1、第六節(jié)植物細(xì)胞的選育與改良,篩選、誘變 原生質(zhì)體融合、基因重組,CELL,Company Logo,為什么進(jìn)行植物細(xì)胞的篩選?,植物細(xì)胞往往不均一，會顯示出不同的特性，需要將具有優(yōu)良特性的細(xì)胞選擇出來。 植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會發(fā)生變異，通過篩選將有利的變異細(xì)胞選出，而把不利的變異細(xì)胞去除。 誘變獲得的突變體，通過原生質(zhì)體融合獲得的融合子和通過基因重組獲得的工程細(xì)胞,Company Logo,自發(fā)突變,體細(xì)胞無性系變異：植物細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中往往發(fā)生不可期的突變，且突變性狀可以穩(wěn)定遺傳。 其變異可發(fā)生在單基因控制的性狀上，也可以發(fā)生在多基因控制的性狀上，而且可同時發(fā)生在胞質(zhì)基因和核基因控制的性

2、狀上。 染色體數(shù)目發(fā)生改變，或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?nèi)缛旧w易位、缺失、倒位、點突變等。 造成這些改變的原因，普遍認(rèn)為是由培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分尤其是激素如2，4-D、細(xì)胞分裂素引起的。 自發(fā)突變的頻率約為10-810-5 變異的類型(從表型上)主要表現(xiàn)在：生長習(xí)性、株高、主莖長、主枝數(shù)、產(chǎn)量、花色、抗除草劑、抗旱、抗鹽、抗寒、代謝產(chǎn)物突變、抗病、抗蟲,Company Logo,誘發(fā)突變,提高突變頻率到10-3 物理法和化學(xué)法 ：X射線、射線、紫外線、中子、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基脲等。,Company Logo,植物細(xì)胞突變體的應(yīng)用,為細(xì)胞雜交和基因?qū)胩峁┻x擇標(biāo)記如攜帶標(biāo)記基因Gus的細(xì)胞

3、系 細(xì)胞、分子水平的遺傳和代謝研究 對農(nóng)作物性狀進(jìn)行遺傳改良 提高植物細(xì)胞中有用代謝產(chǎn)物的含量 從組織水平和細(xì)胞水平上篩選突變體，較之整體植物有許多優(yōu)點,植物細(xì)胞篩選的方法,小細(xì)胞團(tuán)篩選法 選擇壓力篩選法,CELL,Company Logo,小細(xì)胞團(tuán)篩選法,制備得到單細(xì)胞，在常規(guī)的培養(yǎng)基中經(jīng)過單細(xì)胞培養(yǎng)，形成細(xì)胞團(tuán)，通過觀測細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)、顏色或者測定細(xì)胞代謝物的種類和含量，從而選出所需的細(xì)胞。 實例 篩選花色苷含量高的玫瑰茄細(xì)胞,Company Logo,選擇壓力篩選法,通過添加某些對不同的細(xì)胞有不同作用效果的物質(zhì)，淘汰部分敏感細(xì)胞，而選擇得到所需的細(xì)胞。 正選擇：把受選擇的細(xì)胞群體置于一定的

4、選擇壓力之下，部分細(xì)胞在選擇壓力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗選擇壓力的細(xì)胞可以生長，從而選擇得到所需的細(xì)胞。 一步和多步選擇 NaCl為選擇劑選擇耐鹽突變體 以除草劑為選擇劑選擇抗除草劑突變體 負(fù)選擇：選擇的對象是在一定選擇壓力的作用下不能生長的那些細(xì)胞，而能夠生長的細(xì)胞受到淘汰。 適用于對營養(yǎng)缺陷型突變體的選擇。,Company Logo,選擇壓力篩選法,直接選擇：所用的選擇壓力正是以后在整體植株水平上突變表現(xiàn)型的作用對象。 實例：抗性突變體的選擇，用生長抑制劑如抗生素、代謝類似物、某些金屬及非金屬離子等，來分離培養(yǎng)植物細(xì)胞，從中選擇對生長抑制劑具有抗性的突變細(xì)胞，關(guān)鍵是對生長抑制劑濃度

5、的選擇。 間接選擇：選擇壓力不是突變表現(xiàn)型對其直接表現(xiàn)抗性的物質(zhì)。 實例：營養(yǎng)缺陷突變體、溫度敏感型突變體及抗旱細(xì)胞突變體等的篩選,Company Logo,影響細(xì)胞篩選效果的因素,親本材料對篩選效果的影響 培養(yǎng)方式對細(xì)胞篩選效果的影響 愈傷組織培養(yǎng)：生長速率比較慢；并非所有的細(xì)胞都能與培養(yǎng)基直接接觸；細(xì)胞之間的接觸相當(dāng)緊密； 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：以大小不一的細(xì)胞團(tuán)形式存在；釋放的有毒物的影響較大； 原生質(zhì)體培養(yǎng)：分離和培養(yǎng)技術(shù)還不完善； 細(xì)胞生長速度對細(xì)胞篩選效果的影響 選擇壓力的施加方式對細(xì)胞篩選效果的影響 一次性施加和逐步施加,植物細(xì)胞的誘變,物理誘變 化學(xué)誘變,CELL,Company Lo

6、go,誘變的概念、形式,誘變：指通過各種誘變劑的作用，使細(xì)胞發(fā)生變異的過程，是獲得優(yōu)良植物細(xì)胞的有效方法之一。 物理誘變劑包括X射線、射線、中子、a粒子、粒子、紫外線等。紫外線的能量較低，不能引起被照射物質(zhì)的離子化，因而叫做非電離誘變因子；其余的物理誘變劑均能引起被照射物質(zhì)的離子化，稱為電離誘變因子。 化學(xué)誘變劑的種類較多，根據(jù)對DNA的作用特點，主要分三類，包括堿基類似物、烷化劑、疊氮化合物。 誘發(fā)配對錯誤/誘發(fā)染色體斷裂/改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu),Company Logo,如何進(jìn)行誘變,誘變的基本過程：單細(xì)胞制備、預(yù)培養(yǎng)、誘發(fā)突變、突變細(xì)胞株的選擇 誘發(fā)突變一般采用平板培養(yǎng)法，并在培養(yǎng)基中加入

7、某種選擇因子，長時間飼喂培養(yǎng)植物細(xì)胞，使其發(fā)生擬定目標(biāo)的突變。 一般認(rèn)為所得到的突變體只有滿足以下條件，才能表明已發(fā)生真實的突變： 離開選擇壓后變異表型保持穩(wěn)定； 突變體中具有相應(yīng)變化了的基因產(chǎn)物或生理生化代謝上的差異； 變異表型能夠通過有性繁殖遺傳，其中變異的性狀遺傳穩(wěn)定性是鑒定突變體最為可靠的標(biāo)準(zhǔn)，,Company Logo,植物細(xì)胞誘變實例,對氨基酸和氨基酸類似物抗性的選擇 抗病細(xì)胞突變體的選擇 抗除草劑細(xì)胞突變體的選擇 植物抗鹽細(xì)胞突變體的選擇 抗低溫(或高溫)突變體和抗旱突變體 (抗逆境) 高光效突變體/營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞突變體的選擇,植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合,CELL,Company Lo

8、go,葉肉原生質(zhì)體分離純化,Company Logo,純化后的葉肉原生質(zhì)體,Company Logo,過程示意圖,Company Logo,原生質(zhì)體融合的方式,自體融合：指發(fā)生在同一個親本原生質(zhì)體之間的融合，結(jié)果得到“同核體”。 異體融合是指由不同種的雙親原生質(zhì)體發(fā)生融合，結(jié)果得到“異核體”。,Company Logo,原生質(zhì)體融合的產(chǎn)物 I,對稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體（包括核和質(zhì)）完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥，雜種的體細(xì)胞染色體數(shù)目為雙親之和。 不對稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體發(fā)生部分融合，或發(fā)生了融合，但融合體在分裂過程中一方的部分核或質(zhì)被排斥，因而其體細(xì)胞染色體數(shù)目達(dá)不到雙親之和。 細(xì)

9、胞質(zhì)雜種：兩種來源不同的核外遺傳成分（細(xì)胞器）與一個特定的核基因組結(jié)合在一起。 非對稱融合技術(shù)已經(jīng)成為主要的融合方式，方法主要是用射線照射供體的原生質(zhì)體，鈍化其細(xì)胞核，再和受體原生質(zhì)體融合。,Company Logo,原生質(zhì)體融合的產(chǎn)物 II,諧和的細(xì)胞雜種：具有雙親的全套染色體組，形成異源雙二倍體。 部分諧和的細(xì)胞雜種：原生質(zhì)體融合時，雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，而這種排斥是非完全性的，但仍可發(fā)生少量染色體組的重組，然后進(jìn)入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株。 異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種：異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種除了含本種之一的細(xì)胞核外，還含有異種的細(xì)胞質(zhì)。 嵌合細(xì)胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融

10、合和胞質(zhì)融合后，尚未發(fā)生核融合。雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最終形成嵌合體植物。,Company Logo,異核體或雜種細(xì)胞的選擇,必須設(shè)計或建立一種體系，優(yōu)先選擇細(xì)胞雜種。即這種體系只允許異核細(xì)胞存活，淘汰雙親同核體。這種體系除能早期發(fā)生異核體外，還能促進(jìn)異核體細(xì)胞的分裂和分化。,Company Logo,選擇方法,根據(jù)物理特性的差異進(jìn)行選擇 可見標(biāo)記法：利用親本雙方原生質(zhì)體的物理性狀，如大小、顏色與漂浮密度等的差別作為選擇依據(jù)。自動細(xì)胞分檢儀的應(yīng)用可以準(zhǔn)確迅速將雜種細(xì)胞分開，提高了選擇效率。 熒光標(biāo)記法：對于形態(tài)上彼此無法區(qū)分的原生質(zhì)體融合形成的異核體來說，可將兩種原生質(zhì)體

11、群體分別用不同的熒光染料標(biāo)記，然后通過熒光顯微鏡檢測和鑒別異核體。 根據(jù)生長特性的差異進(jìn)行選擇 利用親本雙方在培養(yǎng)基上的分裂分化性能不同，來淘汰一方的原生質(zhì)體，然后再將雜種細(xì)胞與親本細(xì)胞分開。 利用突變細(xì)胞系的互補(bǔ)來選擇 基于親本雙方遺傳和生理的互補(bǔ)作用來選擇雜種。雜種細(xì)胞由于結(jié)合了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，具有正常的代謝途徑或能在篩選培養(yǎng)基生長增殖，而親本細(xì)胞由于某些生理或遺傳上的缺陷而不能生長，從而達(dá)到雜種細(xì)胞篩選的目的。常用的互補(bǔ)選擇主要包括葉綠素缺失互補(bǔ)、營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)、抗性互補(bǔ)和遺傳互補(bǔ)等。,Company Logo,雜種細(xì)胞的培養(yǎng)及再生,抓住時機(jī)，及時把它轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使其

12、恢復(fù)分化能力，誘導(dǎo)它分化出胚、苗和根，并長成完整的雜種植物。 可以參照原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。由于除去了細(xì)胞壁，培養(yǎng)基中必須有一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑來保持雜種細(xì)胞的穩(wěn)定。 培養(yǎng)方法有液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和固液混合培養(yǎng)。常用液體培養(yǎng)，包括微滴培養(yǎng)和淺層培養(yǎng)。 原生質(zhì)體融合雜種細(xì)胞在適合的培養(yǎng)條件下，首先形成細(xì)胞壁，然后進(jìn)行分裂，進(jìn)而形成愈傷組織。,Company Logo,雜種細(xì)胞或雜種植株的鑒定,形態(tài)學(xué)指標(biāo) 細(xì)胞學(xué)指標(biāo)：核型（染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等）和帶型（帶、帶、帶等）分析 生化指標(biāo)：同功酶譜分析，如酯酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等的同功酶；二磷酸核酮糖羧化酶分析

13、和葉綠素DNA、線粒體DNA、核DNA的分析，采用5S rDNA間隔序列差異分析、Southern雜交、原位雜交和RFLP圖譜分析。 限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（RFLP） RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA。,Company Logo,馬鈴薯原生質(zhì)體再生植株,Company Logo,白菜,甘藍(lán),白菜甘藍(lán),應(yīng)用,植物細(xì)胞的基因重組與轉(zhuǎn)移,外源基因的獲取、載體的制備、基因的體外重組、基因的轉(zhuǎn)移和外源基因的表達(dá),CELL,Company Logo,植物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的方法,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 直接轉(zhuǎn)化法 基因槍法 電激法 顯微注射法 脂質(zhì)

14、體介導(dǎo)法 病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)法,Company Logo,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,利用農(nóng)桿菌（Agrobacterium）的Ti或Ri質(zhì)粒攜帶外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞（組織、器官或植株）的過程稱為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。 植物細(xì)胞、組織、器官共培養(yǎng)法：該方法是以賀斯克（Horsch）等人1985年建立的葉盤法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的，是雙子葉植物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的較為常用的簡單有效的方法。 植株感染法：一般采用種子實生苗或試管苗作為外植體,在整體植株上造成創(chuàng)傷,然后把農(nóng)桿菌接種于創(chuàng)傷面上,或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植物體內(nèi),使其進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化。 原生質(zhì)體共培養(yǎng)法：是指將處于再生壁時期的原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌一起共培養(yǎng)。,Company L

15、ogo,直接轉(zhuǎn)化法,直接轉(zhuǎn)化法：即用裸露的DNA經(jīng)特殊處理后，直接轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞和原生質(zhì)體中，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的技術(shù)。 基因槍法：是由克雷因（Klein）等在1987年建立的基因?qū)敕椒?。其原理是將DNA包裹于微小的金屬鎢或金粒的表面，在高壓下使金屬顆粒噴射，高速穿透受體細(xì)胞或組織，使外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞核并整合表達(dá)的過程。 化學(xué)藥劑誘導(dǎo)法：植物的原生質(zhì)體在沒有載體的情況下，借助一些化學(xué)試劑的誘導(dǎo)能夠吸收外源DNA、質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)，并有可能整合到植物細(xì)胞染色體中去。 電激法（electroporation）：又稱電穿孔法，是在高壓電脈沖作用下在新鮮分離的原生質(zhì)體的質(zhì)膜上形成可逆性的瞬間通道，從而發(fā)

16、生外源DNA的攝取。 顯微注射法（microinjeceion）：這是利用特制的顯微注射儀將外源遺傳物質(zhì)注入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。 低能離子束法（Ionimplantation）/激光束法,Company Logo,其他方法,花粉管通道轉(zhuǎn)化法：利用開花植物授粉后形成的花粉管通道，在植物開花以后，去除柱頭，直接利用外源的DNA進(jìn)行涂抹，使外源的DNA借助業(yè)已形成的花粉管通道轉(zhuǎn)入卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)法,Company Logo,轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的篩選與檢測,負(fù)向篩選體系 負(fù)向篩選體系使植物產(chǎn)生抗性的機(jī)理是它對抗生素類，除草劑類或其它類似物具有解毒

17、作用，使其變?yōu)榻舛镜目股氐难苌?，從而使轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞對抗生素等不敏感，而未轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞對抗生素等敏感而被殺死。這些使用除草劑和抗生素作為選擇性物質(zhì)的篩選體系雖然目前應(yīng)用的比較廣泛，但是選擇性標(biāo)記基因與目的的基因并無關(guān)系，對植物有負(fù)面影響，它的使用和釋放也給環(huán)保帶來了一些問題。而且由于抗生素和除草劑等的毒性作用導(dǎo)致植物的轉(zhuǎn)化和再生頻率很低。,Company Logo,抗生素類篩選體系,卡那霉素篩選體系：應(yīng)用最廣泛的選擇體系，它是用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 （NPT）基因作為選擇標(biāo)記基因，用卡那霉素、新霉素和G418作為選擇性物質(zhì)加入培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。 潮霉素篩選體系：在植物轉(zhuǎn)化中使用的另一個編碼解毒蛋

18、白的基因是來自大腸桿菌的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）。 鏈霉素和壯觀霉素篩選體系/慶大霉素篩選體系 博來霉素篩選體系/氯霉素(chlorampenicol)的篩選體系 其它抗生素類篩選體系有抗膦絲菌素(phosphinothricin)的磷絲菌素篩選體系等。,Company Logo,除草劑類篩選體系,磺胺類篩選體系 EPSPS篩選體系：將細(xì)菌的5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate合成酶(EPSPS)基因轉(zhuǎn)入高等植物的葉綠體，在轉(zhuǎn)基因植株中獲得一種除草劑（Glyphosate）的抗性。 雙丙氨酸草甘膦篩選體系 綠磺隆類篩選體系,Company Logo,正向篩

19、選體系,正向篩選體系中的選擇劑兼具兩種功效，首先，由于轉(zhuǎn)化體細(xì)胞含有編碼可以利用這種選擇劑的基因，所以轉(zhuǎn)化體細(xì)胞可以利用這種選擇劑進(jìn)行新陳代謝，促進(jìn)轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的生長；其次，選擇劑還可以用來篩選轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體細(xì)胞由于利用了這種物質(zhì)而生長較快，生長旺盛，然而非轉(zhuǎn)化體由于不能利用這種選擇劑而生長緩慢或受到抑制，從而可以篩選出轉(zhuǎn)化體。這種正向篩選體系可以大大提高植物轉(zhuǎn)基因中轉(zhuǎn)化頻率和再生頻率低的難題，為加速植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程提供了有效的工具。,Company Logo,GUS篩選體系,將葡糖苷酸酶（-glucurouidase， GUS)基因，連同于目的基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中GUS基因能

20、激活惰性細(xì)胞激動素(芐基腺嘌呤N-3葡糖苷酸)，使其變成活性的細(xì)胞激動素(芐基腺嘌呤)，芐基腺嘌呤能夠刺激轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的再生和生長，而非轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞由于不含GUS基因則不能利用芐基腺嘌呤N-3葡糖苷酸，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由于這種新陳代謝的優(yōu)越性，所以生長旺盛，而非轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞則生長緩慢，從而達(dá)到篩選的目的，而且選擇劑(芐基腺漂呤N-3葡糖苷酸)對植物細(xì)胞無任何不利影響。,Company Logo,其它篩選體系,甘露糖篩選體系 木糖篩選體系 氨甲喋呤抗性基因的檢測 冠癭堿合成酶基因篩選體系 熒光素酶基因篩選體系 PCR檢測 點雜交和DNA雜交/Southern雜交 RNA雜交/Northern雜交 蛋

21、白質(zhì)雜交/Western雜交,第七節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,各種代謝產(chǎn)物,LOGO,植物細(xì)胞培養(yǎng)得到的常見次級代謝物,LOGO,1、植物細(xì)胞次級代謝物生物合成的簡要途徑,LOGO,次級代謝物生物合成的基本途徑-多酮途徑,多酮(polyketone)途徑又稱為乙酸-丙二酸途徑，是乙酰輔酶A通過直線式聚合，生成脂肪酸和環(huán)狀次級代謝物的途徑。 乙酰輔酶A通過多酮途徑生成的環(huán)狀次級代謝物，一般由410個乙?；本€式聚合，然后環(huán)化而成。某些大環(huán)抗生素可以由1920個乙?；酆?、環(huán)化而成。,LOGO,次級代謝物生物合成的基本途徑-莽草酸途徑,莽草酸（shikimic acid）途徑是指磷酸烯醇丙酮酸與4-

22、磷酸赤蘚糖縮合，經(jīng)過莽草酸生成芳香族氨基酸的生物合成途徑。 莽草酸是1885年從八角屬（illicium religiosum）植物的種子中分離得到的一種化合物。是植物和微生物中L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸等芳香族氨基酸生物合成的關(guān)鍵中間體。 經(jīng)過莽草酸途徑生成的芳香族氨基酸，可以進(jìn)一步生成生物堿、類黃酮等次級代謝物。,LOGO,次級代謝物生物合成的基本途徑-甲瓦龍酸途徑,甲瓦龍酸（marvelonic acid, MVA）途徑，又稱為甲戊二羥酸（mavalonic acid）途徑, 是乙酰輔酶A經(jīng)過甲戊二羥酸生成異戊二烯，再合成萜類和甾體化合物等異戊二烯類次級代謝物的途徑。 甲瓦龍酸

23、途徑可以分為兩個階段。第一階段是乙酰輔酶A通過分支式聚合，生成活性異戊二烯的過程；第二階段是活性異戊二烯 (C5) 聚合，生成萜類和甾體化合物等形形式式的異戊二烯類次級代謝物的過程。,LOGO,類黃酮的生物活性,類黃酮(flavonoids)是植物中分布最廣泛的一大類次級代謝物。自1814年發(fā)現(xiàn)第一個類黃酮化合物白楊素chrysin以來,已經(jīng)鑒定的類黃酮化合物將近10000種。 花青素（anthocyanins）等類黃酮在不同條件下，可以呈現(xiàn)多種不同顏色，而且具有抗氧化和抗菌作用，所以眾多的類黃酮化合物是常用的天然食用色素和染料。 類黃酮化合物具有擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血管滲透性的功效，在心腦血管疾病

24、的防治方面已經(jīng)發(fā)揮了重要作用。 大多數(shù)類黃酮化合物都有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化作用，在醫(yī)藥和食品中廣泛應(yīng)用。 抗病毒、抗菌、消炎、抗腫瘤作用,LOGO,類黃酮的分類和生物合成,類黃酮的基本母核具有C6-C3-C6的結(jié)構(gòu)，其中C3部分可以是脂鏈，也可以與C6部分形成六元或五元的氧雜環(huán)。 可以分為黃酮flavones，黃酮醇flavonols，異黃酮isoflavones, 查爾酮chalcones，花青素authocyanins和噢哢aulones等類。 類黃酮的生物合成的開始階段與香豆素的生物合成開始階段一樣，由苯丙氨酸開始，生成肉桂酸、對香豆酸，然后經(jīng)過對香豆酰輔酶A，生成查爾酮，再轉(zhuǎn)化為其

25、它類黃酮化合物。,LOGO,銀杏黃酮的生物合成途徑,LOGO,萜類化合物,萜類化合物是指以異戊二烯（C5）為基本單位首尾相接而成的一類化合物。單萜化合物(monoterpenoids)由2個異戊二烯單位組成，在醫(yī)藥、香料、驅(qū)蟲藥等方面廣泛應(yīng)用。 倍半萜化合物( sesquiterpenoids)由3個異戊二烯單位組成，廣泛存在于植物、微生物、海洋生物和一些昆蟲中。 二萜化合物（diterpenoids）由4個異戊二烯單位組成，二萜化合物中有許多具有生物活性，丹參酮/銀杏內(nèi)酯/雷公藤內(nèi)酯/穿心蓮內(nèi)酯/紫杉醇。 二倍半萜由五個異戊二烯單位組成，主要存在于海綿中，陸地生物中很少。二倍半萜是海綿中產(chǎn)生

26、的防衛(wèi)物質(zhì)，有些具有很強(qiáng)的抗菌活性，有些對魚類有毒殺作用。 三萜類化合物（triterpenoids）是由六個異戊二烯單位組成的萜類化合物。廣泛存在于五加科、玄參科、豆科、桔?？频戎参镏小?LOGO,2、植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝物的工藝過程及其影響因素,一般工藝流程/培養(yǎng)方式 培養(yǎng)基 溫度 pH 溶解氧 光照 前體、刺激劑 基因調(diào)控,LOGO,大規(guī)模的植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器裝置（機(jī)械攪拌式）,反應(yīng)器容積為20米3，其攪拌葉直徑是罐體直徑，在低通氣條件下，通入以PVA為過濾除菌介質(zhì)的無菌空氣。,LOGO,非機(jī)械攪拌式反應(yīng)器(氣體攪拌式反應(yīng)器),利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓泡反應(yīng)器

27、和氣升式反應(yīng)器，而氣升式反應(yīng)器又可分為外循環(huán)和內(nèi)循環(huán)兩種形式。,LOGO,固定化細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器(填充床反應(yīng)器和流化床反應(yīng)器),細(xì)胞固定于支持物表面或內(nèi)部，支持物顆粒堆疊成床，培養(yǎng)基在床層間流動。填充床中單位體積細(xì)胞較多，由于混合效果不好常使床內(nèi)氧的傳遞、氣體的排出、溫度和pH的控制較困難。如支持物顆粒破碎還易使填充床阻塞。 典型的流化床反應(yīng)器是利用流體（液體或氣體）的能量使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)?；旌闲Ч^好，但流體的切變力和固定化顆粒的碰撞常使支持物顆粒破損，另外，流質(zhì)動力學(xué)復(fù)雜使其放大困難。,LOGO,固定化細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器(膜反應(yīng)器),采用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細(xì)胞，營養(yǎng)物質(zhì)可

28、以通過膜滲透到細(xì)胞中，細(xì)胞產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過膜釋放到培養(yǎng)液中。 膜反應(yīng)器主要有中空纖維反應(yīng)器和螺旋卷繞反應(yīng)器。,LOGO,生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方式,分批培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，一次性加入培養(yǎng)液，在一定條件下培養(yǎng)一段時間后，一次性放出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)方式較為簡單、方便，受微生物感染的機(jī)會相對較少，是當(dāng)今植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最常用的方式。但是分批培養(yǎng)方式的生產(chǎn)周期較長，設(shè)備利用率較低。 半連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，每隔一段時間從反應(yīng)器中放出部分培養(yǎng)液，并補(bǔ)充部分新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式。半連續(xù)培養(yǎng)可以提高設(shè)備利用率，可以適當(dāng)提高單位體積反應(yīng)器的產(chǎn)量。但在添加新鮮培養(yǎng)基的時候，要

29、注意防止微生物的污染。 連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，以一定的流量連續(xù)地添加培養(yǎng)基，同時放出相同體積的培養(yǎng)液，保持反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的體積不變。該培養(yǎng)方式可以顯著提高設(shè)備利用率，在固定化細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常采用。 兩相培養(yǎng)：在生物反應(yīng)器中，除了植物細(xì)胞（或固定化細(xì)胞）以外，培養(yǎng)體系中還存在互不相溶的兩相介質(zhì)。兩相介質(zhì)系統(tǒng)可以是液-液兩相，也可以是固-液兩相。,LOGO,培養(yǎng)基對細(xì)胞生長和次級代謝物生產(chǎn)的影響,在培養(yǎng)基的設(shè)計和配制時，應(yīng)當(dāng)根據(jù)細(xì)胞的特性和要求，特別注意各種組分的種類和含量，以滿足細(xì)胞生長、繁殖和新陳代謝的需要，并調(diào)節(jié)至適宜的pH值。有些細(xì)胞在生長繁殖階段和生產(chǎn)代謝物的階段所要求的培養(yǎng)基有所不同，

30、必需根據(jù)需要配制不同的生長培養(yǎng)基和生成培養(yǎng)基。 碳源的濃度/碳源對生物合成的代謝調(diào)節(jié) 采用一定量的硝酸鹽和銨鹽作為混合無機(jī)氮源，單獨以銨鹽或者硝酸鹽為氮源，都對細(xì)胞的生長和次級代謝物的生成不利。(總量/比例) 磷酸鹽/生長激素,LOGO,溫度對細(xì)胞生長和次級代謝物生產(chǎn)的影響,植物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度一般控制在室溫范圍（25左右）。溫度高些，對植物細(xì)胞的生長有利，溫度低些，則對次級代謝物的積累有利。但是通常不能低于20，也不要高于35。 植物細(xì)胞生物反應(yīng)器中，均應(yīng)設(shè)計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等，并且隨時備有冷水和熱水，以滿足溫度調(diào)控的需要。,LOGO,植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,懸浮培養(yǎng) 機(jī)械攪拌反應(yīng)器 非機(jī)械攪拌反應(yīng)器 固定化細(xì)胞系統(tǒng) 填充床反應(yīng)器 流化床反應(yīng)器 膜反應(yīng)器,LOGO,前體的調(diào)節(jié),前體是指處于目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì)。處于代謝途徑上游的化合物，在特定酶的催化作用下生成其下游的化合物，上游化合物作為酶的底物，其濃度的高低決定了催化反應(yīng)速度的大小。濃度高，則反應(yīng)速度大。 為了提高植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝物的產(chǎn)量，在培養(yǎng)過程中添加目的代謝物的前體是一種有效的措施。,LOGO,刺激劑的調(diào)節(jié),刺