1、實(shí)驗(yàn)九： 食品中維生素C的含量測(cè)定,一、目的要求 理解2,4二硝基苯肼比色法測(cè)定抗壞血酸總量的基本原理。學(xué)習(xí)其操作方法和了解影響測(cè)定準(zhǔn)確性的因素。 二、實(shí)驗(yàn)原理 總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂(lè)糖酸，樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2,4二硝基苯肼作用生成紅色脎，其呈色強(qiáng)度與總抗壞血酸含量呈正比，可進(jìn)行比色定量。,三、儀器與試劑,（一）試劑 1、4.5mol/L硫酸：量取250mL濃硫酸小心加入700mL水中，冷卻后用水稀釋至1000mL。 2、85%硫酸：小心加900mL濃硫酸于100mL水中。 3、2% 2,4二硝基苯肼：溶解2,4二硝基苯肼2g于100mL 4.

2、5mol/L硫酸中，過(guò)濾。不用時(shí)存于冰箱內(nèi)，每次使用前必須過(guò)濾。 4、2%草酸溶液。 5、1%草酸溶液。 6、1%硫脲溶液：溶解1g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 7、2%硫脲溶液：溶解2g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 8、1mol/L鹽酸：取100mL鹽酸，加入水中，并稀釋至1200mL。 9、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取100mg純抗壞血酸溶解于100mL 2%草酸溶液中，此溶液每毫升相當(dāng)于1mg抗壞血酸。 10、活性炭：將100g活性炭加到750mL 1mol/L鹽酸中，回流1h2h，過(guò)濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無(wú)鐵離子（Fe3+）為止，然后置于110烘箱中烘干。,（二）儀器 1、恒溫箱或

3、電熱恒溫水浴鍋。 2、可見(jiàn)光分光光度計(jì)。 3、搗碎機(jī)。,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1、樣品處理（全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)避光）。 （1）鮮樣的制備：稱取100g鮮樣即加入100mL 2%草酸溶液，倒入搗碎機(jī)中打成勻漿，稱取10.0g40.0g勻漿（含1mg2mg抗壞血酸）倒入100mL容量瓶，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。過(guò)濾，濾液備用。 （2）干樣制備：稱取1g 4g干樣（含1mg2mg抗壞血酸）放入乳缽內(nèi)，加入等量的1%草酸溶液磨成勻漿，連固形物一起倒入100mL容量瓶?jī)?nèi)，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。過(guò)濾備用。 2、樣品還原型抗壞血酸的氧化處理 量取25.0mL上述濾液，加入2g活性炭，振搖1min，過(guò)濾

4、，棄去最初數(shù)毫升濾液。吸取10.0mL此氧化提取液，加入10.0mL 2%硫脲溶液，混勻，此試樣為稀釋液。,3、呈色反應(yīng) （1）取3支試管，各加入4mL經(jīng)氧化處理的樣品稀釋液?；幸恢г嚬茏鳛榭瞻祝蚱溆鄡稍嚬芗尤?.0mL 2%2,4二硝基苯肼溶液，將所有試管放入370.5恒溫箱或恒溫水浴中，保溫3h。 （2）3h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠苋〕龊笫蛊淅涞绞覝兀缓蠹尤?%2,4二硝基苯肼溶液1.0mL，在室溫中放置10min15min，后放入冰水內(nèi)。其余步驟同試樣。 4、85%硫酸處理 當(dāng)試管放入冰水冷卻后，向每一試管（連同空白管）中加入85%硫酸5mL，滴加時(shí)間至少需

5、要1min，需邊加邊搖動(dòng)試管。將試管自冰水中取出，在室溫放置30min后比色。,5、樣品比色測(cè)定 用1cm比色皿，以空白液調(diào)零點(diǎn)，于500nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。 6、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 （1）加2g活性炭于50mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中，振動(dòng)1min后過(guò)濾。吸取10.00mL濾液放入500mL容量瓶中加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀釋至刻度?？箟难釢舛?0g/mL。 吸取5，10，20，25，40，50，60mL稀釋液，分別放放7個(gè)100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的深度分別為1，2，4，5，8，10，12g/mL，為抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液。 （2）分別吸取4mL各不同深度的抗壞血

6、酸標(biāo)準(zhǔn)使用液，于7個(gè)試管中，吸取4mL水于試劑空白管，各加入1.0mL 2%2,4二硝基苯肼溶液，混勻，將全部試管放入375恒溫箱或恒溫水浴中，保溫3h。 3h后將8個(gè)試管取出，全部放入冰水冷卻后，向每一試管中加入5mL 85%硫酸，滴加時(shí)間至少需要1min，邊加邊搖，。將試管自冰水取出，在室溫放置30min后，以試劑空白管調(diào)零，并比色測(cè)定。 以吸光值為縱坐標(biāo)，抗壞血酸含量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。,五、結(jié)果計(jì)算,式中X樣品中總抗壞血酸含量mg/100g； c由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得試樣測(cè)定液總抗壞血酸含量（mg）； m測(cè)定時(shí)所取濾液相當(dāng)于樣品的用量（g）。 計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。,六、考思考題,1、