中華人民共和國國家標準

GB4789.12—2016

食品安全國家標準

食品微生物學檢驗

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

2016-12-23發(fā)布2017-06-23實施

中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會

國家食品藥品監(jiān)督管理總局

發(fā)布

GB4789.12—2016

Ⅰ

前言

本標準代替GB/T4789.12—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》。

本標準與GB/T4789.

12—2003相比,主要變化如下:

———標準名稱修改為“食品安全國家標準食品微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗”;

———增加了PCR鑒定方法;

———增加了結果與報告;

———增加了附錄A;

———修改了設備和材料;

———修改了培養(yǎng)基和試劑;

———修改了檢驗程序;

———規(guī)范了樣品制備過程;

———修改了操作步驟中增菌和分離培養(yǎng)部分試驗方法。

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食品安全國家標準

食品微生物學檢驗

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

1范圍

本標準規(guī)定了食品中肉毒梭菌(

Clostridiumbotulinum)及肉毒毒素(botulinumtoxin)的檢驗

方法。

本標準適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。

2設備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下:

2.1冰箱:2℃~5℃、-20℃。

2.2天平:感量0.1g。

2.3無菌手術剪、鑷子、試劑勺。

2.4均質器或無菌乳缽。

2.5離心機:3000r/min、14000r/min。

2.6厭氧培養(yǎng)裝置。

2.7恒溫培養(yǎng)箱:35℃±1℃、28℃±1℃。

2.8恒溫水浴箱:37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃。

2.9顯微鏡:10倍~100倍。

2.10PCR儀。

2.11電泳儀或毛細管電泳儀。

2.12凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀。

2.13核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。

2.14可調微量移液器:0.2μL~2μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。

2.15無菌吸管:1.0mL、10.0mL、25.0mL。

2.16無菌錐形瓶:100mL。

2.17培養(yǎng)皿:直徑90mm。

2.18離心管:50mL、1.5mL。

2.19PCR反應管。

2.20無菌注射器:1.0mL。

2.21小鼠:15g~20g,每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠。

3培養(yǎng)基和試劑

除另有規(guī)定外,

PCR試驗所用試劑為分析純或符合生化試劑標準,水應符合GB/T6682中一級水

的要求。

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3.1庖肉培養(yǎng)基:見A.1。

3.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT):見A.2。

3.3卵黃瓊脂培養(yǎng)基:見A.3。

3.4明膠磷酸鹽緩沖液:見A.4。

3.5革蘭氏染色液:見A.5。

3.610%胰蛋白酶溶液:見A.6。

3.7磷酸鹽緩沖液(PBS):見A.7。

3.81mol

/L氫氧化鈉溶液。

3.91mol

/L鹽酸溶液。

3.10肉毒毒素診斷血清。

3.11無水乙醇和95%乙醇。

3.1210mg/mL溶菌酶溶液。

3.1310mg/mL蛋白酶K溶液。

3.143mol

/L乙酸鈉溶液(

pH5.2)。

3.15TE緩沖液。

3.16引物:根據表1中序列合成,臨用時用超純水配制引物濃度為10μmol

/L。

3.1710×PCR緩沖液。

3.1825mmol

/LMgCl

2。

3.19dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

3.20

Taq

酶。

3.21瓊脂糖:電泳級。

3.22溴化乙錠或Goldview。

3.235×TBE緩沖液。

3.246×加樣緩沖液。

3.25DNA分子量標準。

4檢驗程序

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序見圖1。

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圖1肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序

5操作步驟

5.1樣品制備

5.1.1樣品保存

待檢樣品應放置2℃~5℃冰箱冷藏。

5.1.2固態(tài)與半固態(tài)食品

固體或游離液體很少的半固態(tài)食品,以無菌操作稱取樣品25g,放入無菌均質袋或無菌乳缽,塊狀

食品以無菌操作切碎,含水量較高的固態(tài)食品加入25mL明膠磷酸鹽緩沖液,乳粉、牛肉干等含水量低

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的食品加入50mL明膠磷酸鹽緩沖液,浸泡30min,用拍擊式均質器拍打2min或用無菌研杵研磨制

備樣品勻液,收集備用。

5.1.3液態(tài)食品

液態(tài)食品搖勻,以無菌操作量取25mL檢驗。

5.1.4剩余樣品處理

取樣后的剩余樣品放2℃~5℃冰箱冷藏,直至檢驗結果報告發(fā)出后,按感染性廢棄物要求進行無

害化處理,檢出陽性的樣品應采用壓力蒸汽滅菌方式進行無害化處理。

5.2肉毒毒素檢測

5.2.1毒素液制備

取樣品勻液約40mL或均勻液體樣品25mL放入離心管,

3000r/min離心10min~20min,收集

上清液分為兩份放入無菌試管中,一份直接用于毒素檢測,一份用于胰酶處理后進行毒素檢測。液體樣

品保留底部沉淀及液體約12mL,重懸,制備沉淀懸浮液備用。

胰酶處理:用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)上清液

pH

至6.

2,按9份上清液加1份10%

胰酶(活力1∶250)水溶液,混勻,

37℃孵育60min,期間間或輕輕搖動反應液。

5.2.2檢出試驗

用5號針頭注射器分別取離心上清液和胰酶處理上清液腹腔注射小鼠3只,每只0.

5mL,觀察和

記錄小鼠48h內的中毒表現。典型肉毒毒素中毒癥狀多在24h內出現,通常在6h內發(fā)病和死亡,其

主要表現為豎毛、四肢癱軟,呼吸困難,呈現風箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如峰腰,多因呼吸衰竭而死亡,

可初步判定為肉毒毒素所致。若小鼠在24h后發(fā)病或死亡,應仔細觀察小鼠癥狀,必要時濃縮上清液

重復試驗,以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出現猝死(

30min內)導致癥狀不明顯時,應將毒素上清液進

行適當稀釋,重復試驗。

注:毒素檢測動物試驗應遵循GB15193.

2《食品安全國家標準食品毒理學實驗室操作規(guī)范》的規(guī)定。

5.2.3確證試驗

上清液或(和)胰酶處理上清液的毒素試驗陽性者,取相應試驗液3份,每份0.

5mL,其中第一份加

等量多型混合肉毒毒素診斷血清,混勻,

37℃孵育30min;第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻后煮

沸10min;第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻。將三份混合液分別腹腔注射小鼠各兩只,每只

0.5mL,觀察96h內小鼠的中毒和死亡情況。

結果判定:若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡,而第三份混合液小鼠發(fā)病死亡,并出現肉

毒毒素中毒的特有癥狀,則判定檢測樣品中檢出肉毒毒素。

5.2.4毒力測定(選做項目)

取確證試驗陽性的試驗液,用明膠磷酸鹽緩沖液稀釋制備一定倍數稀釋液,如10倍、

50倍、100倍、

500倍等,分別腹腔注射小鼠各兩只,每只0.5mL,觀察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至96h,計算最低

致死劑量(MLD/mL或MLD/

g),評估樣品中肉毒毒素毒力,MLD等于小鼠全部死亡的最高稀釋倍數

乘以樣品試驗液稀釋倍數。例如,樣品稀釋兩倍制備的上清液,再稀釋100倍試驗液使小鼠全部死亡,

而500倍稀釋液組存活,則該樣品毒力為200MLD/g。

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5.2.5定型試驗(選做項目)

根據毒力測定結果,用明膠磷酸鹽緩沖液將上清液稀釋至10MLD/mL~1000MLD/mL作為定

型試驗液,分別與各單型肉毒毒素診斷血清等量混合(國產診斷血清一般為凍干血清,用1mL生理鹽

水溶解),

37℃孵育30min,分別腹腔注射小鼠兩只,每只0.5mL,觀察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至

96h。同時,用明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清,與試驗液等量混合作為小鼠試驗對照。

結果判定:某一單型診斷血清組動物未發(fā)病且正常存活,而對照組和其他單型診斷血清組動物發(fā)病

死亡,則判定樣品中所含肉毒毒素為該型肉毒毒素。

注:未經胰酶激活處理的樣品上清液的毒素檢出試驗或確證試驗為陽性者,則毒力測定和定型試驗可省略胰酶激

活處理試驗。

5.3肉毒梭菌檢驗

5.3.1增菌培養(yǎng)與檢出試驗

5.3.1.1取出庖肉培養(yǎng)基4支和TPGY肉湯管2支,隔水煮沸10min~15min,排除溶解氧,迅速冷

卻,切勿搖動,在TPGY肉湯管中緩慢加入胰酶液至液體石蠟液面下肉湯中,每支1mL,制備成

TPGYT。

5.3.1.2吸取樣品勻液或毒素制備過程中的離心沉淀懸浮液2mL接種至庖肉培養(yǎng)基中,每份樣品接

種4支,

2支直接放置35℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d,另2支放80℃保溫10min,再放置35℃±1℃厭氧

培養(yǎng)至5d;同樣方法接種2支TPGYT肉湯管,28℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d。

注:接種時,用無菌吸管輕輕吸取樣品勻液或離心沉淀懸浮液,將吸管口小心插入肉湯管底部,緩緩放出樣液至肉

湯中,切勿攪動或吹氣。

5.3.1.3檢查記錄增菌培養(yǎng)物的濁度、產氣、肉渣顆粒消化情況,并注意氣味。肉毒梭菌培養(yǎng)物為產氣、

肉湯渾濁(庖肉培養(yǎng)基中A型和B型肉毒梭菌肉湯變黑)、消化或不消化肉粒、有異臭味。

5.3.1.4取增菌培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢,觀察菌體形態(tài),注意是否有芽胞、芽胞的相對比例、芽胞在

細胞內的位置。

5.3.1.5若增菌培養(yǎng)物5d無菌生長,應延長培養(yǎng)至10d,觀察生長情況。

5.3.1.6取增菌培養(yǎng)物陽性管的上清液,按5.2方法進行毒素檢出和確證試驗,必要時進行定型試驗,

陽性結果可證明樣品中有肉毒梭菌存在。

注:TPGYT增菌液的毒素試驗無需添加胰酶處理。

5.3.2分離與純化培養(yǎng)

5.3.2.1增菌液前處理,吸取1mL增菌液至無菌螺旋帽試管中,加入等體積過濾除菌的無水乙醇,混

勻,在室溫下放置1h。

5.3.2.2取增菌培養(yǎng)物和經乙醇處理的增菌液分別劃線接種至卵黃瓊脂平板,35℃±1℃厭氧培養(yǎng)

48h。

5.3.2.3觀察平板培養(yǎng)物菌落形態(tài),肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙,易成蔓延生長,邊緣不規(guī)

則,在菌落周圍形成乳色沉淀暈圈(

E型較寬,A型和B型較窄),在斜視光下觀察,菌落表面呈現珍珠樣

虹彩,這種光澤區(qū)可隨蔓延生長擴散到不規(guī)則邊緣區(qū)外的暈圈。

5.3.2.4菌株純化培養(yǎng),在分離培養(yǎng)平板上選擇5個肉毒梭菌可疑菌落,分別接種卵黃瓊脂平板,35℃±

1℃,厭氧培養(yǎng)48h,按5.3.2.3觀察菌落形態(tài)及其純度。

5.3.3鑒定試驗

5.3.3.1染色鏡檢

挑取可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色和鏡檢,肉毒梭菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽性粗大桿菌、芽胞卵圓

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形、大于菌體、位于次端,菌體呈網球拍狀。

5.3.3.2毒素基因檢測

a)菌株活化:挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種TPGY,35℃±1℃厭氧培養(yǎng)24h。

b)DNA模板制備:吸取TPGY培養(yǎng)液1.4mL至無菌離心管中,14000×g離心2min,棄上清,

加入1.

0mLPBS懸浮菌體,14000×g離心2min,棄上清,用400μLPBS重懸沉淀,加入

10mg

/mL溶菌酶溶液100μL,搖勻,

37℃水浴15min,加入10mg/mL蛋白酶K溶液

10μL,搖勻,60℃水浴1h,再沸水浴10min,14000×g離心2min,上清液轉移至無菌小離

心管中,加入3mol/LNaAc溶液50μL和95%乙醇1.

0mL,搖勻,-70℃或-20℃放置

30min,14000×g離心10min,棄去上清液,沉淀干燥后溶于200μLTE緩沖液,置于-20℃保

存?zhèn)溆谩?/p>

注:根據實驗室實際情況,也可采用常規(guī)水煮沸法或商品化試劑盒制備DNA模板。

c)核酸濃度測定(必要時):取5μLDNA模板溶液,加超純水稀釋至1mL,用核酸蛋白分析儀或

紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm波段的吸光值A260和A280。按式(1)計算DNA

濃度。當濃度在0.

34μg/mL~340μg/mL或A260/A280比值在1.7~1.9之間時,適宜于PCR

擴增。

C=A260×N×50

…………(1)

式中:

C———DNA濃度,單位為微克每毫升(

μg

/mL);

A260———260nm處的吸光值;

N

———核酸稀釋倍數。

d)PCR擴增:

1)分別采用針對各型肉毒梭菌毒素基因設計的特異性引物(見表1)進行PCR擴增,包括A

型肉毒毒素(

botulinumneurotoxinA,bont/A)、B型肉毒毒素(botulinumneurotoxinB,

bont/B)、E型肉毒毒素(botulinumneurotoxinE,bont/E)和F型肉毒毒素(botulinum

neurotoxinF,bont/F),每個PCR反應管檢測一種型別的肉毒梭菌。

表1肉毒梭菌毒素基因PCR檢測的引物序列及其產物

檢測肉毒梭菌類型引物序列擴增長度/

bp

A型

F5’-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’

R5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’

983

B型

F5’-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’

R5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’

492

E型

F5’-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3’

R5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’

410

F型

F5’-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3’

R5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’

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2)反應體系配制見表2,反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行

相應調整。

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表2肉毒梭菌毒素基因PCR檢測的反應體系

試劑終濃度加入體積/

μL

10×PCR緩沖液1×5.0

25mmol/LMgCl22.5mmol/L5.0

10mmol/LdNTPs0.2mmol/L1.0

10μmol/L正向引物0.5μmol/L2.5

10μmol/L反向引物0.5μmol/L2.5

5U/μL

Taq

酶

0.05U/μL0.5

DNA模板

—

1.0

ddH2O

—

32.5

總體積—

50.0

3)反應程序,預變性95℃、5min;循環(huán)參數94℃、1min,60℃、1min,72℃、1min;循環(huán)數

40;后延伸72℃,10min;4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)PCR擴增體系應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉

毒毒素基因的質控品作陽性對照、非肉毒梭菌基因組DNA作陰性對照、無菌水作空白

對照。

e)凝膠電泳檢測PCR擴增產物,用0.5×TBE緩沖液配制1.2%~1.5%的瓊脂糖凝膠,凝膠加熱

融化后冷卻至60℃左右加入溴化乙錠至0.

5μg/mL或Goldview5μL/100mL制備膠塊,取

10μLPCR擴增產物與2.0μL6×加樣緩沖液混合,點樣,其中一孔加入DNA分子量標準。

0.5×TBE電泳緩沖液,10V/cm恒壓電泳,根據溴酚藍的移動位置確定電泳時間,用紫外檢

測儀或凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結果。

PCR擴增產物也可采用毛細管電泳儀進行檢測。

f)結果判定,陰性對照和空白對照均未出現條帶,陽性對照出現預期大小的擴增條帶(見表1),

判定本次PCR檢測成立;待測樣品出現預期大小的擴增條帶,判定為PCR結果陽性,根據表1

判定肉毒梭菌菌株型別,待測樣品未出現預期大小的擴增條帶,判定PCR結果為陰性。

注:PCR試驗環(huán)境條件和過程控制應參照

GB/T27403《實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》規(guī)定執(zhí)行。

5.3.3.3菌株產毒試驗

將PCR陽性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接種庖肉培養(yǎng)基或TPGYT肉湯(用于E型肉毒梭菌),按

5.3.1.2條件厭氧培養(yǎng)5d,按5.2方法進行毒素檢測和(或)定型試驗,毒素確證試驗陽性者,判定為肉

毒梭菌,根據定型試驗結果判定肉毒梭菌型別。

注:根據PCR陽性菌株型別,可直接用相應型別的肉毒毒素診斷血清進行確證試驗。

6結果報告

6.1肉毒毒素檢測結果報告

根據5.

2.2和5.2.3試驗結果,報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。

根據5.

2.5定型試驗結果,報告25g(mL)樣品中檢出某型肉毒毒素。

6.2肉毒梭菌檢驗結果報告

根據5.

3各項試驗結果,報告樣品中檢出或未檢出肉毒梭菌或檢出某型肉毒梭菌。

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附錄A

培養(yǎng)基和試劑

A.1庖肉培養(yǎng)基

A.1.1成分

新鮮牛肉500.

0g

蛋白胨

30.0g

酵母浸膏

5.0g

磷酸二氫鈉

5.0g

葡萄糖

3.0g

可溶性淀粉

2.0g

蒸餾水

1000.0mL

A.1.2制法

稱取新鮮除去脂肪與筋膜的牛肉500.

0g,切碎,加入蒸餾水1000mL

和1mol/L氫氧化鈉溶液

25mL,攪拌煮沸15min,充分冷卻,除去表層脂肪,紗布過濾并擠出肉渣余液,分別收集肉湯和碎肉渣。

在肉湯中加入成分表中其他物質并用蒸餾水補足至1000mL,調節(jié)

pH

至7.

4±0.1,肉渣涼至半干。

在20mm×150mm試管中先加入碎肉渣1cm~2cm高,每管加入還原鐵粉0.

1g~0.2g或少許

鐵屑,再加入配制肉湯15mL,最后加入液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基0.

3cm~0.4cm,121℃高壓蒸汽滅菌

20min。

A.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT)

A.2.1基礎成分(TPGY肉湯)

胰酪胨(

trypticase)50.0g

蛋白胨

5.0g

酵母浸膏

20.0g

葡萄糖

4.0g

硫乙醇酸鈉

1.0g

蒸餾水

1000.0mL

A.2.2胰酶液

稱取胰酶(

1∶250)1.5g,加入100mL蒸餾水中溶解,膜過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.2.3制法

將A.

2.1中成分溶于蒸餾水中,調節(jié)

pH

至7.

2±0.1,分裝20mm×150mm試管,每管15mL,加

入液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基0.

3cm~0.4cm,121℃高壓蒸汽滅菌10min。冰箱冷藏,兩周內使用。臨用接

種樣品時,每管加入胰酶液1.

0mL。

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A.3卵黃瓊脂培養(yǎng)基

A.3.1基礎培養(yǎng)基成分

酵母浸膏

5.0g

胰胨

5.0g

胨(

proteosepeptone)

20.0g

氯化鈉

5.0g

瓊脂

20.0g

蒸餾水

1000.0mL

A.3.2卵黃乳液

用硬刷清洗雞蛋2個~3個,瀝干,殺菌消毒表面,無菌打開,取出內容物,棄去蛋白,用無菌注射器

吸取蛋黃,放入無菌容器中,加等量無菌生理鹽水,充分混合調均,

4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3.3制法

將A.

3.1中成分溶于蒸餾水中,調節(jié)

pH

至7.

0±0.2,分裝錐形瓶,121℃高壓蒸汽滅菌