1、第一章 免疫球蛋白及其超家族,第一節(jié) 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 第二節(jié) 免疫球蛋白的生物合成和基因結(jié)構(gòu) 第三節(jié) 免疫球蛋白的生物學(xué)功能 第四節(jié) 單克隆抗體及基因工程抗體 第五節(jié) 免疫球蛋白超家族的組成和特點,2,第一節(jié) 免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)與特性,免疫球蛋白是一類其分子結(jié)構(gòu)和功能研究得最為清楚的免疫分子。關(guān)于免疫球蛋白分子的結(jié)構(gòu)和功能的研究是現(xiàn)代免疫學(xué)中的一大突破。盡管抗體的發(fā)現(xiàn)很早，但由于在血清中存在的抗體分子不均一，即有異質(zhì)性，故對其結(jié)構(gòu)的研究十分困難。 自發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤病人血清中含有均一的免疫球蛋白(單克隆Ig)后,在19591963年R.Porter和G.Edelman采用酶及還原劑消化和分

2、離免疫球蛋白技術(shù),弄清了免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),從而提出免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)模型。,3,4,5,一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),五類免疫球蛋白IgG，IgM，IgA，IgE，IgD的單體分子結(jié)構(gòu)都是相似的，即是由兩條相同的重鏈(heavy chain,H鏈)和兩條相同的輕鏈(light chain,L鏈)四條肽鏈構(gòu)成的“Y”字形的分子。 IgG,IgE,血清型 IgA,IgD均是以單體分子形式存在的,IgM是以五個單體分子構(gòu)成的五聚體,分泌型的IgA是以二個單體構(gòu)成的二聚體。,6,(一)重鏈(heavy chain, H鏈),重鏈大約是由 420440個氨基酸組成，分子重大約為5000077000，兩條重

3、鏈之間由一對或一對以上的二硫鍵(-S-S-)互相連接。 重鏈從氨基端(N端)開始最初的110個氨基酸(約占整個重鏈的1/4)的排列順序以及結(jié)構(gòu)是隨抗體分子的特異性不同而有所變化,這一區(qū)域稱為重鏈的可變區(qū)(variable region,簡稱V區(qū)),它賦予抗體以特異性。 在重鏈的可變區(qū)(VH)內(nèi)部,有四個區(qū)域的氨基酸最易發(fā)生變化,稱為高(超)變區(qū)(hypervariable region),氨基酸殘基位置分別位于 3137,51 58,8491,101110,其余的氨基酸變化較小,稱為骨架區(qū)(framework regions)。,7,重鏈（2）,其余的氨基酸(占重鍵的3/4)數(shù)量、種類、排列順

4、序及含糖量都比較穩(wěn)定,稱為穩(wěn)(恒)定區(qū)(constant region,簡稱C區(qū))。 免疫球蛋白的重鏈有五種類型- ,由此決定了免疫球蛋白的類型,即IgG,IgM,IgA,IgE,IgD的重鏈分別為 。因此同一種動物,不同種類免疫球蛋白的差別就是由重鏈所決定的。,8,(二)輕鏈(light chain, L鏈),輕鏈?zhǔn)怯?213214 個氨基酸組成，分子量約為22500。兩條相同的輕鏈其羧基端(C端)靠二硫鍵分別與兩條重鏈連接。 輕鏈從氨基端開始最初的109個氨基酸(約占輕鏈的1/2)的排列順序以及結(jié)構(gòu)是隨抗體分子的特異性變化而有差異,稱為輕鏈的可變區(qū)(variable region,V區(qū)),

5、與重鏈的可變區(qū)相對應(yīng),構(gòu)成抗體分子的原結(jié)合部位,其余的氨基酸比較穩(wěn)定,稱為輕鏈的恒定區(qū)(constant region,C區(qū))。,9,10,(三)免疫球蛋白的功能區(qū)(domain of immunoglobulin),免疫球蛋白的多肽鏈分子可折疊形成幾個由鏈內(nèi)二硫鍵連接成的環(huán)狀球形結(jié)構(gòu)，這些球形結(jié)構(gòu)稱為免疫球蛋白的功能區(qū)(domain)。 IgG,IgA,IgD的重鏈有四個功能區(qū),其中有一個功能區(qū)在可變區(qū),其余的在恒定區(qū),分別稱為VH.CH1,CH2,CH3；IgM和lgE有五個功能區(qū),即多了一個CH4。 輕鏈則有兩個功能區(qū),即VL和CL,分別位于可變區(qū)和恒定區(qū)。免疫球蛋白的每一個功能區(qū)都是由

6、約110個氨基酸殘基組成。,11,1.VH-VL這是抗體分子結(jié)合抗原的所在部位。 2.CH1-CL為遺傳標(biāo)志所在。 3.CH2為抗體分子的補體結(jié)合位點,與補體的活化有關(guān)。 4.CH3與抗體的親細(xì)胞性有關(guān),IgG同一些免疫細(xì)胞的Fc受體結(jié)合就是這個部位。 免疫球蛋白的這些功能區(qū)雖然功能不同，但其結(jié)構(gòu)上卻具有明顯的相似性，即同源性(homology),故又稱免疫球蛋白的同源區(qū)。這種結(jié)構(gòu)上的相似性提示這些功能區(qū)最初可能是由單一基因編碼,通過基因復(fù)制和突變而衍生進化而成。,12,在輕鏈的可變區(qū)(VL)內(nèi)部有三個高變區(qū),氨基酸殘基位置分別位于2632,4855,9095,這三個部位的氨基酸變化特別大。其

7、余的氨基酸變化較小,稱為骨架區(qū)。 免疫球蛋白的輕鏈根據(jù)其結(jié)構(gòu)和抗原性的不同可分為K(Kappa)型和(Lambda)型兩個型,各類免疫球蛋白的輕鏈都是相同的,而各類免疫球蛋白都有K型和型兩型輕鏈分子。型和型輕鏈的差別主要表現(xiàn)在C區(qū)氨基酸組成和結(jié)構(gòu)的不同,因而抗原性不同,這也是輕鏈分型的依據(jù)。,13,14,Ig的絞鏈區(qū),在兩條重鏈之間二硫鍵連接處附近的重鏈恒定區(qū),即CH1與CH2之間大約30個氨基酸殘基的區(qū)域為免疫球蛋白的絞鏈區(qū)(hinge region),由 25個鏈間二硫鍵、CH1尾部和CH2頭部的小段肽鏈構(gòu)成。 此部位與抗體分子的構(gòu)型變化有關(guān),當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時,該區(qū)可轉(zhuǎn)動,以便一方面使可

8、變區(qū)的抗原結(jié)合點盡量與抗原結(jié)合,可與不同距離的兩個抗原表位結(jié)合,起彈性和調(diào)節(jié)作用;另一方面可使抗體分子變構(gòu),使其補體結(jié)合位點暴露出來。 免疫球蛋白的絞鏈區(qū)具有堅韌性,這與該部位含較多脯氨酸殘基有關(guān),15,二 免疫球蛋白的微細(xì)結(jié)構(gòu)1. 輕鏈結(jié)構(gòu),所有抗體的輕鏈都可分成兩類或兩個同型，K(Kappa)型和(Lambda) 。 每一輕鏈都形成V區(qū)和C區(qū)，各大約110個氨基酸。在V區(qū)，有3個超變區(qū)，分別為CDR1, CDR2和CDR3, 每一個大約10個氨基酸，其中CDR3最可變。 不同抗體分子的CDR之間序列的不同，引起了突起并具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。,17,2. 重鏈結(jié)構(gòu),同輕鏈一樣，重鏈殘基變異最大

9、的區(qū)域也集中于CDR1, CDR2和CDR3。 所有重鏈都可以表達成兩種分子形式，區(qū)別在于最后一個CH功能的近羧基端氨基酸序列的不同。 血漿中的分泌抗體：末端帶電的和親水的氨基酸殘基。膜抗體：包含大約26個不帶電的親水側(cè)鏈后跟著數(shù)目不等的帶電氨基酸形成胞質(zhì)片段。親水殘基形成a-螺旋，穿過膜脂質(zhì)雙層的親水部分；氨基酸堿性側(cè)鏈與膜表面的磷脂群相互作用。,18,尾片：重鏈和 的分泌形式在近羧基端的最后一個CH功能區(qū)有一附加的延伸的非球形序列，稱之。 連接鏈（J）：為一附加的15KD多肽。以二硫鍵連接尾片，形成穩(wěn)定的多聚體，如IgM的五聚體，IgA的二聚體。 所有的重鏈都有糖基化的N端，即含有與天冬氨

10、酸側(cè)鏈相連的N連接的寡糖基團。,19,back,20,3. 重鏈與輕鏈的連接,重鏈與輕鏈間的相互作用包括共價連接和非共價連接。 共價連接存在于以二硫鍵連接的輕鏈羧基端和重鏈CH1區(qū)；非共價連接主要來自于CL區(qū)與CH1區(qū)以及VL與VH之間的疏水作用。,21,二 抗體分子與抗原的結(jié)合,生物性抗原的結(jié)構(gòu)特征 抗體與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 抗體與抗原結(jié)合的親和力和親合力,一 生物性抗原的結(jié)構(gòu)特征,磷脂或磷脂多糖復(fù)合物：抗原決定簇完全具有大分子共價結(jié)構(gòu)的功能 蛋白質(zhì)：相鄰的氨基酸殘基形成的表位稱為線 形決定簇。長度大約6個氨基酸。大多數(shù)情況 下，自然狀態(tài)下的線形決定簇不能與抗體結(jié)合，只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性的時候才

11、能結(jié)合。線形氨基酸序列不同部位的氨基酸殘基通過折疊形成空間結(jié)構(gòu)，稱為構(gòu)象決定簇。,23,24,針對某一線性決定簇和構(gòu)象決定簇的特異性抗體可用來確定某一蛋白處于變性狀態(tài)還是自然狀態(tài)。 蛋白質(zhì)可能傾向于共價修飾，如磷酸化或特異性的蛋白裂解，改變共價結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生新的抗原表位。（圖） 大分子物質(zhì)可形成多個抗原決定簇。如蛋白質(zhì)由單體構(gòu)成，具有多價性，可與一個抗體上的多個結(jié)合位點或多個抗體結(jié)合。,25,二 抗原與抗體結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),不同抗原特異性抗體的VL和VH不同，變化多位于超變區(qū)內(nèi)。 超變區(qū)中的變化，既可通過自發(fā)突變，也可通過特異性點突變產(chǎn)生，最終改變抗原結(jié)合的特異性。 晶體衍射分析顯示，形成伸展的環(huán)

12、，暴露在抗體的表面，與抗原發(fā)生作用。 抗原抗體晶體衍射分析顯示，超變區(qū)氨基酸能與抗原緊密結(jié)合。CDR3結(jié)合最緊密且變異最大。,三 抗體與抗原結(jié)合的親和力和親合力,親和力或結(jié)合力：在抗原抗體反應(yīng)體系中，如果抗體比抗原的濃度低的多，那么在平衡時抗體分子結(jié)合抗原的比率取決于抗原分子的濃度和抗原抗體結(jié)合的強度。在這一狀態(tài)下，能使一半的抗原形成復(fù)合物，而另一半游歷狀態(tài)的抗原濃度可衡量結(jié)合力或親和力的大小。 抗原濃度以體積摩爾濃度測定，稱為相互作用的解離常數(shù)（Kd), Kd越小，親和力越大。,在天然的血清中，含有某一特殊抗原而具有不同親和力的抗體混合物中，主要依靠CDR準(zhǔn)確的氨基酸序列。 親和力的成熟：一

13、個抗體分子的平均親和力可通過重復(fù)免疫而增強。 親合力：所有位點結(jié)合力的總和稱為親合力。,28,第二節(jié) 免疫球蛋白的生物合成和基因結(jié)構(gòu)一. 抗體庫的多樣性,抗體庫：每一個體能產(chǎn)生抗體特異性的總和。 初級抗體庫：個體在對不同抗原初次免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的所有抗體的總和。這取決于免疫之前就存在并表達明確抗原特異性膜Ig分子的B細(xì)胞克隆數(shù)目，每一個體估計有約109或更多。,29,二 B淋巴細(xì)胞的成熟,前B細(xì)胞：胞質(zhì)中出現(xiàn)重鏈 （包括V區(qū)和C區(qū)），與一種非免疫球蛋白結(jié)合，該蛋白的作用是防止新合成的鏈降解和促進膜免疫球蛋白的合成。 不成熟的B細(xì)胞：合成K和鏈，與重鏈結(jié)合，組裝成IgM,暴露于細(xì)胞表面，作為抗原的

14、特異受體。受抗原刺激后，不能增殖和分化。一旦遇到抗原（多為自身抗原），就會產(chǎn)生不反應(yīng)性或耐受性。,30,一旦一個B細(xì)胞合成出一種完整的重鏈和輕鏈，就不能再產(chǎn)生另外一種帶有不同V區(qū)的重鏈和輕鏈。 成熟的B細(xì)胞：進入外周血液循環(huán)和淋巴組織，膜上帶有IgM和IgD,具有相同的V區(qū)和抗原特異性，對抗原刺激能產(chǎn)生應(yīng)答。有些B細(xì)胞并不表達IgD。除非遇到抗原刺激，否則經(jīng)過3-4天的半衰期后死亡。 激活的B細(xì)胞：成熟的B細(xì)胞遇到抗原刺激后形成的。細(xì)胞發(fā)生增殖和分化，分泌性Ig增多，而膜Ig減少，并表達 。 一部分不分泌抗體，形成記憶細(xì)胞。,31,漿細(xì)胞：產(chǎn)生高水平分泌Ig，建立初次和再次的免疫應(yīng)答。 親和力

15、成熟：盡管每一B細(xì)胞克隆的成員都表達同樣的V區(qū)，但當(dāng)對抗原應(yīng)答時也會發(fā)生抗體V區(qū)精細(xì)的變化，特別是分泌性抗體和抗原特異性B細(xì)胞膜Ig的平均親和力在抗原刺激后隨之增加，并且再次應(yīng)答時明顯高于初次應(yīng)答，即親和力成熟。,32,33,B細(xì)胞產(chǎn)生Ig的兩個特征,每一B細(xì)胞克隆及其子代僅對一種抗原決定簇是特異的。在兩套親本的Ig等位基因中，只有一套在B細(xì)胞克隆的最早成熟時期表達，稱為等位基因排斥。這是B和T淋巴細(xì)胞抗原受體的共同特征。 每一B細(xì)胞克隆只能產(chǎn)生一種K鏈或一種鏈，稱為親鏈同型排斥。,三 免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu),免疫球蛋白（Ig）分子由IGK,IGL和IGH基因編碼。這些基因定位于不同的染色體。1

16、965年Dreyer和Bennett提出假設(shè)認(rèn)為，Ig的V區(qū)和C區(qū)由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中這兩個基因發(fā)生易位而重排在一起。1976年Hozumi和Tonegawa應(yīng)用DNA重組技術(shù)證實了這一假設(shè)。 Tonegawa因在免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)研究方面有重大突破而獲1987年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎。,35,36,（一）免疫球蛋白基因的結(jié)構(gòu)1. Ig重鏈可變區(qū)（V區(qū)）基因,重鏈基因座位于14號染色體。 V區(qū)基因由V、D、J三種基因片段經(jīng)重排后形成。編碼重鏈V區(qū)基因長約10002000kb，包括V、D、J三種基因片段。每個V基因片段上游有L基因片段，編碼約20-30個疏水性氨基酸的信號肽。

17、,37,重鏈V基因片段：小鼠，可分為9個家族，每個家族含有2-60個成員不等，這些家族多為集散分布。人，共65個基因片段，至少有7個家族，各家族成員混雜分布。 V基因片段編碼可變區(qū)約98個氨基酸殘基，包括CDR1和 CDR2。 重鏈D基因片段：D(diversity)是指多樣性。在Ig基因結(jié)構(gòu)中，DH基因片段在VH基因的3端，D基因片段編碼重鏈V區(qū)大部分CDR3。人類DH片段有27個。 重鏈J基因片段：J（joining）是指連接，是連接V和C基因的片段，位于DH基因的3端。 JH編碼約15-17個氨基酸殘基，包括重鏈V區(qū)CDR3中除DH編碼外的其余部分和第四骨架區(qū)。人有9個JH基因片段，其中

18、6個有功能。,38,2. Ig重鏈恒定區(qū)（C區(qū)）基因,重鏈恒定區(qū)由多個外顯子組成，位于J基因片段的下游，相隔1.3kb，每個外顯子編碼一個結(jié)構(gòu)域，鉸鏈區(qū)由單獨的外顯子編碼。 大多數(shù)分泌的Ig重鏈C端片段（尾端）是由最后一個CH外顯子的3端編碼，而鏈的尾端由一個單獨的外顯子編碼。編碼膜Ig C端區(qū)段（40-70aa）由1-2個附加的外顯子編碼，距編碼分泌型重鏈的最后一個外顯子的3端至少1.4kb。 小鼠CH基因約占2000kb,其外顯子從5端到3端排列是5 -C- C- C3 -C1- C2b-C2a- C- C-3 。人CH基因功能片段有9個，排列為5 -C- C-C3 -C1-C1-C2-C

19、4-C-C-3 。,39,3. Ig鏈基因,在人類，該基因座位于22號染色體，V有30個，可分為V1- V10十個家族，主要是V1- V3，進化上比較保守。 與H鏈和鏈不同，J和C成對排列，4個J和4個C基因片段分別形成J1- C1 、J2- C2、J3 - C3 和J4 -C4 。,40,4. IgK鏈基因,人類該基因座位于2號染色體，VK基因片段有40個，編碼V區(qū)N端的1-95位氨基酸，包括CDR1,CDR2和部分CDR3。根據(jù)核苷酸同源性， VK可分為7個家族或亞群。 JK基因位于VK基因的3端，有5個片段，編碼V區(qū)靠近C端側(cè)的第96-108氨基酸。 C k只有一個，編碼C區(qū)（109-2

20、14）。所有K輕鏈具有同一結(jié)構(gòu)的c區(qū)。,41,42,43,44,45,第三節(jié) 免疫球蛋白的生物學(xué)功能一. B細(xì)胞抗原受體的膜Ig,抗原與表達在B細(xì)胞表面的膜受體(Ig)特異性結(jié)合和識別。研究表明，細(xì)胞表面Ig通過多價抗原發(fā)生的交聯(lián)導(dǎo)致B細(xì)胞激活。 Ig分子超變區(qū)獨特的決定簇即獨特位，獨特位的集合構(gòu)成其獨特型?？躬毺匦涂贵w與反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面Ig連接，即可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強度。,46,47,二. 中和抗原的反應(yīng),毒素，藥物，病毒，細(xì)菌和一些寄生蟲通過結(jié)合到細(xì)胞表面特異性Ig而引起細(xì)胞損傷 分泌性Ig由于異物上的抗原決定簇結(jié)合而阻礙損傷的發(fā)生，減輕毒性或炎癥過程。,48,三. Ig介導(dǎo)的特異性功能1

21、. IgG和IgM激活補體,游離的IgG和IgM不能結(jié)合補體中的C1q,因此補體系統(tǒng)不能被激活， C1q可與免疫復(fù)合物中的聚集的Fc結(jié)合。 C1q通過IgG的C2區(qū)發(fā)生相互作用，不同的IgG亞型觸發(fā)補體活化的能力不同，依次為IgG3IgG1IgG2,而IgG4則無此功能。 分泌型IgM以多聚體存在，但C1q由于空間位阻的影響，不能與循環(huán)中IgM的三維結(jié)構(gòu)結(jié)合。但IgM結(jié)合到細(xì)胞表面能改變Ig的構(gòu)象，使C1q能與Fc片段結(jié)合。,49,2. IgG和IgM調(diào)理增強吞噬作用,單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞都表達IgG分子的Fc段受體，至少有3種不同類型的Fc受體，每一種都對不同的IgG亞型有不同的親和力和選擇

22、性。且白細(xì)胞表面三種IgG的的Fc受體都含有Ig樣區(qū)，同屬于Ig超家族成員。通過Fc受體，IgG分子結(jié)合或披覆于抗原顆粒上，結(jié)合的IgG就能增強細(xì)胞的吞噬作用，稱為調(diào)理作用。IgG1和IgG3調(diào)理作用最強。 另外，補體C3b片段也可與白細(xì)胞的C3b受體結(jié)合，C3b有免疫復(fù)合物激活補體產(chǎn)生，因此而產(chǎn)生間接的調(diào)理作用和增強吞噬作用。,50,51,52,3. IgG、IgE和IgA在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）：在ADCC中，結(jié)合抗體主要是由白細(xì)胞上的低親和力Fc受體介導(dǎo)的。在NK細(xì)胞中，IgG具有兩種不同的功能。一是選擇性地殺傷結(jié)合IgG的靶細(xì)胞，而不

23、殺傷未結(jié)合IgG的細(xì)胞。二是Fc受體的出現(xiàn)（可能是聚集）激活NK細(xì)胞，合成和分泌細(xì)胞因子如TNF和IFN-以及釋放顆粒，引起溶細(xì)胞作用。 嗜酸性粒細(xì)胞能表達IgE或IgA抗體的Fc受體,引起ADCC,主要針對寄生蟲如蠕蟲。嗜酸性粒細(xì)胞中的堿性蛋白質(zhì)能殺死蠕蟲。,53,54,55,4. IgE在超敏反應(yīng)中的作用,肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表達高親和力的IgE分子的Fc段受體，該受體在缺乏抗原的情況下也能與IgE單體結(jié)合。特異性抗原能引起IgE分子及其聚集，從而導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放炎性和血管活性介質(zhì)，合成脂源性介質(zhì)和細(xì)胞因子，引發(fā)速發(fā)性過敏反應(yīng)。,56,5. IgA介導(dǎo)的黏膜免疫,IgA能選

24、擇性地穿過腸或黏膜覆蓋器官的黏膜屏障。IgA總含量最高，但血漿中較少。 器官的上皮細(xì)胞，能表達特異性二聚體IgA分子的Fc受體，稱為分泌蛋白或S蛋白，S蛋白能與上皮細(xì)胞基底面的IgA結(jié)合，結(jié)合的IgA通過囊泡轉(zhuǎn)運從細(xì)胞移動到黏膜表面，發(fā)揮功能。,6. 母體IgG在新生兒免疫中的作用,母體的IgG穿過胎盤進入胎兒循環(huán)中，而IgA由母體分泌到乳汁中，新生兒由腸道吸收至血液。,7. IgG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反饋抑制,聚集的IgG或含IgG的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合到B細(xì)胞表面的Fc受體上，可以抑制這些B細(xì)胞的激活，稱為抗體反饋。,59,第四節(jié) 單克隆抗體,Khler和Milstein在1975年建立了體外淋巴

25、細(xì)胞雜交瘤技術(shù),用人工的方法將產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,形成B細(xì)胞雜交瘤,這種雜交瘤細(xì)胞既具有骨髓瘤細(xì)胞無限繁殖的特性,又具有B細(xì)胞分泌特異性抗體的能力,由克隆化的B細(xì)胞雜交瘤所產(chǎn)生的抗體即為單克隆抗體。,60,一. 單克隆抗體的生產(chǎn)過程,B細(xì)胞的制備：純化抗原免疫Balb/c等純系小鼠，免疫2-3次，間隔2-4周，末次免疫后3-4天，取脾臟，制成103/ml的脾細(xì)胞懸液，為親本的B細(xì)胞。 骨髓瘤細(xì)胞的制備：用與免疫相同來源的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，其本身不分泌免疫球蛋白，且具有某種營養(yǎng)缺陷?？捎肧p2/0或NS-1,其缺少次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT酶），不能在HAT培養(yǎng)

26、基上生長。培養(yǎng)至對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)達105-106/ml。,61,飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備：常用的細(xì)胞有小鼠胸腺細(xì)胞，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞等。其作用一是減少培養(yǎng)板對雜交瘤細(xì)胞的毒性，二是巨噬細(xì)胞能清除部分死亡的細(xì)胞。 培養(yǎng)基選擇：常用HAT培養(yǎng)基，H為次黃嘌呤，T為胸腺嘧啶核苷，二者都是旁路合成DNA的原料，A是氨甲喋呤，是細(xì)胞合成DNA的阻斷劑。在該培養(yǎng)基中，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長。 細(xì)胞融合：將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按一定比例混合，加入融合劑（50%PEG4000）。依次用HAT, HT和完全DMEM培養(yǎng)。,62,檢測抗體：用RIA, ELISA,反向間接血凝試驗檢測抗體，篩選抗體陽性孔。 雜交瘤細(xì)胞

27、的克隆化：陽性孔應(yīng)盡早克隆化，一是為了獲得單個克??；二是防止雜交瘤細(xì)胞因染色體丟失而喪失分泌抗體的能力。一般需反復(fù)克隆3-5次方能使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定。方法有：有限稀釋法，顯微操作法，軟瓊脂平板法等。,63,單克隆抗體的生產(chǎn),在動物體內(nèi)誘生單克隆抗體：將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，瘤細(xì)胞無限繁殖，導(dǎo)致腹水產(chǎn)生，每毫升腹水約可產(chǎn)生5-20mg 體外細(xì)胞培養(yǎng)：大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，收集培養(yǎng)液，獲得大量的單克隆抗體。 微球技術(shù)制備單克隆抗體：將雜交瘤細(xì)胞包于特制的微球內(nèi)，進行大量發(fā)酵培養(yǎng)。,64,HAT選擇培養(yǎng)基(DMEM) H為次黃嘌呤(hypoxanthine) T為胸腺嘧啶核苷(thymidine) A

28、是氨基喋呤(aminoplerin) 在該培養(yǎng)基中,未融合的骨髓瘤細(xì)胞不能生長,因它缺乏HGPRT酶不能利用分路途徑合成DNA,內(nèi)源性的合成又受到氨基喋呤的阻斷;至于未融合的脾細(xì)胞則在2周內(nèi)自然死亡;所以只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在該培養(yǎng)基中生長。,65,單克隆抗體的優(yōu)點與應(yīng)用,單克隆抗體具有無可比擬的優(yōu)越性,具有高特異性、高純度、均質(zhì)性好、親和力不變、重復(fù)性強、效價高、成本低并可大量生產(chǎn)等優(yōu)點。 在血清學(xué)技術(shù)方面 單克隆抗體用于血清學(xué)技術(shù),進一步提高了方法的特異性.重復(fù)性.穩(wěn)定性和敏感性,同時使一些血清學(xué)技術(shù)得到了標(biāo)準(zhǔn)化和商品化,即作成診斷試劑盒。 在免疫學(xué)基礎(chǔ)研究方面 單克隆抗體作為一種均質(zhì)

29、性很好的分子,用于對抗體結(jié)構(gòu)和氨基酸順序的分析,促進了對抗體結(jié)構(gòu)的探討;應(yīng)用單克隆抗體對淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志以及組織細(xì)胞相容性抗原的分析, 推動了免疫學(xué)的發(fā)展。,66,通過采用雜交瘤技術(shù),制備出腫瘤細(xì)胞特異性抗原的單克隆抗體,然后與藥物或毒素連接制成免疫毒素(immunotoxin)，又稱生物導(dǎo)彈,用于腫瘤的臨床治療,這在醫(yī)學(xué)上已獲初步成效。 利用單克隆抗體的特異性,可將單克隆抗體與瓊脂糖等偶聯(lián)制成親和層析柱,可從混合組分中提取某種抗原成分。此技術(shù)可與基因工程疫苗的研究相結(jié)合,即先用單克隆抗體作為探針,篩選出保護性抗原成分或決定簇,然后再采用DNA重組技術(shù)表達目的抗原。,67,三、基因工程抗體(g

30、entic engineering antibody),基因工程抗體是按人類設(shè)計所重新組裝的新型抗體分子,可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性,去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)(如Fc片段),從而可克服單克隆抗體在臨床應(yīng)用方面的缺陷(如鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)使用會引起抗體產(chǎn)生而降低其效果,Fc片段的無效性和副作用)。 基因工程抗體的制備過程首先是獲得抗體基因片段,然后將抗體基因片段導(dǎo)人真核細(xì)胞(如雜交瘤細(xì)胞)或原核細(xì)胞(如大腸桿菌),使之表過具有免疫活性的抗體片段。 目前基因工程抗體有以下幾種類型： 嵌合抗體 重構(gòu)型抗體 單鏈抗體 Ig相關(guān)分子 噬菌體抗體,68,基因抗體的類型,(一)嵌合抗體(ch

31、imeric antibody) 又稱雜種抗體, 是指在同一抗體分子中含有不同種 屬來源抗體片段的抗體。迄今構(gòu)建的嵌合抗體多為“鼠-人”類型,也就是抗體的Fab或F(ab) 2來源于鼠類,而Fc片段來源于人類。 (二)重構(gòu)型抗體(reshaping antibody) 將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)的編碼基因中,再將此DNA片段與人免疫球蛋白恒定區(qū)基因相連,然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞,使之表達嵌合的V區(qū)抗體。 (三)單鏈抗體(single-chain antibody) 又稱FV分子。是由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物(linker)連接而成。,69,(四)Ig相關(guān)分子 可將

32、抗體分子的部分片段(如V區(qū)或C區(qū))連接到與抗體無關(guān)的序列上(如毒素),就可創(chuàng)造出一些Ig相關(guān)分子,例如可將有治療作用的毒素或化療藥物取代抗體的Fc片段,通過高變區(qū)結(jié)合特異性抗原,連接上的毒素可直接運送到靶細(xì)胞表面，起生物導(dǎo)彈的作用。 (五)噬菌體抗體(Phage antibody) 是將已知特異性的抗體分子的所有V區(qū)基因在噬菌體中構(gòu)建成基因庫,用噬菌體感染細(xì)菌,模擬免疫選擇過程,具有相應(yīng)特異性的重鏈和輕鏈可變區(qū)即可在噬菌體表面呈現(xiàn)出來。,70,第五節(jié) 免疫球蛋白超家族,免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily, IgSF）是由Williams在20世紀(jì)80年代初提

33、出，研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞膜表面分子和機體某些蛋白分子多肽折疊方式與Ig相似，在氨基酸組成上Ig可變區(qū)或/和恒定區(qū)有較高的同源性，它們可能從同一祖先基因進化而來。編碼這些多肽鏈的基因稱為免疫球蛋白基因超家族，其編碼產(chǎn)物稱為免疫球蛋白超家族。 IgSF主要以膜分子形式存在，也有游離的形式。,72,73,一 免疫球蛋白超家族的組成,IgSF主要包括淋巴細(xì)胞受體（Ig及BCR, TCR/CD3, NK細(xì)胞受體），MHC抗原及其相關(guān)分子，免疫球蛋白Fc段受體，多種黏附分子和分化抗原，以及與神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)的黏附分子等。 IgSF分子種類至少有數(shù)百種，分布十分廣泛。如1/3的白細(xì)胞分化抗原屬于IgSF。,Ig

34、SF,74,不同組IgSF結(jié)構(gòu)域的類型和數(shù)目特點,在Ig和淋巴細(xì)胞受體中，5條Ig重鏈各含一個V區(qū)，3-4個C1 區(qū)；2條輕鏈各含一個V區(qū)和C1區(qū)；TCR 4條鏈各含條輕鏈各含一個V區(qū)和C1區(qū)； MHC抗原及相關(guān)分子只含一個C1區(qū)，MHCI類分子重鏈1，2結(jié)構(gòu)域以及MHC II 1， 結(jié)構(gòu)域具有多態(tài)性，但其結(jié)構(gòu)不屬于IgSF; 免疫球蛋白Fc受體基因除FcR外均定位于1號染色體；除polyIgR外，其余IgFc受體有二至三個C2區(qū)。,75,MCSFR、PDGFR和SCFR陽都有五個IgSF結(jié)構(gòu)域，其中遠(yuǎn)膜側(cè)四個C2結(jié)構(gòu)域，近膜端一個V樣區(qū)，這些受體以同源二聚體方式結(jié)合相應(yīng)配體，胞漿區(qū)有PTK結(jié)

35、構(gòu)。IL-6R鏈、gp130、IL-11R鏈和G-CSFR的胞膜外結(jié)構(gòu)除N端各含有一個C2樣區(qū)外，靠近胞膜側(cè)各有一個細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)域和一個或四個III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域。 與神經(jīng)組織細(xì)胞功能有關(guān)的IgSF分子中，合有五個以上C2區(qū)的IgSF分子大都以分布在神經(jīng)系統(tǒng)為主，而含有一至二個V樣區(qū)，分子質(zhì)量相對較小的IgSF分子在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)均有分布。,76,二、免疫球蛋白超家族的特點,(一)IgSF的結(jié)構(gòu)特點 應(yīng)用x射線衍射晶體分析法已對多種IgSF分子的結(jié)構(gòu)域進行了分析，包括IgV和C結(jié)構(gòu)域，MHCI, II類分子的一些結(jié)構(gòu)域，CD4第一、二結(jié)構(gòu)域和三、四結(jié)構(gòu)域等。 IgSF結(jié)構(gòu)域是以其獨特的、稱之為免疫球蛋白折疊(Ig foId)形成的球形結(jié)構(gòu)。每個Ig折疊中有兩個片層(P1eated sheet)，每個片層包括3-5個反平行的折疊股。每個折疊股有510個氨基酸殘基。絕大多數(shù)18SF結(jié)構(gòu)域的兩個 片層之間有一對保守的二硫鍵連接，使其形成穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)。每個折疊片層的核心是由A、B、E、D和G、F、C 折疊股組成。 根據(jù) 片層中折疊股的組成，形成二硫鍵的兩個半骯氨酸之間氨基酸的數(shù)目，以及同IgV區(qū)或C區(qū)同源的程度，IgSF結(jié)構(gòu)域可分為V組、C1組和C2組。,77,(1)V組 V組(或稱V樣區(qū))中兩個p片層是由ABEDGFC