1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,一、課題目標(biāo)：通過嘗試對血液中血紅蛋白的 提取和分離，理解色譜法、電泳法 二、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法 三、課題難點：樣品的預(yù)處理、色譜柱填料的處理 和色譜柱的裝填,一、血紅蛋白的提取和分離,1、血液有哪些成分,每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,2、血紅蛋白的特點：,思考： “課題1-DNA的粗提取與鑒定” 實驗理想的材料是什么？ “課題3-血紅蛋白的提取和分離”這實驗理想的材料又是什么？原因是？,答：雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，哺乳類動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，

2、結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。,一、基礎(chǔ)知識： （一）蛋白質(zhì)分離原理 （二）蛋白質(zhì)分離的方法 1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法 2）電泳法 （三）緩沖液的作用,一、蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù) 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異： 1.分子的形狀、大小 2.電荷性質(zhì)和多少 3.溶解度 4.吸附性質(zhì) 5.對其他分子親和力,1.凝膠色譜法,一些微小多孔的球體 （內(nèi)含許多貫穿的通道，具多孔的凝膠就叫分子篩）,根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法,（2）概念：,（1）凝膠,洗脫： 從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。,4、具體過程,3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，（ ）的蛋白質(zhì)容易

3、進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動速度（ ），而（ ）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動，路程（ ），移動速度（ ），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。,相對分子質(zhì)量較小,較長,較慢,相對分子質(zhì)量較大,凝膠外部,較短,較快,總結(jié)：大分子經(jīng)過路程短，流動快； 小分子經(jīng)過路程長，流動慢。,凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動畫演示,2凝膠電泳法：,1）原理：,不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、分子形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。,2）影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素,電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的

4、過程,3）常用電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙酰胺凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 在測定蛋白質(zhì)分子量時通常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用時可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳做對照，根據(jù)兩者的電泳區(qū)帶位置，利用相關(guān)計算公式算出相對分子量 SDS 帶負(fù)電荷多的 ，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷的差別，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。,在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動,瓊脂糖凝膠電泳示意圖,影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素,由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿鹽溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,緩沖溶液洗脫劑 （1）作用： （2）配制

5、：,抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。,（3）在血紅蛋白的提取和分離實驗中用的緩沖液的原因？,目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境， 保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能。,二、實驗操作實驗步驟,血液組成成分,1、樣品 處理,3、純化,4、純度鑒定,2、粗分離,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度,凝膠色譜法進(jìn)行純化,注意事項,血液組成成分,閱讀思考： 血液由_和_兩部分組成。 血細(xì)胞中_細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是_。 該化合物是由 _和_構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的_基團(tuán)。,紅細(xì)胞,血紅蛋白,2條-肽鏈,2條-肽鏈,亞鐵血紅素,1.洗 滌 紅 細(xì)

6、 胞,閱讀思考：洗滌的目的是什么？ 洗滌次數(shù)不能太少？ 洗滌干凈的標(biāo)志是什么？,血液 100mL,紅細(xì)胞,血漿,紅細(xì)胞,重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色,除去雜質(zhì)蛋白,無法除去血漿蛋白,防止白細(xì)胞與紅細(xì)胞一起沉淀,2.釋放血紅蛋白,閱讀思考： 釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了 哪些物質(zhì)，有什么用？,目的分析： 蒸餾水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。,使紅細(xì)胞大量吸水脹裂,溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜,加速紅細(xì)胞的破裂,3.分離血紅蛋白,分離過程,紅細(xì)胞 混合液,燒杯,有機(jī)溶劑 血紅蛋白,分液漏斗,4.透析血紅蛋白,透析的目的是什么？,去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì),純化凝膠

7、色譜法,1.凝膠色譜柱的制作：,2.凝膠色譜柱的裝填：,教材圖519,3.樣品的加入和洗脫,注意： （1）凝膠顆粒蒸餾水 充分溶脹；凝膠裝填時盡量緊密； 裝填時不能有氣泡存在：因為氣 泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫 次序，降低分離效果。,（2）裝完后，立即用緩沖液洗滌， 使凝膠裝填緊密,3.樣品的加入和洗脫,1.調(diào)液面,2.加樣,4.洗脫,5.收集,注意：洗脫過程不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象， 否則重新填裝。,3.再調(diào)液面,1.調(diào)液面,2.加樣,3.再調(diào)液面,4.洗脫 、 5.收集,注意事項,1. 紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。 2. 凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法，還能

8、除去微生物和氣泡 3.色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密；無氣泡；洗脫液不能斷流。 4. 色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。,Why？,知識總結(jié),血紅蛋白的提取和分離,蛋白質(zhì)的 提取分離,樣品處理,粗 分 離,純 化,純度鑒定,1、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是 A、 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對 分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) B、 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對 分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) C、 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對 分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) D、 二者根本無法比較,練習(xí)鞏固,2.相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過程可表示為圖中哪一個,B,3.凝

9、膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是( ) A.改變蛋白質(zhì)分子通過凝膠時的路徑 B.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動速度 C.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中 D.與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動速度 4.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時，一定要加入緩沖液，其作用主要是( ) A.使酶的活性最高 B.使蛋白質(zhì)的活性最高 C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷 D.使蛋白質(zhì)帶上電荷,A,C,5、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率取決于 A 電荷的多少 B 分子的大小 C 肽鏈的多少 D 分子結(jié)構(gòu)的差異,6.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（ ） A可采集豬血作為實驗材料 B用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞 C血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時間離心 D洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液,A,8.在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是 A、氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫 次序，降低分離效果 B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運動 C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng) D、氣泡在裝填凝膠