1、第七章,發(fā)酵過程控制,(三)溫度對發(fā)酵的影響及其控制,1. 影響發(fā)酵溫度的因素 2. 溫度對微生物生長的影響 3. 溫度對基質(zhì)消耗的影響 4. 溫度對產(chǎn)物合成的影響 5. 最適溫度的選擇與控制,(1)發(fā)酵熱,發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的熱量，叫做發(fā)酵熱。 Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射,(2)生物熱,來源 ：微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的分解所釋放的能量 影響因素： 菌株 培養(yǎng)基成分 發(fā)酵時期 生物熱與其它參數(shù)的關(guān)系 呼吸強(qiáng)度QO2 糖利用速率,當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時，菌的呼吸強(qiáng)度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗來衡量生物熱。,2. 溫度對微生物生長的影響,當(dāng)時，可忽略，微生物處于生長狀態(tài)。、皆

2、與T有關(guān)，其關(guān)系均可用阿累尼烏斯公式描述： EE 死亡速率比生長速率對溫度變化更為敏感,嗜冷、嗜中溫、嗜熱菌的典型生長與溫度關(guān)系,2. 溫度對微生物生長的影響(續(xù)),在其最適溫度范圍內(nèi)，生長速率隨溫度升高而增加，當(dāng)溫度超過最適生長溫度，生長速率隨溫度增加而迅速下降。 不同生長階段的微生物對溫度的反應(yīng)不同 處于延遲期的細(xì)菌對溫度的影響十分敏感。 對于對數(shù)生長期的細(xì)菌，如果在略低于最適溫度的條件下培養(yǎng)，即使在發(fā)酵過程中升溫，則升溫的破壞作用較弱。 處于生長后期的細(xì)菌，其生長速度一般主要取決于溶解氧，而不是溫度。,4. 溫度對產(chǎn)物合成的影響,影響發(fā)酵過程中各種反應(yīng)速率，從而影響微生物的生長代謝與產(chǎn)物

3、生成。 e.g. 青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素 青霉菌生長活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能E2=112kJ/mol 青霉素合成速率對溫度較敏感,改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響菌的生物合成 。 影響生物合成方向。 e.g. 四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌：T30，產(chǎn)生金霉素；T達(dá)35 ，產(chǎn)生四環(huán)素； 谷氨酸發(fā)酵中擴(kuò)展短桿菌： 30培養(yǎng)后37 發(fā)酵，積累過量乳酸。 溫度對菌的調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系密切 。,4. 溫度對產(chǎn)物合成的影響,4. 溫度對產(chǎn)物合成的影響,影響酶系組成及酶的特性。 米曲霉制曲：溫度控制在低限，有利于蛋白酶合成 凝結(jié)芽孢桿菌的-淀粉酶熱穩(wěn)定性：55培養(yǎng)90保持60min，剩留活性為88%9

4、9%；35培養(yǎng)經(jīng)相同條件處理，剩余活性僅有6%10%。,5. 最適溫度的選擇與控制,定義：最適溫度是指在該溫度下最適于菌的生長或產(chǎn)物的生成，它是一種相對概念，是在一定條件下測得的結(jié)果。 二階段發(fā)酵 e.g.青霉素發(fā)酵：菌體生長期,30 青霉素合成分泌期, 20 ,最適溫度的選擇還要參考其它發(fā)酵條件靈活掌握 通氣條件較差情況下，最適發(fā)酵溫度可能比正常良好通氣條件下低一些。 培養(yǎng)基成分和濃度的影響,5. 最適溫度的選擇與控制,變溫培養(yǎng)：在抗生素發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)比用恒溫培養(yǎng)所獲得的產(chǎn)物有較大幅度的提高。 e.g. 四環(huán)素發(fā)酵：030h稍高溫度30150h稍低溫度 150h后升溫發(fā)酵 青霉素發(fā)酵

5、：30, 5h25 , 35h 20 , 85h 25 , 40h；產(chǎn)量提高14.7,5. 最適溫度的選擇與控制,（四）pH對發(fā)酵的影響及其控制,1. 發(fā)酵對pH的影響 2. pH值對發(fā)酵過程的影響 3. 最適pH的選擇 4. 發(fā)酵過程中pH的調(diào)節(jié)與控制,1）發(fā)酵液中pH變化的基本原理,微生物代謝對pH影響主要在兩種情況下發(fā)生：酸性或堿性代謝產(chǎn)物的生成或釋放；菌體對培養(yǎng)基中生理酸性或堿性物質(zhì)的利用。 引起發(fā)酵液中pH下降的因素 （1）C/N過高，或中間補(bǔ)糖過多，溶氧不足，致使有機(jī)酸積累，pH下降； （2）消泡劑加得過多：脂肪酸增加； （3）生理酸性鹽的利用； （4）酸性產(chǎn)物形成：如有機(jī)酸發(fā)酵。

6、,1）發(fā)酵液中pH變化的基本原理（續(xù)）,引起發(fā)酵液中pH上升的因素 （1）C/N過低（N源過多），氨基氮（NH4）釋放； （2）中間補(bǔ)料中氨水或尿素等堿性物質(zhì)加入過多； （3）生理堿性鹽的利用； （4）堿性產(chǎn)物形成。,2）發(fā)酵過程中pH的變化規(guī)律,生長階段：pH相對于起始pH有上升或下降的趨勢 生產(chǎn)階段：pH趨于穩(wěn)定，維持在最適于產(chǎn)物合成的范圍 自溶階段：pH又上升,pH對生長的影響機(jī)制 對E合成的影響 對E活性的影響 對ATP生產(chǎn)率影響： 影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜的滲透性的變化，因而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。 影響培養(yǎng)基某些重要營養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生

7、物對這些物質(zhì)的利用,（1）pH對微生物生長的影響,（2）pH對產(chǎn)物合成的影響,產(chǎn)物合成階段的最適pH值和微生物生長階段的最適pH往往不一定相同，這不僅與菌種特性有關(guān)，還取決于產(chǎn)物的化學(xué)特性。 e.g. 丙酮丁醇菌：生長 pH為5.57.0；合成pH為4.35.3 青霉素產(chǎn)生菌：生長pH為6.57.2，合成pH為6.26.8 鏈霉素產(chǎn)生菌：生長pH為6.36.9，合成pH為6.77.3,pH影響代謝方向： pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。 e.g. 黑曲霉發(fā)酵：pH23, 檸檬酸；pH接近中性，草酸 酵母菌發(fā)酵：pH4.55.0，酒精；pH8.0，酒精、醋酸

8、和甘油 谷氨酸發(fā)酵：pH7.08.0，谷氨酸；pH5.05.8, 谷酰胺 和N-乙酰谷酰胺,（2）pH對產(chǎn)物合成的影響,3. 最適pH的選擇,選擇pH準(zhǔn)則：獲得最大比生產(chǎn)速率和合適的菌體量，以獲得最高產(chǎn)量。,pH對產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響,配制不同初始pH的 培養(yǎng)基，搖瓶考察 發(fā)酵情況,（1）pH調(diào)節(jié)方法,配制合適的培養(yǎng)基，有很好的緩沖能力； 發(fā)酵過程中加入非營養(yǎng)基質(zhì)的酸堿調(diào)節(jié)劑 (NaOH、HCl、CaCO3)； 發(fā)酵過程中加入生理酸性或堿性基質(zhì)，通過代謝調(diào)節(jié)pH； 酸性基質(zhì)：銨鹽、糖、油脂、玉米漿(脫NH4) 堿性基質(zhì)：NO3鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)氮、氨水、尿素 原則: 殘?zhí)歉邥r，不用糖調(diào)pH 殘

9、N高時，不用生理鹽調(diào)pH pH控制與代謝調(diào)節(jié)結(jié)合起來，通過補(bǔ)料來控制pH,（1）影響溶解氧（DO）的因素,供氧 耗氧,兩大類,以關(guān)系式表示： 影響供氧的因素： 影響耗氧的因素：,C*- CL,溫度、溶質(zhì)、溶劑、氧分壓,KLa,設(shè)備參數(shù)、操作參數(shù)、發(fā)酵液特性,菌種特性、培養(yǎng)基成分和濃度、菌齡、培養(yǎng)條件（T、pH）、代謝類型,（2）發(fā)酵過程中溶氧變化規(guī)律,批式發(fā)酵無DO控制情況下，溶氧變化規(guī)律為“波谷現(xiàn)象”,溶氧、x、QO2、 隨時間變化的關(guān)系,平衡點(diǎn)分析： 當(dāng)CL，即 ，OTR ， OTR逐漸至OTR=，即 ，高位平衡 當(dāng)處于高位平衡時，表明供氧性能好。高位平衡通常發(fā)生在正常情況的前、后期。,平

10、衡點(diǎn)分析： 當(dāng)CL（如對數(shù)生長期很大）， ，OTR ， ， ，稱低位平衡。 低位平衡通常發(fā)生在正常情況下的對數(shù)期。,值得注意的幾點(diǎn),自然“波谷現(xiàn)象”，一般可以自適應(yīng)調(diào)節(jié)（ ） 當(dāng) ，則需要控制，增加OTR，防止需氧受阻。 補(bǔ)料與“波谷現(xiàn)象”對應(yīng)：即補(bǔ)料時間、劑量選擇與溶氧變化有關(guān)。 a.不能在波谷時補(bǔ)料，加重缺氧 b. 一次補(bǔ)料不能過量，防止 ， 菌體停止呼吸、死亡 c.每次補(bǔ)料都會引起一次大的溶氧下降。,（1）溶解氧對生長的影響,臨界氧濃度（CCr）： 當(dāng) 時, 當(dāng) 時, 對生長應(yīng)滿足 , 但并不是越高越好,呼吸抑制,呼吸不受抑制,指不影響菌體呼吸所允許的最低 氧濃度。,（2）溶解氧對產(chǎn)物合

11、成的影響,最適氧濃度（Cm）：溶氧濃度對產(chǎn)物合成有一個最適范圍，CL過高或過低，對合成都不利。 e.g.卷須霉素：1270h之間，維持CL 在10%比在0或45%的產(chǎn)量要高。,（1）溶解氧控制的一般原則,生長階段： 即可 產(chǎn)物合成階段： 即可 過高的溶氧水平反而對菌體代謝有不可逆的抑制作用,（2）溶解氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一,控制原理 發(fā)酵過程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 補(bǔ)糖使CL下降，而CL回升的快慢取決于供氧效率。 對于一個具體的發(fā)酵，存在一個最適氧濃度（Cm）水平，補(bǔ)糖速率應(yīng)與其相適應(yīng)。,，加大補(bǔ)糖速率,，減小補(bǔ)糖速率,實(shí)現(xiàn)用溶解氧水平控制補(bǔ)料速率,補(bǔ)糖

12、速率控制在正好使生產(chǎn)菌處于所謂“半饑餓狀態(tài)”，使其僅能維持正常的生長代謝，即把更多的糖用于產(chǎn)物合成，并永遠(yuǎn)不超過罐設(shè)計(jì)時的KLa水平所能提供的最大供氧速率。,控制原則,（2）溶氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一,控制方法 溶氧和補(bǔ)糖控制系統(tǒng) 溶氧和pH控制的系統(tǒng),（2）溶氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一,（3）溶解氧控制的工藝方法：從供氧、需氧兩方面考慮,供氧方面： 提高氧分壓（氧分含量），即 ，提高供氧能力 改變攪拌轉(zhuǎn)速：通過改變KLa來提高供氧能力 通氣速率Ws ：Ws增加有上限，引起“過載”、泡沫 提高罐壓： ，但同時會增加CO2的溶解度，影響pH及可能會影響菌的代謝，另外還會增加對設(shè)備的

13、強(qiáng)度要求。 改變發(fā)酵液理化性質(zhì)（， ，Ii） 加消泡劑，補(bǔ)加無菌水，改變培養(yǎng)基成分改變KL 改變溫度： 提高推動力（C*CL）,（3）溶解氧控制的工藝方法（續(xù)）,耗氧方面 限制性基質(zhì)的流加控制（補(bǔ)料控制）：在OTR一定情況下，控制基質(zhì)濃度限制、x 限制 控制溶解氧,（六）CO2和呼吸商對發(fā)酵的影響及其控制,1. 定義 2. 發(fā)酵過程中CO2釋放率的變化 3. CO2對發(fā)酵的影響,1. 定義,呼吸商（RQ）：指菌體呼吸過程中，CO2釋放率和菌的耗 氧速率之比，RQ反映菌的代謝情況。 菌體耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌體CO2釋放率CER，molCO2/Lh,（1）影響尾氣中CO2濃度的因

14、素,通入空氣量： 呼吸強(qiáng)度： CO2溶解度： 菌體量：,（2）CER變化規(guī)律,CO2積累量漸增，與x曲線對應(yīng)，基本類似S型曲線變化； 當(dāng)工藝和設(shè)備參數(shù)一定的情況下，CER與x有比例關(guān)系（CER菌體生長速率）； CO2濃度變化與O2濃度變化成反向同步關(guān)系。,CERdt，菌體干重的時間曲線 1- CERdt；2-菌量,（2）CO2對細(xì)胞的作用機(jī)制,“麻醉”作用 CO2及HCO3-都會影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜的流動性及表面電荷密度發(fā)生變化，導(dǎo)致許多基質(zhì)的跨膜運(yùn)輸受阻，影響了細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，使細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài)，細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變。,（3）CO2對菌體生長及產(chǎn)物形成的影響,CO2, 基質(zhì)

15、分解速率，ATP ，中間產(chǎn)物或形態(tài)變異導(dǎo)致產(chǎn)量 高濃度CO2抑制作用的獨(dú)立性: 只要CO2在培養(yǎng)液中濃度過量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能解除，這種負(fù)作用在放大過程更明顯。 正確評價通氣的作用： 供氧： 排廢氣： 水分及揮發(fā)性組分的散失,(2) 基質(zhì)濃度對產(chǎn)物合成的影響,低濃度限制 低水平誘導(dǎo) 高濃度抑制及分解阻遏作用 e.g.葡萄糖氧化酶發(fā)酵：葡萄糖用量從8%降至6%，補(bǔ)入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分別提高26%或6.7%。 谷氨酸發(fā)酵（乙醇為碳源）：當(dāng)乙醇濃度為2.5g/L和35g/L時，可延長谷氨酸生產(chǎn)時間，但在更高濃度下，菌體生長受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量降低。,泡沫的

16、不利影響 降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù) 增加了菌群的非均一性 增加了染菌機(jī)會 大量起泡引起“逃液”，導(dǎo)致產(chǎn)物的損失 泡沫嚴(yán)重時會影響通氣攪拌的正常進(jìn)行 消泡劑的加入將給提取工序帶來困難,1. 泡沫的產(chǎn)生及其影響,（1）機(jī)械消泡,原理：靠機(jī)械力引起強(qiáng)烈振動或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機(jī)械力將排出氣體中的液體加以分離回收。 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：不需引入外來物質(zhì)，可節(jié)省原材料，減少 污染機(jī)會，并可減少培養(yǎng)液性質(zhì)復(fù)雜化的程度。 缺點(diǎn)：不如化學(xué)消泡迅速可靠，需要一定的設(shè)備和消耗一定的動力；不能從根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素,（2）化學(xué)消泡,消泡機(jī)理 當(dāng)泡沫的表層存在著極性的表面活性物質(zhì)而形成雙電層時，可以加入一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度；或加入某些具有強(qiáng)極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭奪液膜上的空間，降低液膜強(qiáng)度，導(dǎo)致泡沫破裂。 當(dāng)泡沫的液膜具有較大的表面粘度時，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。,發(fā)