中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB5009.185—2016

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品中展青霉素的測定

2016-12-23發(fā)布2017-06-23實施

中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會

國家食品藥品監(jiān)督管理總局

發(fā)布

GB5009.185—2016

Ⅰ

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T5009.185—2003《蘋果和山楂制品中展青霉素的測定》、NY/T1650—2008《蘋果

及山楂制品中展青霉素的測定高效液相色譜法》、SN/T2008—2007《進出口果汁中棒曲霉毒素的檢

測方法高效液相色譜法》和SN/T2534—2010《進出口水果和蔬菜制品中展青霉素含量檢測方法

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》和SN/T1859—2007《飲料中棒曲霉素和5-羥甲基糠醛的測

定方法液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法》中展青霉素部分。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T5009.

185—2003相比,主要變化如下:

———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中展青霉素的測定”;

———增加了同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;

———增加了液相色譜法;

———擴大了適用范圍;

———刪除了薄層色譜法。

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1

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品中展青霉素的測定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中展青霉素的測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)第一法為同位素稀釋-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,適用于蘋果和山楂為原料的水果及其制品、果

蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。

本標(biāo)準(zhǔn)第二法為高效液相色譜法,適用于蘋果為原料的水果及其果蔬汁類和酒類食品中展青霉素

含量的測定。

第一法同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

2原理

樣品(濁汁、半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理)中的展青霉素經(jīng)溶劑提取,展青霉素固相凈化柱

或混合型陰離子交換柱凈化、濃縮后,經(jīng)反相液相色譜柱分離,電噴霧離子源離子化,多反應(yīng)離子監(jiān)測檢

測,內(nèi)標(biāo)法定量。

3試劑和材料

除非另有說明,本方法使用的試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

3.1試劑

3.1.1乙腈(CH3CN):色譜純。

3.1.2甲醇(CH3OH):色譜純。

3.1.3乙酸(CH3COOH):色譜純。

3.1.4乙酸銨(CH3COONH4)。

3.1.5果膠酶(液體):活性≥1500U/g,2℃~8℃避光保存。

3.2試劑配制

3.2.1乙酸溶液:取10mL乙酸加入250mL水,混勻。

3.2.2乙酸銨溶液(5mmol

/L):稱取0.

38g乙酸銨,加1000mL水溶解。

3.3標(biāo)準(zhǔn)品

3.3.1展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品(C7H6O4,CAS號:149-29-1):純度≥99%,或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書

的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.3.213C7-展青霉素同位素內(nèi)標(biāo):25μg/mL,或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

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2

3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100μg/mL):用2mL乙腈溶解展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.0mg后,移入10mL的容量

瓶,乙腈定容至刻度。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后,在-20℃下冷凍保存,備用,有效期6個月。展青霉素

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定參見附錄A。

3.4.2標(biāo)準(zhǔn)工作液(1μg/mL):準(zhǔn)確吸取100μL經(jīng)標(biāo)定過的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至10mL容量瓶

中,用乙酸溶液定容至刻度。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后,在4℃下避光保存,有效期3個月。

3.4.313C7-展青霉素同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1μg/mL):準(zhǔn)確移取展青霉素同位素內(nèi)標(biāo)(25μg/mL)

0.40mL至10mL容量瓶中,用乙酸溶液定容。在4℃下避光保存,備用,3個月內(nèi)有效。

3.4.4標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量至10mL容量瓶中,加入500μL1.0μg/mL

的同位素內(nèi)標(biāo)工作液,用乙酸溶液定容至刻度,配制展青霉素濃度為5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、

50ng

/mL、

100ng

/mL、

150ng

/mL、

200ng

/mL、

250ng

/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4儀器和設(shè)備

4.1液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:帶電噴霧離子源。

4.2勻漿機。

4.3高速粉碎機。

4.4組織搗碎機。

4.5渦旋振蕩器。

4.6pH計:測量精度±0.02。

4.7天平:感量為0.01g和0.00001g。

4.850mL具塞PVC離心管。

4.9離心機:轉(zhuǎn)速≥6000r/min。

4.10展青霉素固相凈化柱(以下簡稱凈化柱):混合填料凈化柱Mycosep

TM228或相當(dāng)者。

4.11混合型陰離子交換柱:N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基質(zhì)-CH2N(CH3)2C4H9+為填料的

固相萃取柱(

6mL,150mg)或相當(dāng)者。使用前分別用6mL甲醇和6mL水預(yù)淋洗并保持柱體濕潤。

4.12100mL梨形燒瓶。

4.13固相萃取裝置。

4.14旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

4.15氮吹儀。

5分析步驟

5.1試樣制備

5.1.1液體樣品(蘋果汁、山楂汁等)

樣品倒入勻漿機中混勻,取其中任意的100g(或mL)樣品進行檢測。

酒類樣品需超聲脫氣1h或4℃低溫條件下存放過夜脫氣。

5.1.2固體樣品(山楂片、果丹皮等)

樣品用高速粉碎機將其粉碎,混合均勻后取樣品100g用于檢測。果丹皮等高黏度樣品經(jīng)液氮凍

干后立即用高速粉碎機將其粉碎,混合均勻后取樣品100g用于檢測。

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5.1.3半流體(蘋果果泥、蘋果果醬、帶果粒果汁等)

樣品在組織搗碎機中搗碎混勻后,取100g用于檢測。

5.2試樣提取及凈化

5.2.1混合型陰離子交換柱法

5.2.1.1試樣提取

5.2.1.1.1澄清果汁

稱取2g試樣(準(zhǔn)確至0.

01g),加入50μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液混勻待凈化。

5.2.1.1.2蘋果酒

稱取1g試樣(準(zhǔn)確至0.

01g),加入50μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液,加水至10mL

混勻后待凈化。

5.2.1.1.3固體、半流體試樣

稱取1g試樣(準(zhǔn)確至0.

01g)于50mL離心管中,加入50μ

L同位素內(nèi)標(biāo)工作液,靜置片刻后,再

加入10mL水與75μL果膠酶混勻,室溫下避光放置過夜后,加入10.

0mL乙酸乙酯,渦旋混合5min,

在6000r/min下離心5min,移取乙酸乙酯層至100mL梨形燒瓶。再用10.

0mL乙酸乙酯提取一次,

合并兩次乙酸乙酯提取液,在40℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,以5.

0mL乙酸溶液溶解殘留物,待

凈化處理。

5.2.1.2凈化

將待凈化液轉(zhuǎn)移至預(yù)先活化好的混合型陰離子交換柱中,控制樣液以約3mL/min的速度穩(wěn)定過

柱。上樣完畢后,依次加入3mL的乙酸銨溶液、

3mL水淋洗。抽干混合型陰離子交換柱,加入4mL

甲醇洗脫,控制流速約3mL/min,收集洗脫液。在洗脫液中加入20μL乙酸,置40℃下用氮氣緩緩吹

至近干,用乙酸溶液定容至1.

0mL,渦旋30s溶解殘留物,0.22μm濾膜過濾,收集濾液于進樣瓶中以

備進樣。按同一操作方法做空白試驗。

5.2.2凈化柱法

5.2.2.1試樣提取

5.2.2.1.1液體試樣

稱取4g試樣(準(zhǔn)確至0.

01g)于50mL離心管中,加入250μ

L同位素內(nèi)標(biāo)工作液,加入21mL乙

腈,混合均勻,在6000r/min下離心5min,待凈化。

5.2.2.1.2固體、半流體試樣

稱取1g試樣(準(zhǔn)確至0.

01g)于50mL離心管中,加入100μ

L同位素內(nèi)標(biāo)工作液,混勻后靜置片

刻,再加入10mL水與150μL果膠酶溶液混勻,室溫下避光放置過夜后,加入10.

0mL乙酸乙酯,渦旋

混合5min,在6000r/min下離心5min,移取乙酸乙酯層至梨形燒瓶。再用10.

0mL乙酸乙酯提取一

次,合并兩次乙酸乙酯提取液,在40℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,以2.

0mL乙酸溶液溶解殘留物,

再加入8mL乙腈,混勻后待凈化。

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5.2.2.2凈化

按照所使用凈化柱的說明書操作,將提取液通過凈化柱凈化,棄去初始的1mL凈化液,收集后續(xù)

部分。

用吸量管準(zhǔn)確吸取5.

0mL凈化液,加入20μL乙酸,在40℃下用氮氣緩緩地吹至近干,加入乙酸

溶液定容至1mL,渦旋30s溶解殘渣,過0.

22μm濾膜,收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作

方法做空白試驗。

注:上述方法的樣品提取和凈化部分,包括混合型陰離子交換柱凈化和凈化柱凈化方法,可根據(jù)實際情況,選擇其

中一種方法即可。

5.3儀器參考條件

5.3.1色譜參考條件

a)色譜柱:T3色譜柱,柱長100mm,內(nèi)徑2.1mm,粒徑1.8μm,或相當(dāng)者;

b)流動相:A相:水,B相:乙腈;

c)梯度洗脫條件:5%B(0min~7min),100%B(7.2min~9min),5%B(9.2min~13min);

d)流速:0.3mL/min;

e)色譜柱柱溫:30℃;

f)進樣量:10μL。

5.3.2質(zhì)譜參考條件

a)檢測方式:多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM);

b)質(zhì)譜參數(shù)及離子選擇參數(shù)參見表B.1;

c)子離子掃描圖參見圖B.1和圖B.2;

d)液相色譜-質(zhì)譜圖見圖B.3。

5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液由低到高濃度進樣檢測,以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中展青霉素的濃度為橫坐標(biāo),以

展青霉素色譜峰與內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo),繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.5測定

將試樣溶液注入液相色譜-質(zhì)譜儀中,測得相應(yīng)的峰面積,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中展青霉素的

濃度。

5.6定性

試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時間相比較,變化范圍在±2.

5%

之內(nèi)。

每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn),至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子,而且同一檢測批次,

對同一化合物,樣品中目標(biāo)化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比,其允許偏差

不超過表1規(guī)定的范圍。

表1定性時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度

>50%>20%~50%>10%~20%≤10%

允許相對偏差

±20%±25%±30%±50%

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6分析結(jié)果的表述

試樣中展青霉素的含量按式(

1)計算:

X=

ρ×V

m

×f

…………(1)

式中:

X———試樣中展青霉素的含量,單位為微克每千克或微克每升(

μg

/

kg

或μg/L);

ρ

———由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得的試樣溶液中展青霉素的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

V———最終定容體積,單位毫升(mL);

m———試樣的稱樣量,單位克(g);

f

———稀釋倍數(shù)。

計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。

8其他

本方法的檢出限和定量限見表2。

表2不同試樣采用不同前處理方法的檢出限和定量限

凈化方式

澄清果汁蘋果酒固體、半流體

檢出限/(

μg

/

kg

)定量限/(

μg

/

kg

)檢出限/(

μg

/

kg

)定量限/(

μg

/

kg

)檢出限/(

μg

/

kg

)定量限/(

μg

/

kg

)

混合型陰離子交換柱

1.551.55310

凈化柱法

310310620

第二法高效液相色譜法

9原理

樣品(濁汁、半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理)中的展青霉素經(jīng)提取,展青霉素固相凈化柱凈

化、濃縮后,液相色譜分離,紫外檢測器檢測。外標(biāo)法定量。

10試劑和材料

除非另有說明,本方法使用的試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

10.1試劑

10.1.1乙腈(CH3CN):色譜純。

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10.1.2甲醇(CH3OH):色譜純。

10.1.3乙酸(CH3COOH):色譜純。

10.1.4乙酸乙酯(CH3COOCH2CH3)。

10.1.5乙酸銨(CH3COONH4)。

10.1.6果膠酶(液體):活性不低于1500U/g,2℃~8℃避光保存。

10.2試劑配制

乙酸溶液:取10mL乙酸加入250mL水,混勻。

10.3標(biāo)準(zhǔn)品

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品(

C7H6O4,CAS號:149-29-1):純度≥99%,或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

10.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

10.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100μg/mL):用2mL乙腈溶解展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.0mg后,移入10mL的容量

瓶,乙腈定容至刻度。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后,在-20℃下冷凍保存,備用,6個月內(nèi)有效。展青霉素

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定參見附錄A。

10.4.2標(biāo)準(zhǔn)工作液(1μg/mL):移取100μL經(jīng)標(biāo)定過的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用乙酸溶液溶解并轉(zhuǎn)

移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后,在4℃下避光保存,

3個月內(nèi)有效。

10.4.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量至5mL容量瓶中,用乙酸溶液定容至刻度,配

制展青霉素濃度為5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、

250ng

/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

11儀器和設(shè)備

11.1液相色譜儀:配紫外檢測器。

11.2勻漿機。

11.3高速粉碎機。

11.4組織搗碎機。

11.5渦旋振蕩器。

11.6pH計:測量精度±0.02。

11.7天平:感量為0.01g和0.00001g。

11.850mL具塞PVC離心管。

11.9離心機:轉(zhuǎn)速≥6000r/min。

11.10展青霉素固相凈化柱:混合填料凈化柱MycosepTM228或相當(dāng)者。

11.11100mL梨形燒瓶。

11.12固相萃取裝置。

11.13旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

11.14氮吹儀。

11.15一次性水相微孔濾頭:帶0.22μm微孔濾膜。

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12分析步驟

12.1試樣制備

同5.

1。

12.2試樣提取及凈化

除不加同位素內(nèi)標(biāo)外,試樣提取及凈化柱凈化操作同5.

2.2。

12.3儀器參考條件

a)液相色譜柱:T3柱,柱長150mm,內(nèi)徑4.6mm,粒徑3.0μm,或相當(dāng)者;

b)流動相:A相:水,B相:乙腈;

c)梯度洗脫條件:5%B(0min~13min),100%B(13min~15min),5%B(15min~20min);

d)流速:0.8mL/min;

e)色譜柱柱溫:40℃;

f)進樣量:100μL;

g)紫外檢測器條件:檢測波長為276nm。

12.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液由低到高濃度依次進樣檢測,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪

制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

12.5測定

將試樣溶液注入液相色譜-質(zhì)譜儀中,測得相應(yīng)的峰面積,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中展青霉素的

濃度。

13分析結(jié)果的表述

試樣中展青霉素的含量按式(

2)計算:

X=

ρ×V

m

×f

…………(2)

式中:

X———試樣中展青霉素的含量,單位為微克每千克或微克每升(

μg

/

kg

或μg/L);

ρ

———由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中展青霉素的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

V———最終定容體積,單位毫升(mL);

m———試樣的稱樣量,單位克(g);

f

———稀釋倍數(shù)。

計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

14精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。

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15其他

液體試樣的檢出限為6μg/

kg

,定量限為20μg/

kg

;固體、半流體試樣的檢出限為12μg/

kg,定量限

為40μg/

kg

。

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附錄A

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定

A.1儀器校正

測定重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù),以求出使用儀器的校正因子。準(zhǔn)確稱取74mg經(jīng)干燥的重鉻

酸鉀,用0.

009mol

/L硫酸溶解后并準(zhǔn)確稀釋至1000mL,相當(dāng)于[

c(K2Cr2O7)=0.25mmol

/L]。再

吸取25mL此稀釋液于50mL容量瓶中,加0.

009mol

/L硫酸稀釋至刻度,相當(dāng)于0.

125mmol

/L溶

液。再吸取25mL此稀釋液于50mL容量瓶中,加0.009mol/L硫酸稀釋至刻度,相當(dāng)于

0.0625mmol

/L溶液。用1cm石英杯,在最大吸收峰的波長(

350nm處)用0.009mol

/L硫酸作空白,

測得以上三種不同濃度的溶液的吸光度,以上三種濃度的摩爾消光系數(shù)按式(A.

1)計算:

E=A

c

…………(A.

1)

式中:

E———重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù);

A———測得重鉻酸鉀溶液的吸光度;

c———重鉻酸鉀溶液的摩爾濃度。

取三種濃度的摩爾消光系數(shù)的平均值E'并與重鉻酸鉀的摩爾消光系數(shù)值3160比較,即求出使用

儀器的校正因子,按式(A.

2)進行計算:

f=3160

E'

………………(A.

2)

式中:

f

———使用儀器的校正因子;

E'———測得的重鉻酸鉀摩爾消光系數(shù)平均值。

若f大于0.

95或小于1.05,則使用儀器的校正因子可略而不計。

A.2展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取1000μL儲備液用氮氣吹干后,立即用20mL乙醇溶解殘渣,置于4℃冰箱保存。該標(biāo)準(zhǔn)溶液

約為5μg/mL。用紫外分光光度計以1cm石英比色皿測此標(biāo)準(zhǔn)溶液在250nm~350nm處的最大吸

收峰的波長及該波長的吸光度值,以乙醇為參比溶液。

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度按式(A.

3)進行計算:

ρ=A

×M×1000×f

E2