòu) （2）細胞膜的組成 （3）影響產(chǎn)物釋放的因素,（1）細胞結(jié)構(gòu) （真核細胞與原核細胞）,真核細胞,原核細胞,（2）細胞膜組成,（A）,（B）,（3）影響產(chǎn)物釋放的環(huán)境因素,在復(fù)雜培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞其破碎較單一培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞更難； 對數(shù)生長期的細胞會表現(xiàn)得更加脆弱。 從連續(xù)培養(yǎng)過程中獲得的、具有較高比生長速率的念珠菌的細胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠菌體則有更加充裕的機會構(gòu)建更加堅固的細胞壁。 酵母細胞壁的厚度和破碎阻力隨年齡增長而增加 經(jīng)常在幼酵母細胞中出現(xiàn)的芽痕（Bud scars）可引起酵母細胞局部細胞壁強度的降低,2、細胞破碎技術(shù)的分類,細胞破碎的目的

14、是釋放出細胞內(nèi)含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分為機械法和非機械法兩大類。,細胞破碎技術(shù)分類,3、常用細胞破碎方法介紹,（1）機械破碎高壓勻漿,細胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可達到450 m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。,缺點：,這種方法較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。,（2）機械破碎珠磨,珠磨機的破碎室內(nèi)填充有8085（v/v）的玻璃（密度為2.5 g/ml）或氧化鋯（密度為6.0 g/ml）的微球（粒

15、徑約0.11.0 mm）。在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球與微球之間以及微球和細胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。,缺點：,設(shè)備是珠后機，在珠波分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作，破碎中，生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。存在的問題：操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗估計并且珠子之間的液體損失30左右。,（3）機械破碎撞擊破碎,撞擊破碎原理： 細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（凍結(jié)速度為數(shù)千/min），形成粒徑小于50 微米的微粒子，高速載氣（如氮氣，流速為300m/s）將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細胞發(fā)生破碎。,（4）機械破碎

16、超聲波破碎,壓電傳感器將電子振蕩器的交變電流轉(zhuǎn)換為聲波。在超聲波的作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。,缺點：,超聲波破碎在實驗室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難。,非機械破碎之,酸堿處理 化學(xué)試劑處理 酶溶 自溶 滲透壓沖擊法 凍結(jié)-融化法,（5）化學(xué)滲透法,有些有機溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。其作用機理；化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。,缺點：,時間長，效率低；化學(xué)試劑毒性較強，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。,（6）酶溶法,就是用生物酶將細胞壁和細胞臘消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶，-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等。,缺點：,易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶