1、大腸桿菌高密度發(fā)酵,第二組 小組長：李青 小組成員：韓嬌月、李洋、馮春紅、胡建 貝、倪娜娜、常亞培、許志揚、李瑞兵、郭榮欣,1,學習交流PPT,目錄,2,學習交流PPT,大腸桿菌,大腸桿菌是基因工程中常用的宿主菌,許多有價值的多肽和蛋白在大腸桿菌中已成功地進行了表達,表達水平有些高達細胞總蛋白的30%以上. 大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,由于具有遺傳背景清楚,目的基因表達水平高,技術操作、培養(yǎng)條件簡單,抗污染能力強,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟等優(yōu)點,倍受遺傳工程專家重視,是目前應用最廣泛,最成功的表達體系.,3,學習交流PPT,高密度培養(yǎng)技術,高密度培養(yǎng)技術：是應用一定的培養(yǎng)技術和設備來提高菌體生物量和

2、目標產(chǎn)物時空產(chǎn)率的發(fā)酵技術。,4,學習交流PPT,利用一般的發(fā)酵工藝生產(chǎn)大腸桿菌或以其組建的基因工程菌的表達產(chǎn)物,大腸桿菌的生物量,表達產(chǎn)物在菌體內(nèi)和發(fā)酵液中的濃度比較低,難以獲得理想的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。應用高密度發(fā)酵不但可獲得較高的生物量,而且可顯著提高目的基因表達產(chǎn)物的濃度。高密度發(fā)酵對發(fā)酵設備有較高的要求,而且對發(fā)酵條件也有非常高的要求。影響高密度發(fā)酵的因素非常多,如細菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液的pH 值、補料方式及發(fā)酵液流變學特性等。,5,學習交流PPT,大腸桿菌高密度培養(yǎng)最關鍵的問題是代謝副產(chǎn)物乙酸積累所引起的抑制和毒害作用。 預防

3、措施： 1、通過控制比生長速率來減少乙酸的產(chǎn)生：比生長速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當比生長速率超過某個值時，乙酸開始產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^降低溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補料等方法來降低比生長速率。 2、透析培養(yǎng)：在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中可以用透析技術除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，降低乙酸含量從而實現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的表達。 3、控制葡萄糖的濃度：葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個較低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。,6,學習交流PPT,培養(yǎng)基選擇,LB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基) :胰蛋白胨5g,酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH調(diào)節(jié)pH7.0, 2L三角瓶裝

4、,滅菌鍋濕熱高壓滅菌121, 20min,室溫保存. TB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基) : 胰蛋白胨240g, 酵母粉480g, 甘油80g, 消泡劑1ml, 溶于H2O, 定容至19L,B. Braun發(fā)酵罐在位滅菌121, 15min.,7,學習交流PPT,培養(yǎng)基配制,配制種子固體培養(yǎng)基100mL ， 分裝試管， 0.1MPa 滅菌20min，然后擺成斜面。 配制種子培養(yǎng)液600mL，分裝50mL于一個250mL三角瓶中（作一級種子瓶），余下550mL平均分裝于三個500mL三角瓶中（作二級種子用），同上滅菌。,8,學習交流PPT,培養(yǎng)方式,微生物的培養(yǎng)方式主要有分批、連續(xù)和補料分批3種。大腸桿菌

5、發(fā)酵大多采用補料分批培養(yǎng)，這是在現(xiàn)代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過程中的化學環(huán)境。使微生物處于最佳的生長環(huán)境。這種方式一方面可以避免某些營養(yǎng)成分初始濃度過高出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面能夠防止限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成。補料分批培養(yǎng)已廣泛應用于各種各樣的初級、次級生物產(chǎn)品和蛋白等的發(fā)酵生產(chǎn)中。 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分過高會抑制細胞的生長，采用流加補料是提高細胞濃度和外源蛋白產(chǎn)量的有效方式，高密度培養(yǎng)通過調(diào)節(jié)限制性底物的流加速率來調(diào)控細胞生長。,9,學習交流PPT,培養(yǎng)條件,1、溫度：3638 2、pH： 7 3、攪拌速率：100200r/min 4、溶氧: 2

6、050% 5、通風：23L/min 6、接種量：12%,10,學習交流PPT,操作步驟,1、菌種準備 2、上罐前的準備及實罐滅菌 3、發(fā)酵操作 4、發(fā)酵管理 5、發(fā)酵過程中各生化指標的測定 6、補料 7、放罐 8、清洗,11,學習交流PPT,菌種準備,1、上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉(zhuǎn)接斜 面，37培養(yǎng)24h。 2、上罐前一天，由斜面菌種轉(zhuǎn)接一級種子 瓶， 37振蕩培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接二級 種子瓶， 37振蕩培養(yǎng)10h。,12,學習交流PPT,上罐前的準備及實罐滅菌,1、洗凈發(fā)酵罐及各聯(lián)接膠管 2、 配制發(fā)酵培養(yǎng)基5.0L，置發(fā)酵罐內(nèi)，加入幾滴泡敵。 3、校正pH電極和溶氧（DO）電極。 4、

7、把電極插口、取樣管、補料口、消泡劑料瓶等固定、密封好后，開夾套出、進水閥V2、W1，使夾套充滿水，用保護罩蓋住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護罩頂部排氣閥V4，啟動蒸氣發(fā)生器，啟動攪拌馬達，調(diào)轉(zhuǎn)速300r/min，開啟冷凝水出水閥V1，開啟蒸氣閥門S1，進行在位滅菌。,13,學習交流PPT,發(fā)酵罐,14,學習交流PPT,上罐前的準備及實罐滅菌,5、當保護罩頂部閥門V4有蒸氣排出時，2min后關閉閥門，當罐溫接近滅菌溫度時，微開閥V4適當排氣，并調(diào)整蒸氣閥S1維持罐溫。保溫結(jié)束后，關蒸氣閥S1，全開冷凝水出水閥V1，開進水閥W3，將溫度設定在37，切入自動。 6、當溫度降到100以下，緩

8、緩開排氣閥V4，使保護罩頂壓力表指示為零，移去保護罩。,15,學習交流PPT,上罐前的準備及實罐滅菌,7、連接通氣管路，將進氣過濾器K7口與控制臺左側(cè)空氣出口連通，開彈簧夾，接通空氣壓縮機電源， 對發(fā)酵罐進行通氣， 調(diào)整空氣流量3 5L/min。 8、當溫度達到37時，將預先滅菌的pH電極、DO電極（75%酒精消毒、UV消毒）接入發(fā)酵罐，連接各電極導線。,16,學習交流PPT,上罐前的準備及實罐滅菌,9、將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面板操作開關選擇堿泵，打開手動開關，使膠管內(nèi)充滿液體，將輸出上限設在15%，下限設為“0”，待一切準備就緒，將“手動”開關調(diào)節(jié)到“自動”狀態(tài)。 10、設定攪拌

9、轉(zhuǎn)速為300r/min、空氣流量 23L/min、pH7.0、DO100%，系統(tǒng)進入發(fā)酵狀態(tài)。,17,學習交流PPT,發(fā)酵操作,當發(fā)酵罐內(nèi)溫度達到并維持在所需溫度后，進行如下操作：1、取樣：松開彈簧夾J2，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，發(fā)酵液被壓入接料瓶，開J2、J3排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J2、J3 2、接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，點燃酒精棉，在火焰保護下，打開接種口，倒入二級種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種后立即進行第一次取樣，用于測定細菌OD值。,18,學習交流PPT,發(fā)酵管理,控制發(fā)酵過程的各項參數(shù)（溫度、P

10、H、溶解氧、攪拌速度、空氣流量、泡沫水平等），如參數(shù)出現(xiàn)異常現(xiàn)象，則應及時排除。 每小時取一次樣，每次取樣50ml。取樣時先將空氣流量計旋鈕調(diào)至01L/min，松開彈簧夾J2，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，發(fā)酵液被壓入量筒，當達到40mL，開J2排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J3、J2。將樣液入標記有取樣時間的三角瓶，用保鮮膜封口，立即入冰箱冷藏，取完樣要及時清洗量筒。 每次取樣前（每隔1小時）記錄發(fā)酵過程溫度、PH值、DO、通風、轉(zhuǎn)速的測定數(shù)值，并記錄操作情況。,19,學習交流PPT,發(fā)酵過程中各生化指標的測定,發(fā)酵過程中，雖然能自動控制溫

11、度和pH兩個重要條件，但仍需專人負責照看。完成下列工作： （1）經(jīng)常注意發(fā)酵罐運轉(zhuǎn)是否正常，檢查各控制參數(shù)是否在合適的范圍內(nèi)，遇有故障及時排除。 （2）每小時取樣測定細菌光密度值，進行革蘭氏染色及鏡檢，以了解菌生長情況及檢查是否有雜菌污染。 （3）隨著培養(yǎng)時間的延長，適當?shù)卣{(diào)節(jié)進氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，以維持一定的DO值。,20,學習交流PPT,發(fā)酵過程中各生化指標的測定,（4）定時取樣用裴林快速定糖法測定培養(yǎng)液中還原糖的含量。測定步驟如下： 發(fā)酵液中糖含量小于 4時，直接取發(fā)酵液 0.5 ml于錐形瓶中，若糖含量大于 4時，先稀釋10倍后，取稀釋液 0.5ml于錐形瓶中。 向錐形瓶加入裴林試劑甲液和

12、乙液各 5ml，混勻，加熱至沸騰。 用0.1標準葡萄糖液滴定至藍色消失，記錄消耗葡萄糖液的體積數(shù)（V）。 取0.5 ml蒸餾水于錐形瓶中，同法進行滴定，記錄消耗葡萄糖的體積數(shù)（V0）。 按下公式進行計算：(V0-V)x0.1/0.5x稀釋倍數(shù) V0 為葡萄糖滴定空白時消耗的毫升數(shù)。V為葡萄糖滴定樣品時消耗的毫升數(shù)。,21,學習交流PPT,發(fā)酵過程中各生化指標的測定,（5）定時取樣測定發(fā)酵液中氨基氮的含量，測定步驟如下： 取發(fā)酵液經(jīng)3500 rmin離心 10min。 分別吸取上清液 2.0 ml于兩個磨口具塞錐形瓶中，各加蒸餾水 5ml。向另一磨口具塞錐形瓶中加入 7 ml蒸餾水，作空白對照。

13、 向上述 3個瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml，混勻，加 0.5 溴麝香草酚蘭液 2滴和 0.5酚酞液4滴。 用標準 0.100molL NaOH溶液滴定至紫色，分別記錄消耗的NaOH液毫升數(shù)。 按下式計算: (V0-V)x1.4008 V為滴定發(fā)酵液時消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。V0 為滴定空白時消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。1.4008為 1ml 0.1molLNaOH溶液相當?shù)牡量藬?shù)，氨基氮的含量是每毫升中的含量。,22,學習交流PPT,發(fā)酵過程中各生化指標的測定,（6）測定OD值 大腸桿菌標準曲線的繪制：取10mL離心管，與105烘2h至恒重，用鑷子夾取入干燥器，待冷卻后于分析天平上稱重（

14、W0），精確到小數(shù)后4位，然后準確取10mL發(fā)酵液，于3000rpm離心10min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，與100烘至恒重，用鑷子夾取如干燥器中冷卻，于分析天平上稱重（W1），精確至小數(shù)后4位，得細胞干重為W1-W0。取同一發(fā)酵液，稀釋2、5、10、20、50倍，于600nm下測OD值。以0D值為縱坐標，菌液濃度（g/L）為橫坐標，繪制標準曲線。 均勻取樣品5mL于編號試管中，用空白發(fā)酵液稀釋至一定濃度，在721分光光度計上測定A600，根據(jù)菌體濃度與吸光度之間關系地標準曲線換算出菌體濃度。 其余發(fā)酵液于3，2000r/min條件下離心分離8min,上清液裝入編號三

15、角瓶，用于測糖。,23,學習交流PPT,發(fā)酵過程中各生化指標的測定,（7）當發(fā)酵到一定時候，光密度值達到11.5，發(fā)酵液中還原糖和氨基氮含量較低時，開始補料，并在發(fā)酵結(jié)束前一小時終止。 （8）每小時記錄發(fā)酵過程溫度、pH和DO的測定數(shù)值，并記錄操作情況。,24,學習交流PPT,大腸桿菌流加發(fā)酵策略,大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時最關鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴重抑制細胞生長和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，即使葡萄糖濃度只有0.250.5 g/L，大腸桿菌仍會產(chǎn)生乙酸。因此，高細胞密度發(fā)酵

16、所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應器中底物濃度處于較低的水平。營養(yǎng)物最好以它們的消耗速率加入反應器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細胞處于饑餓狀態(tài)。,25,學習交流PPT,補料方式,采用簡單反饋控制補料，又稱單一循環(huán)法，此法控制與營養(yǎng)物利用相偶聯(lián)的pH或溶解氧濃度等參數(shù),使之保持恒定。例如,預先設定pH恒定值,發(fā)酵中菌體代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)或銨,使pH值發(fā)生改變,從而啟動控制開關,開始補料,pH恢復至恒定值以溶解氧濃度作為補料開關則是根據(jù)培養(yǎng)基中某種關鍵營養(yǎng)物(主要是碳源)消耗,會導致溶解氧濃度迅速改變。,26,學習交流PPT,溶氧控制的分批補料培養(yǎng),控制的幾個關鍵

17、參數(shù)如下： 1、溫度：培養(yǎng)溫度為37 。 2、pH：自動流加30%的氨水，使PH保持 在7.0左右。 3、葡萄糖的流加：根據(jù)發(fā)酵的實際經(jīng)驗，流加補料分三個階段進行，發(fā)酵過程中04h不加補料，410h補加含50g葡萄糖的補料，1020h加入含190g葡萄糖的補料，誘導前0.5h追加100ml補料。,27,學習交流PPT,放罐,發(fā)酵8小時后，測OD值及還原糖量，當發(fā)酵液的PH不斷上升且為堿性、OD值增長緩慢，且還原糖量很低時，可判斷發(fā)酵結(jié)束，準備放罐。 放罐操作同取樣。將全部發(fā)酵液取出后，100煮沸10分鐘滅菌，滅完菌的發(fā)酵液可排放入下水道。,28,學習交流PPT,清洗,放罐完畢后，打開自來水進水

18、口，往發(fā)酵罐中注滿水，同時開動攪拌軸攪動清洗五分鐘，排水。 再次注入自來水清洗，操作如1。 清洗結(jié)束，關閉電源。,29,學習交流PPT,注意事項,首先，補料速率與比生長速率直接影響著乙酸的生成速率和積累量（主要是補料速率與比生長速率影響發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，進而影響），所以適當?shù)目刂蒲a料速率和比生長速率，對于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必須要保證充足的溶氧，并嚴格控制pH值，而且補酸堿的速率盡量緩和，不能太快；溫度對于蛋白的表達也有很重要的影響，較低的發(fā)酵溫度下所生產(chǎn)出的蛋白大多是有活性的，而較高的發(fā)酵溫度下產(chǎn)生的蛋白大多一包涵體形式存在。 第三，選取合理的誘導時間非常重要，一般的誘導時間選在指數(shù)生長后期，而且誘導時的比生長速率最好能控制在0.2之內(nèi)。,30,