1、基因工程原理,Principle of Gene Engineering 楊紅,第四章,第四章 目的基因的分離與修飾,第一節(jié)基因的基本結(jié)構(gòu)特征 第二節(jié) 基因組文庫(kù) 第三節(jié) 目的基因的分離與制備 第四節(jié) 基因突變與修飾,一個(gè)能轉(zhuǎn)錄、翻譯的結(jié)構(gòu)基因依次包括：,轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū) 核糖體識(shí)別區(qū) 編碼區(qū) 轉(zhuǎn)錄終止區(qū),起始密碼子ATG 開放閱讀框 終止密碼子（TAG、TAA、TGA）,第一節(jié) 基因的基本結(jié)構(gòu)特征,一、原核生物基因的組成,基因區(qū) 啟動(dòng)區(qū) SD區(qū) 轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子,原核生物基因啟動(dòng)區(qū)的結(jié)構(gòu),乳糖操縱子模型,二、真核生物基因的組成,基因區(qū) 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū) 轉(zhuǎn)錄區(qū),三、其它基因組的基因組成,編碼區(qū) 啟動(dòng)

2、子 終止子,質(zhì)?；?病毒（噬菌體）基因：多順?lè)醋印⒅丿B基因、內(nèi)含子,線粒體基因：多順?lè)醋?葉綠體基因：多順?lè)醋?四、基因的排列,重疊基因：是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。,重復(fù)基因：重復(fù)基因指染色體上存在多數(shù)拷貝基因，重復(fù)基因往往是生命活動(dòng)最基本，最重要的功能相關(guān)的基因。,加倍基因,基因重排：基因的可變區(qū)通過(guò)基因的轉(zhuǎn)座、DNA的斷裂錯(cuò)接而使正?；蝽樞虬l(fā)生改變的現(xiàn)象。尤指在B細(xì)胞分化過(guò)程中抗體基因的重排及T細(xì)胞抗原受體基因的重排，是基因差別表達(dá)的一種調(diào)控方式。,第二節(jié) 基因組文庫(kù),基因組文庫(kù)（DNA文庫(kù)）：某種生物的基因組DN

3、A通過(guò)克隆載體儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌的群體之中，這個(gè)群體即為這種生物的DNA文庫(kù)。 cDNA文庫(kù)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這個(gè)群體叫cDNA文庫(kù)。,基因文庫(kù)（gene library) 某種生物的全部遺傳信息通過(guò)克隆載體儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌的群體之中，這個(gè)群體即為這種生物的基因文庫(kù)。,1. 基因組文庫(kù)的大小 是指文庫(kù)中的克隆子數(shù)量。,例如：某生物基因組的總長(zhǎng)3106kb，酶切后DNA平均長(zhǎng)15kb，則其基因組文庫(kù)的克隆子數(shù)為： 3106kb/ 15kb=2 105個(gè),一、原核生物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,1976年，Clar

4、k等提出估算克隆子數(shù)的公式。 N=ln（1-P）/ ln（1-f） N：基因組文庫(kù)必需的克隆數(shù)目 P：文庫(kù)中目的基因出現(xiàn)的概率（99%） f：插入片段大小于基因組大小的比值 例如上面例子： N=ln（1-0.99）/ ln（1-15/ 3106）= 9105個(gè),為了保證基因組文庫(kù)具有代表性，一般構(gòu)建基因組文庫(kù)的實(shí)際克隆子數(shù)應(yīng)該比上述計(jì)算值大23倍,與基因組大小成正比 與克隆的DNA片段大小成反比 與載體的容量有關(guān)： 某一生物如果用質(zhì)粒作載體需要900萬(wàn)個(gè)克隆， 用噬菌體需要90萬(wàn)個(gè)克隆， 用cosmid作載體需要35萬(wàn)個(gè)克隆。,2. 用于構(gòu)建DNA文庫(kù)的克隆載體,EMBL系列、 DASH、 2

5、001等 優(yōu)點(diǎn)： 載體雙臂DNA序列已經(jīng)確定 有易于篩選的遺傳標(biāo)記 EMBL和2001有Spi-標(biāo)記 易于從重組噬菌體中回收插入的外源片段。,（1）制備基因組DNA并片段化,3. 構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本步驟,提取總基因組DNA 切割：機(jī)械方法、 RE法、識(shí)別序列4位點(diǎn) 回收：電泳、梯度離心,（2）DNA片段與載體重組連接,+,4. 原核生物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,二、真核生物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,1. 構(gòu)建噬菌體基因組文庫(kù),2. 用Cosmid構(gòu)建基因組文庫(kù),3. 構(gòu)建酵母人工染色體基因組文庫(kù),三、 cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建,從基因組分離基因難度大： 基因以單拷貝形式存在，占染色體DNA的10-510 7；

6、 真核染色體DNA大，難定位基因； 真核生物基因有內(nèi)含子，在原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)沒(méi)有加工功能。,1. cDNA文庫(kù)的概念,某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這個(gè)群體叫cDNA文庫(kù)。,表達(dá)型cDNA文庫(kù)：直接檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)，篩選重組克隆，不知道目的基因序列和蛋白氨基酸序列。 非表達(dá)型cDNA文庫(kù)：已知目的基因序列或蛋白氨基酸序列，可以通過(guò)雜交篩選。,2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,（1）分離細(xì)胞總RNA，并從總RNA中分離純化出mRNA,總RNA包括：,rRNA（80-85%） tRNA（10-15%） mRNA（1-5%,

7、總RNA的提取： 與DNA的提取相似。 沉淀細(xì)胞裂解細(xì)胞離心去殘?jiān)锨逡撼鞍壮恋鞷NA。,mRNA的純化 Poly（A）RNA的分離 柱層析Oligo（dT）,mRNA分級(jí)： 梯度離心，電泳， mRNA轉(zhuǎn)譯活性鑒定 無(wú)細(xì)胞體系（兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物） 蛙卵系統(tǒng)（非洲爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng)）,Oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成,mRNA-cDNA,（2）以mRNA分子為模版，合成cDNA第一鏈,（3） 雙鏈cDNA的合成, 大腸桿菌RNaseH媒介取代法, Oligo（dG）寡聚引物引導(dǎo)法合成雙鏈DNA, PCR法,（4） 將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒或噬菌體載體上，導(dǎo)入大腸桿菌增殖, 以質(zhì)粒為載

8、體構(gòu)建cDNA文庫(kù)： 重組子鑒定、文庫(kù)擴(kuò)增方便?？寺⌒实汀?末端轉(zhuǎn)移酶,dGTP, 以噬菌體為載體構(gòu)建cDNA文庫(kù) 克隆效率高，重組子鑒定、文庫(kù)擴(kuò)增繁瑣。, mRNA豐度與cDNA文庫(kù)大小的關(guān)系,cDNA文庫(kù)大小的理論估算：,例如：細(xì)胞總mRNA數(shù)為500500個(gè)， 豐度為3500拷貝/細(xì)胞的基因，其cDNA文庫(kù)應(yīng)為：500500/3500=143個(gè)克??； 豐度為14拷貝/細(xì)胞的基因，其cDNA文庫(kù)應(yīng)為：500500/14=35750個(gè)克隆；,N：cDNA基因組文庫(kù)必需的克隆數(shù)目 P：文庫(kù)中目的基因出現(xiàn)的概率（99%） f：mRNA豐度與總mRNA比值,實(shí)際cDNA基因文庫(kù)大小： N=ln（

9、1-P）/ ln（1-f）,例如，豐度3500時(shí)，N是650個(gè)。 N=ln（1-0.99）/ ln（1-3500/ 500500）= 650個(gè),4. cDNA克隆的優(yōu)越性,cDNA克隆適合RNA病毒的研究 cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行 目的基因篩選的假陽(yáng)性率低 可以克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因 用于mRNA的結(jié)構(gòu)和功能的研究,第三節(jié) 目的基因的分離與制備,基因文庫(kù)分離法 PCR擴(kuò)增法 差式分析法 DNA插入誘變法 基因定位克隆 標(biāo)簽測(cè)序法 化學(xué)合成法,一、從基因文庫(kù)中篩選分離目的基因,1. 制備核酸探針進(jìn)行雜交篩選,制備猜測(cè)體探針： 根據(jù)已知氨基酸順序人工合成探針。 探針的特異性：長(zhǎng)度不小于17-

10、20bp（6個(gè)以上連續(xù)氨基酸順序） 遺傳密碼的簡(jiǎn)并性：一組探針，導(dǎo)致假陽(yáng)性。,將已知蛋白作為抗原，從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選。 cDNA應(yīng)克隆在表達(dá)載體中 一般以融合形式表達(dá)目的基因 考慮cDNA表達(dá)的方向性 Western blotting方法,2. 制備抗體進(jìn)行免疫雜交篩選,disulfide bridges,抗原-抗體免疫反應(yīng),必須在特異性蛋白純化后應(yīng)用 某些基因的表達(dá)量很少，難以純化 有些基因沒(méi)有蛋白產(chǎn)物 不同發(fā)育階段、不同環(huán)境下蛋白不同 遺傳密碼簡(jiǎn)并性導(dǎo)致正確探針的難度。,利用被克隆DNA片段與寄主細(xì)胞染色體DNA在功能上的同源互補(bǔ)性篩選目的基因。 例如：大腸桿菌His缺陷型寄主細(xì)胞，

11、原因之一是吲哆甘油磷酸脫氫酶基因突變。利用這特點(diǎn)，篩選面包酵母吲哆甘油磷酸脫氫酶基因。,3. 功能互補(bǔ)法克隆基因,4. 利用PCR技術(shù)篩選基因文庫(kù),5. 利用噬菌體表面顯示技術(shù)分離目的cDNA克隆,噬菌體表面顯示技術(shù)：也稱噬菌體展示技術(shù)，將外源蛋白質(zhì)或多肽的基因插入到絲狀噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因的信號(hào)肽后，與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)，展示在噬菌體顆粒的表面，借助于固體基質(zhì)上附著的抗體、受體等分子與靶分子的親和力，篩選目的蛋白。,是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種重要方法。,. 利用酵母雙雜合系統(tǒng)分離目的cDNA克隆,酵母雙雜交技術(shù)原理,利用轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的特性而建立的。,GAL4,GAL4由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域

12、組成：,N端的DNA結(jié)合域(DB) C端的轉(zhuǎn)錄激活域(AD),酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用是細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即不需提純蛋白便可研究蛋白的相互作用，消除了提純過(guò)程引起的蛋白變性，因而研究的是有生物活性的蛋白與蛋白之間的相互作用，反映了體內(nèi)的真實(shí)作用情況。,大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)的局限性 酵母雙雜交篩系統(tǒng)雖因其優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于研究蛋白質(zhì)相互作用，但也有其自身固有的缺點(diǎn)，如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果處理和分析時(shí)都要考慮的假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題。,假陰性產(chǎn)生的原因 細(xì)胞定位特性出現(xiàn)假陰性結(jié)果：分泌蛋白難以檢測(cè)； 蛋白未能正確修飾和折疊； 有的蛋白對(duì)酵母菌株有毒性或抑制菌株生長(zhǎng), BD-X的自激活作用； 一些AD-Y

13、融合蛋白中的Y可能結(jié)合BD或啟動(dòng)子附近序列或蛋白，并能激活轉(zhuǎn)錄； BD-X與AD-Y并非通過(guò)BD-XY-AD直接激活轉(zhuǎn)錄，而是通過(guò)第3種蛋白或多蛋白的復(fù)合體把X、Y募集到一起，然后激活轉(zhuǎn)錄； 非特異BD-XY-AD相互作用，因?yàn)橛械牡鞍妆砻婢哂谐纱氐氖杷被峄蚱渌梢餢、Y非特異作用的結(jié)構(gòu)；,假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因,二、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR技術(shù)的基本原理：,1. 套式PCR技術(shù)(nested PCR),巢式PCR（nested PCR），是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對(duì)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第

14、二輪擴(kuò)增。,2. 反向PCR技術(shù)(inverse PCR),未知序列,已知序列,3. 錨定PCR (anchored PCR),RACE: rapid amplification of cDNA,是以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈,然后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出從某個(gè)特定為點(diǎn)到3和5端之間的未知核苷酸序列,對(duì)應(yīng)成為3RACE和5RACE.,Oligo(dT)n,錨定引物,4. 不對(duì)稱PCR (asymmetric PCR) 5. 長(zhǎng)程PCR(long and accurated PCR, LA PCR) 6. 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 7. Alu PCR,三、利用差式分析法分離目的

15、基因克隆,1. mRNA 差別顯示技術(shù)（DD-PCR）,mRNA 差別顯示技術(shù)的原理和基本程序,. 代表性差別分析技術(shù),（） 傳統(tǒng)的減法雜交技術(shù),從表達(dá)目的基因的組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與無(wú)目的基因表達(dá)的組織中提取的mRNA雜交形成cDNA-mRNA雙鏈分子，通過(guò)層析去掉雜交分子后，留下的單鏈cDNA中含有目的基因。,逆轉(zhuǎn)錄,無(wú)目的基因表達(dá)的組織中提取的mRNA,表達(dá)目的基因組織中提取的mRNA,（） 基因組DNA的代表性差別分析技術(shù),（） cDNA RDA, 抑制性減法雜交技術(shù)（SSH）,四、 DNA插入誘變分離目的基因,1. 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法,. T-DNA標(biāo)簽法,五、 應(yīng)用基因

16、定位克隆技術(shù)分離篩選目的基因,1. 基因定位克隆的基本步驟,. 染色體步查法分離目的基因（chromosome walking）,六、 標(biāo)簽測(cè)序法分離目的基因,1. 表達(dá)序列標(biāo)簽法（EST）,是指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其它基因的差異，長(zhǎng)度為100-500bp。,. 基因表達(dá)序列分析法（SAGE）：（1）從轉(zhuǎn)錄物某一特定位置上分離得到一段9-10kb的寡核苷酸引物，該引物含有確定一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息，可以代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性；（2）多個(gè)序列標(biāo)簽?zāi)芤藻^定酶識(shí)別為點(diǎn)序列相隔連成雙標(biāo)簽序列的多聯(lián)體。,生物素-oligo(dT),七、基因的酶法合成,第四節(jié)基因的突變與修飾,一、隨機(jī)誘變,1. 盒式誘變（cassette mutagenesis）,